楊寶燕，鄭敦錦，何康平，江文豪，沈銳鋒，呂詠鍶，羅幸林，羅佳偉，陳胤熹，鄭少鵬，郝錦亨，陳梓詩，曹詩林,3,4

（1.佛山科學技術(shù)學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528000）（2.暨南大學理工學院，廣東廣州 510632）

（3.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

（4.可持續(xù)生物化學與合成生物工程中心，佛山無遠生物科技有限公司，廣東佛山 528000）

近年來，蛋白質(zhì)-多糖相互作用的研究引起了人們的關注。多糖可以通過共價交聯(lián)[1]和非共價相互作用[2]包裹蛋白質(zhì)。多糖可作為蛋白質(zhì)和酶的載體，促進蛋白質(zhì)藥物治療[3]和提高酶的催化性能[4]。

殼聚糖是由D-glucosamine（D-氨基葡萄糖）為單位，以β-(1-4)連接組成的一種陽離子多糖，并廣泛應用于生物醫(yī)學和生物催化。但由于其結(jié)構(gòu)特點，傳統(tǒng)殼聚糖的溶解需要溶解在稀酸水溶液中，因此其進一步的應用受到限制。殼聚糖低聚物（OCTS）是由2~50個殘基組成，具有良好的水溶性。南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）是應用最廣泛的脂肪酶之一。CaLB具有很多特性，例如，有比較嚴格的底物選擇性、底物特異性，較寬的pH穩(wěn)定范圍等特點。該酶在生物合成[5]、生物柴油[6]、生物制藥[7]等領域具有廣闊的應用前景。游離脂肪酶不穩(wěn)定，易失活。研究表明殼聚糖和甲殼素類材料作為載體固定化酶可以提高酶的穩(wěn)定性和催化性能[8,9]。了解酶與殼聚糖的相互作用對設計高性能的酶-殼聚糖生物催化劑具有重要意義。目前，酶與殼聚糖衍生物相互作用的研究主要集中在實驗領域，仍然缺乏在原子水平上的相互作用機制研究。分子動力學模擬是以經(jīng)典力學、量子學為基礎，利用計算機得到分子軌跡的過程，并分析其結(jié)構(gòu)性質(zhì)，簡單來說，分子動力學模擬是將肉眼能見宏觀上的生物大分子變成動態(tài)，由此我們可以觀察到分子在不同時間分子里的變化過程，同時能夠提供生物大分子動態(tài)變化的數(shù)據(jù)。分子動力學模擬是研究分子間相互作用的有效方法。然而，對殼聚糖與蛋白質(zhì)相互作用的分子動力學模擬，特別是對殼聚糖與酶相互作用的分子動力學模擬研究較少。

本文通過分子模擬研究了南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）與殼聚糖低聚物（OCTS）裝配體的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象，考察CaLB與OCTS之間的相互作用對脂肪酶結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律。CaLB-OCTS與底物分子（4-硝基笨對棕櫚酸酯）進行分子對接分析，根據(jù)酶與底物的反應機理結(jié)合形成酶-底物復合物，對該復合物進行構(gòu)象評分，獲得構(gòu)象較合理的對接模型，分析比較合理的對接結(jié)果中酶蛋白與底物相互作用力，從而更加深入地了解酶蛋白與催化底物的結(jié)合方式。本文所建立的模擬方法，不僅可以用于酶與殼聚糖衍生物的相互作用研究，也可為蛋白質(zhì)-多糖相互作用研究提供更多的借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)

南極假絲酵母脂肪酶：來源于Protein Date Bank數(shù)據(jù)庫（ID：1TCA），殼寡糖、4-硝基對棕櫚酸酯：通過作圖軟件獲得。

1.1.2 分子動力學模擬工具以及分析工具

Gromacs 4.5.3[10,11]、Pymol（三維結(jié)構(gòu)顯示軟件）、Autodock-Vina[12]（酶分子與底物分子進行分子對接）、蛋白質(zhì)配體相互作用分析器（Protein-ligand Interaction Profiler，PLIP）[13]。其中AutodockVina與PLIP模塊經(jīng)本課題組二次開發(fā)，分別部署在https://atomevo.com/autodock-vina與https://atomevo.com/plip[18]。以上兩個模塊均免費開放給公眾使用。

1.2 試驗設計

南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica Lipase B，CaLB）的FASTA序列來源于蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB代碼：1TCA）。

使用Gromacs 4.5.3軟件包進行分子動力學模擬[10,11]。在分子動力學模擬過程中，將1TCA置于一個立方體盒的中心，其中1TCA與OCTS距離盒邊緣1 nm。體系中含有1個1TCA脂肪酶分子和一定數(shù)量的OCTS。首先，將整個系統(tǒng)在303.15 K下進行50000步的能量最小化（EM）。然后，通過位置約束的MD模擬，通過NVT系綜（粒子數(shù)量、體積和溫度恒定），再通過NPT系綜（粒子數(shù)量、壓力和溫度恒定）來平衡溶劑和蛋白脂肪酶分子周圍的離子。經(jīng)過平衡后，在303.15 K下進行40 ns的分子動力學模擬，模擬后輸出數(shù)據(jù)進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 南極假絲酵母脂肪酶（CaLB）與低聚殼聚糖組裝（OCTS）分析

勢能分析：分析了0~40 ns模擬中CaLB與OCTS之間的庫侖相互作用和L-J相互作用。氫鍵分析：對0~40 ns范圍內(nèi)的CaLB-溶劑對和CaLB-OCTS對進行氫鍵數(shù)分析，并分別計算了CaLB-溶劑對和CaLBOCTS組裝體在前0.10 ns和后0.10 ns的平均氫鍵數(shù)。溶劑可達面積（SASA）分析：計算0~40 ns時CaLB和CaLB-OCTS的疏水性、親水性和總?cè)軇┛蛇_面積。CaLB與14個OCTS分子質(zhì)心（COM）的平均距離分析:首先計算各OCTS分子質(zhì)心與CaLB在0~40 ns模擬時間內(nèi)的距離，然后計算平均值。

1.3.2 南極假絲酵母脂肪酶總體構(gòu)象變化

均方根波動（RMSF）分析：對CaLB和CaLB-OCTS的每個殘基對計算平均RMSF。均方根（Root-mean-square deviation，RMSD）分析：計算部分區(qū)域的RMSD，包括helix區(qū)域（Lys13-Gly19），（Val139-Leu147），（Gly226-Arg242），loop區(qū)域（Gly95-Pro100），（Gly217-Ala225）。用Pymol軟件計算了CaLB和CaLB-OCTS的二級結(jié)構(gòu)。然后分別計算游離CaLB和CaLB-OCTS中α-helix、Sheet和loop的數(shù)量。

1.3.3 CaLB和OCTS之間接觸位點分析

用Pymol法計算并鑒定了與OCTS結(jié)合的CaLB的氨基酸組成和殘基數(shù)。

1.3.4 CaLB活性位點OCTS分析

活性中心入口開放狀態(tài)分析：0~40 ns計算片段質(zhì)心（Val139-Leu147）與片段質(zhì)心（Leu277-Gly288）之間的距離?；钚钥诖Y(jié)構(gòu)分析：分別測定Ser105殘基與中結(jié)合口袋（Gly39、Thr42、Ser47、Trp104、Ala225）、大結(jié)合口袋（Ala141、Leu144、Val154、Ile285、Pro289、Lys290）和?；Y(jié)合口袋（Asp134、Thr138、Gln157、Ile189、Val190）之間的距離。并在此基礎上，研究了游離CaLB和CaLB-OCTS口袋結(jié)構(gòu)的差異。

1.3.5 CaLB與底物4-硝基笨對棕櫚酸酯分子對接分析

通過閱讀文獻找出脂肪酶的活性中心以及活性口袋，用Pymol軟件打開經(jīng)過40 ns模擬的CaLB-OCTS的PDB，并建立活性中心盒子，記錄盒子參數(shù)。用ChemBraw繪出脂肪酶催化反應底物4-硝基笨對棕櫚酸酯，進行能量最小化后以PDB文件輸出，運用Pymol軟件對其進行加氫等操作。將CaLB的PDB文件、4-硝基笨對棕櫚酸酯PDB文件以盒子參數(shù)上傳至Autodock-Vina，以CaLB為受體，底物為配體進行分子對接，結(jié)合能小于0表示受體和配體能自由結(jié)合，分析結(jié)果顯示結(jié)合能越小則表示對接得越好。將對接后模型進行XScore評分，評分顯示的結(jié)果越高表示對接越好。隨后，將對接后評分較好的受體-配體模型以PDB文件輸出并上傳至PLIP，進行對接結(jié)果作用力（氫鍵作用力、疏水作用力）的分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析與作圖

以上所得數(shù)據(jù)使用WPS進行歸納匯總與分析，并使用python的matplotlib模塊，編寫畫圖腳本將所得數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 CaLB和OCTS自組裝過程分析

2.1.1 L-J勢能和庫倫勢能分析

圖1 展示了CaLB與OCTS之間庫侖相互作用和L-J相互作用的能量變化。如圖1所示，模擬過程的庫侖勢能和L-J勢能均顯著降低，在4 ns模擬時達到-1200 kJ/mol左右。隨后，這兩種能量繼續(xù)下降，但庫侖相互作用下降趨勢更加明顯，在12 ns左右達到-2100 kJ/mol左右，而在6 ns左右，L-J勢能下降到-1400 kJ/mol左右。在6~40 ns時，L-J勢能在-1230~-1800 kJ/mol之間變化，而在12~40 ns時，靜電勢能在-2200~-2820 kJ/mol之間。在40 ns模擬過程中，L-J勢能和庫侖勢能分別降低了約1480 kJ/mol和2324.0 kJ/mol。這些結(jié)果表明，CaLB和OCTS之間的靜電和L-J相互作用在自組裝過程的初始階段（0~4 ns）起著重要的作用。隨著OCTS接近CaLB，靜電相互作用增強，并成為組裝的關鍵驅(qū)動力。

圖1 模擬過程中脂肪酶和OCTS相互作用的能量分析Fig.1 Energy analysis of the interaction between lipase and OCTS during simulation

2.1.2 氫鍵分析

如圖2a所示，分析40 ns模擬過程中的氫鍵數(shù)。在前0.10 ns脂肪酶蛋白與溶液的初始氫鍵數(shù)約為368。隨后，氫鍵數(shù)在模擬過程中逐漸減少，在模擬結(jié)束時（后0.10 ns），脂肪酶蛋白與溶液的氫鍵數(shù)約為335。此外，在模擬期間，脂肪酶蛋白和OCTS之間的平均氫鍵數(shù)從0增加到約17。這些結(jié)果表明OCTS可以與脂肪酶形成氫鍵并取代脂肪酶和溶劑之間的部分氫鍵。這有助于增加脂肪酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖2 模擬過程中氫鍵分析（圖a）、脂肪酶和OCTS在40 ns模擬過程中的溶劑可及面積分析（圖b，c）Fig.2 Hydrogen bond analysis during simulation (a), the solvent accessible surface (SASA) analysis of CaLB and OCTS during 40 ns simulation (b, c)

2.1.3 CaLB和OCTS溶劑可及面積及質(zhì)心距離的分析

圖2 b、c顯示了脂肪酶和OCTS的溶劑可及面積（SASA）分析。結(jié)果表明，在0~4 ns時，脂肪酶和OCTS的SASA均顯著下降。脂肪酶的SASA從約130 nm2減少到約110 nm2，而OCTS的SASA從115 nm2減少到95 nm2。在4~40 ns期間，脂肪酶和OCTS的SASA分別在110~100 nm2和100~90 nm2之間變化。該結(jié)果同樣表明，在0~4 ns時，OCTS與脂肪酶相互靠近，因此SASA同步下降并降幅較大，而4~40 ns時，脂肪酶和OCTS主要進行自組裝過程的結(jié)構(gòu)調(diào)整和平衡。

為了進一步闡明這種觀點，本研究對模擬時間內(nèi)脂肪酶和OCTS分子的質(zhì)心（COM）的平均距離進行了進一步分析（圖3）。該分析結(jié)果表明，在0~4 ns期間，COM的平均距離顯著下降了0.50 nm。隨后，在隨后的12~40 ns期間，COM的平均距離在2.70和3.10 nm之間波動，以進行結(jié)構(gòu)重新調(diào)整。

圖3 脂肪酶和OCTS質(zhì)心之間的平均距離Fig.3 The average distance between the COM of CaLB and OCTS

酶與多寡糖之間存在非共價相互作用，包括靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵相互作用等。結(jié)果表明，裝配過程可以描述為：OCTS與CaLB之間的距離越來越近，因此CaLB和OCTS之間的可及面積明顯降低以及CaLB-OCTS之間的平均COM顯著降低。除此之外，CaLB與OCTS之間的氫鍵數(shù)量隨著CaLB與溶劑之間氫鍵數(shù)量的減少而增加。在這個自組裝過程的初始階段，CaLB和OCTS之間的靜電和L-J相互作用起著重要的作用。隨后，靜電相互作用成為主導。以往的文獻表明，當?shù)鞍踪|(zhì)與帶電荷的多糖類相互作用時，靜電作用占優(yōu)勢[14]。自組裝后，可以觀察到CaLB和OCTS組裝的結(jié)構(gòu)調(diào)整過程。

2.2 CaLB與OCTS組裝體的整體構(gòu)象

2.2.1 均方根偏差和原子波動分析

均方根偏差（RMSD）分析可以揭示OCTS對脂肪酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。CaLB-OCTS的RMSD的平均值約為0.22 nm，脂肪酶的RMSD的平均值約為0.18 nm。該結(jié)果表明，在模擬期間內(nèi)，OCTS存在下脂肪酶的RMSD無明顯變化，脂肪酶與OCTS相互作用后保持其原始構(gòu)象。

為了考察OCTS對CaLB柔韌性的影響，圖4對比分析了游離CaLB和CaLB-OCTS的均方根波動（RMSF）分析。一般來說，殘基的RMSF在CaLB和CaLB-OCTS組裝體中表現(xiàn)出相同的趨勢。在有OCTS存在的情況下，helix（α-螺旋）區(qū)域（Lys13-Gly19）的波動更大，說明該區(qū)域在CaLB-OCTS組裝體中比游離CaLB具有更大的柔韌性。此外，CaLB-OCTS組裝體的loop（無規(guī)卷曲）區(qū)域（Gly95-Pro100）和（Gly217-Ala225）以及helix區(qū)域（Val139-Leu147）和（Gly226-Arg242）比游離CaLB的波動更小。

圖4 脂肪酶和CaLB-OCTS的原子波動值（RMSF）Fig.4 RMSF analysis of the CaLB and CaLB-OCTS

研究表明，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)的柔韌性呈負相關[15]。表1分析了上述區(qū)間的RMSD。結(jié)果顯示CaLB-OCTS組裝體酶中α1區(qū)域的平均RMSD為約0.17 nm，而游離CaLB的該數(shù)據(jù)為0.12 nm。這表明CaLB-OCTS組裝體酶中α1（13-19）的RMSD值的增加歸因于RMSF值的增加。此外，CaLB-OCTS組裝體酶的loop（95-100）、loop（217-225）、α5（139-147）、α9（226-242）區(qū)域的RMSD值都低于游離脂肪酶模擬體系。這表明這些區(qū)域RMSF值的降低導致了CaLB-OCTS組裝體酶種這些結(jié)構(gòu)區(qū)域的RMSD值的降低。

表1 脂肪酶在α1、α5、α9、loop95-100、loop217-225區(qū)域的均方根偏差（RMSD）分析Table 1 The RMSD data of the helix region α1, α5, α9, and loop region (Gly95-Pro100), (Gly217-Ala225)

2.2.2 CaLB-OCTS和游離脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)分析

進行游離CaLB和CaLB-OCTS的二級結(jié)構(gòu)含量分析。如圖5所示，脂肪酶與OCTS組裝后，CaLB-OCTS的α-螺旋含量從41.00%略微上升至41.32%，而β-折疊含量從9.78%增加至12.62%，無規(guī)卷曲loop從49.21%下降至46.50%。對β-折疊的進一步分析表明，脂肪酶中的β-折疊Leu20-Cys22在CaLB-OCTS結(jié)構(gòu)中延長至Leu20-Gln23，同時β-折疊Pro33-Pro38延長至β-折疊Lys32-Pro38（圖6）。此外，CaLB-OCTS出現(xiàn)了兩個新的β-折疊結(jié)構(gòu)，分別為β-折疊（Gly307-Thr310）和β-折疊（Gly313-Val315）（圖7），而根據(jù)pymol軟件的分析，游離CaLB在這些結(jié)構(gòu)區(qū)域中未發(fā)現(xiàn)β-折疊結(jié)構(gòu)。

圖5 CaLB-OCTS組裝體和游離CaLB的二級結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Secondary structure analysis of the CaLB-OCTS and CaLB

圖6 CaLB-OCTS（b）和游離CaLB（a）中β-折疊（Leu20-Cys22，Pro33-Pro38）二級結(jié)構(gòu)變化Fig.6 Secondary structure change of the Sheet (Leu20-Cys22,Pro33-Pro38) in CaLB-OCTS (b) and CaLB (a)

圖7 CaLB-OCTS（b）和游離CaLB（a）中β-折疊（Gly313-Val315，Gly307-Thr310）二級結(jié)構(gòu)的變化Fig.7 Secondary structure change of the (Gly313-Val315,Gly307-Thr310) in CaLB-OCTS (b) and CaLB (a)

該結(jié)果表明CaLB和OCTS之間的相互作用促進了無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化。這個結(jié)果與之前的實驗研究是一致的[16]。這些研究表明，蛋白質(zhì)與殼聚糖/殼聚糖衍生物之間的相互作用改變了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，尤其是環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

2.3 CaLB與OCTS接觸位點分析

CaLB的FASTA序列表明，在脂肪酶表面存在許多酸性氨基酸殘基，包括帶負電荷的4個谷氨酸殘基（Glu81、Glu188、Glu269、Glu294）以及14個天冬氨酸殘基（Asp6、Asp17、Asp49、Asp74、Asp126、Asp134、Asp145、Asp187、Asp200、Asp223、Asp252、Asp257、Asp265、Asp296）。由于OCTS帶有正電荷，因此，脂肪酶和OCTS之間存在靜電相互作用。分子模擬40 ns后，14個OCTS分子與CaLB組裝。如圖8a所示，分析了CaLB與OCTS發(fā)生接觸的氨基酸殘基。有7個Asp殘基和2個Glu殘基分別附著在8個OCTS分子上，這些氨基酸殘基與OCTS電荷相反。該殘基分別為Asp17、Asp134、Asp145、Asp187、Asp252、Asp257、Asp265、Glu269、Glu188。在本文中，CaLB和OCTS分別帶1個負電荷和5個正電荷。因此，CaLB-OCTS組裝體為69個帶正電的凈電荷。由此，CaLB-OCTS組裝體可能在溶液中是可溶的復合物。

圖8 CaLB中與OCTS發(fā)生接觸的殘基數(shù)目（a）、OCTS與14個CaLB組裝體示意圖（b）Fig.8 The number of the residues attached with OCTS (a), The scheme of the CaLB assembled with 14 OCTS (b)

2.4 OCTS對CaLB活性位點可及性的影響

脂肪酶的底物可及性可以通過Val139-Leu147和Leu277-Gly288（圖9）兩組螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化來表征。因此計算了Val139-Leu147的質(zhì)心與Leu277-Gly288質(zhì)心的距離（COMAccess）。研究表明，活性位點入口可以定義為COMAccess<1.5 nm的封閉狀態(tài)，中間狀態(tài)和開放狀態(tài)分別為1.52.0 nm[17]。在40 ns的模擬時間內(nèi)，CalB-OCTS組裝體和游離CaLB的COMAccess分別在1.5~2.1和1.5~2.4 nm之間變化（圖10），說明在模擬時間內(nèi)可以觀察到活性部位入口的開放狀態(tài)。

圖9 脂肪酶的活性位點入口示意圖Fig.9 The scheme of active site entrance of CaLB

圖10 CaLB-OCTS組裝體與游離脂肪酶活性位點入口的質(zhì)心距離Fig.10 Distance between the COM of CalB-OCTS and CalB

為了表征底物結(jié)合口袋的構(gòu)象變化，計算絲氨酸Ser105殘基與下面的口袋之間的距離，如圖11顯示，大尺寸醇（圖11a）結(jié)合口袋（含有Ala141、Leu144、Val154、Ile285、Pro289、Lys290）；中尺寸醇（圖11b）結(jié)合口袋（含有Gly39、Thr42、Ser47、Trp104、Ala225）；?；▓D11c）結(jié)合口袋（由Asp134、Thr138、Gln157、Ile189、Val190組成）。對比CaLB-OCTS和游離CaLB的底物口袋表明，兩者的底物口袋的距離差值均低于0.31 nm，表明底物結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)基本保持一致。

圖11 Ser105殘基與結(jié)合口袋的距離Fig.11 Distance between the C-a atom of the catalystic site Ser105 and the binding pocket

2.5 CaLB與底物4-硝基笨對棕櫚酸酯分子對接

2.5.1 CaLB-OCTS與底物（4-硝基笨對棕櫚酸酯）對接以及評分（XScore）

圖12 底物與脂肪酶對接后的模型Fig.12 A model of substrate docking with lipase

將文中經(jīng)0~40 ns模擬后CaLB-OCTS組裝體進行加氫等處理，然后將底物對接到CaLB的活性部位，表2顯示的是其對接結(jié)果，對接軟件自動對接出9種配體-受體復合物對接結(jié)果，并分別對這9中復合物進行XScore評分，評分是對對接的配體-受體的復合物的構(gòu)象或其匹配程度進行評價，以判斷對接結(jié)果的合理性，表3為評分結(jié)果。結(jié)果表明配體（4-硝基笨對棕櫚酸酯）與脂肪酶分子形成穩(wěn)定的復合物，它們的結(jié)合能均為負值，符合理論情況，且并具有良好的結(jié)合親和性，其中最穩(wěn)定的復合物的結(jié)合能為-6.1 kcal/mol。在XScore評分中，評分最高的是Mode 5的底物-酶蛋白復合物，如圖5，結(jié)合能為-5.1 kcal/mol，該復合物的VDW即范德華相互作用能為699.3，HB即配體與蛋白的氫鍵相互作用為1.7，最終評分為5.89，表示了該底物-酶蛋白的構(gòu)象具有合理性以及可靠性。為分析底物-酶蛋白復合物之間的相互作用力，故將Mode 5復合物進行PLIP作用力分析。

表2 Vina對接結(jié)果Table 2 Docking results

表3 XScore評分結(jié)果Table 3 XScore results

2.5.2 CaLB與底物對接后的作用力分析（PLIP）

表4 是模擬后的CaLB-OCTS蛋白酶與底物對接后評分最高的底物-酶復合物的相互作用力分析，查閱文獻可知，CaLB的催化活性中心是由一個三聯(lián)體（由Ser105、Asp187和His224構(gòu)成）、一個氧負離子洞（Thr40和Gln106）以及活性口袋（醇結(jié)合口袋（含有Gly39、Thr42、Ser47、Trp104、Ala225、Ala141、Leu144、Val154、Ile285、Pro289、Lys290）；?；Y(jié)合口袋（由Asp134、Thr138、Gln157、Ile189、Val190組成）構(gòu)成，結(jié)果顯示，底物對接進入CaLB活性口袋，其中殘基Trp104、Asp134、Ala141、Ile189、Val190、Ala281、Ile285與底物分子存在著疏水作用，殘基Thr40作為氫鍵供體與底物分子的氧原子形成氫鍵相互作用。此外，活性中心殘基His224與底物之間直接形成鹽橋和π-陽離子效應。由此表明，底物4-硝基笨對棕櫚酸酯分子可在CaLB的催化活性位點處結(jié)合，彼此在結(jié)合過程中所產(chǎn)生的疏水作用是維持底物-酶分子復合物構(gòu)象穩(wěn)定性的要作用力。

表4 疏水效應、鹽橋、π-陽離子相互作用Table 4 Hydrophobic Interactions, Salt Bridges, pi-Cation Interactions

2.5.3 討論

目前，殼聚糖、甲殼素及其衍生物與蛋白間的相互作用的分子動力學模擬研究相對較少。仍有待進一步拓展。

Safoura Salar通過分子動力學模擬手段研究了離子交聯(lián)法制備的殼聚糖納米顆粒與胰蛋白酶（trypsin）的相互作用，由于其僅僅研究了相互作用后的RMSD、Rg以及二級結(jié)構(gòu)組成，得到的結(jié)構(gòu)信息相對有限，建模過程并不清晰。該研究表明，相互作用后，trypsin的天然結(jié)構(gòu)并未有明顯改變[18]。

Mohammad Yahyaei對比研究了殼聚糖與甲殼素與促卵泡激素蛋白（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）的相互作用。該研究以長度為10單元的甲殼素或者殼聚糖寡糖鏈作為長鏈甲殼素或殼聚糖的模型來進行研究。通過RMSD、RDF（徑向分布函數(shù)分析）、RMSF分析與相互作用能分析表明，糖類與蛋白間的相互作用對蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有所提升，但該提升的機制仍有待進一步研究[15]。

相比之下，本文從蛋白骨架結(jié)構(gòu)分析、相互作用能量分析、活性中心分析、原子波動分析出發(fā)，并進一步通過分子對接等手段，分析并提出了，相互作用對酶催化性能及穩(wěn)定性的影響機制：當OCTS與CaLB之間的距離越來越近時，CaLB和OCTS之間的可及面積明顯降低以及CaLB-OCTS之間的平均COM顯著降低。除此之外，CaLB與OCTS之間的氫鍵數(shù)量隨著CaLB與溶劑之間氫鍵數(shù)量的減少而增加。在這個自組裝過程的初始階段，CaLB和OCTS之間的靜電和L-J相互作用起著重要的作用。隨后，靜電相互作用成為主導。相互作用主要由靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵相互作用等構(gòu)成，所形成的組裝體將蛋白封裝在寡糖保護層之中，該保護層在一定程度上替代了水分子與蛋白之間的相互作用，使得蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究采用分子動力學模擬方法研究南極假絲酵母脂肪酶B與低聚殼聚糖的相互作用和組裝。勢能分析表明，CaLB與OCTS之間的靜電和L-J相互作用在自組裝過程的初始階段起著重要的作用。靜電相互作用增強，成為下一階段的關鍵驅(qū)動力。在模擬過程中，14個OCTS分子與1個CaLB分子組裝形成CaLB-OCTS組裝體。證實了CaLB與OCTS之間的靜電相互作用和氫鍵相互作用。且OCTS可以與CaLB形成氫鍵，取代了部分CaLB與溶劑之間的氫鍵。二級結(jié)構(gòu)表明，CaLB-OCTS與游離酶（CaLB）對照相比，CaLB-OCTS組裝體具有更高的sheet含量（12.62%vs 9.78%）和更低的loop含量（46.50% vs 49.20%）。此外，CaLB-OCTS組裝體保留了其固有的主干以及活性位點口袋的構(gòu)象。將模擬后的CaLB-OCTS酶分子與4-硝基笨對棕櫚酸酯進行分子對接，在分子水平上揭示了酶與底物的相互作用。驗證了底物4-硝基笨對棕櫚酸酯分子可結(jié)合于CaLB的活性位點，疏水作用在維持酶蛋白-底物復合物發(fā)揮著極為重要的作用。總的來說，低聚殼聚糖具有穩(wěn)定南極假絲酵母脂肪酶結(jié)構(gòu)的潛力。由于低聚殼聚糖可在CaLB-OCTS組裝體表面提供豐富的氨基和羥基，這種蛋白-低聚殼聚糖組裝體在設計和制備相對高性能的固定化酶方面具有很大的潛力。