李樹根，劉坤東，王浩楠，姚曉玲，蘇寧

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）

失眠，又稱睡眠障礙（Sleep disorder，SD），是以頻繁而持續(xù)的入睡困難或睡眠維持困難并導(dǎo)致睡眠滿意度不足為特征的睡眠障礙。失眠表現(xiàn)為入睡困難、睡眠維持障礙、早醒、睡眠質(zhì)量下降和總唾眠時間減少，并伴有日間功能障礙，是當(dāng)代社會的一個公共健康問題，病程較長且較難治愈，嚴(yán)重者還可誘發(fā)和加重心腦血管疾病，而且常與精神健康問題密切相關(guān)，失眠影響了全球約30%~40%的人群[1]。

2017年中國睡眠研究會制定“中國失眠癥診斷和治療指南”，提出心理治療是失眠治療首選，藥物治療應(yīng)在心理治療的前提進(jìn)行。長期藥物治療具有依賴性、副作用等問題，心理治療在國內(nèi)普遍率不高。中醫(yī)藥在治療失眠上積累了豐富經(jīng)驗，而且中藥具有不良反應(yīng)小、無藥物依賴性等優(yōu)勢。沉香為瑞香科植物白木香含有樹脂的木材，作為中藥，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的作用[2]?，F(xiàn)代藥理研究提示沉香含鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)作用的成分：沉香揮發(fā)油通過蒸汽吸入對小鼠給藥，結(jié)果顯示具有抗焦慮作用[3,4]；沉香氣體吸入給藥對失眠小鼠具有一定質(zhì)量作用，能改善睡眠[5]；王帥等[6]通過實驗發(fā)現(xiàn)沉香揮發(fā)油、醇提物具有鎮(zhèn)靜催眠作用；雷莉等[7]通過沉香熏香的療法治療120例失眠障礙患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉香熏香能顯著改善患者睡眠質(zhì)量、減輕失眠的嚴(yán)重程度。以沉香為原料制作的沉香茶，是新一代純天然綠色健康飲品，有學(xué)者以沉香為主原料制備具有安神、溫中、暖腎、納氣等功效的沉香茶[8]。上述研究均提示沉香具有鎮(zhèn)靜催眠的作用，但缺乏作用機(jī)制的研究。本文以沉香提取物為研究對象，觀察沉香提取物對PCPA致失眠大鼠腦鎮(zhèn)靜催眠的作用，并探討其治療失眠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

研究動物：SPF級SD大鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量180~220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：00202800，許可證號：SCXK(粵)2013-0034。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境（SPF級），室溫23~25 ℃，濕度55%~60%，12 h晝夜交替，實驗單位使用許可證編號：SYXK(粵)2018-0085。本文研究所做實驗均獲得倫理委員會批準(zhǔn)。

主要試劑：對氯苯丙氨酸（PCPA，批號：L1727016），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大鼠5-HT、DA、NE、GABA、Glu酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（批號：Oct 2018），上海江萊生物科技有限公司；Maker I DNA Ladder（批號：M1100）、瓊脂糖（批號：A8201），北京索萊寶科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：11119ES60）、PCR預(yù)混合溶液2×HieffTM PCR Master Mix（批號：10102ES03），上海翊圣生物公司；TAE（批號：680959191），biosharp公司；伊紅染色液（批號：No.20180920），北京索萊寶科技有限公司；蘇木素染色液（批號：No.20181025），北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

主要儀器：揮發(fā)油采集器、循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-1001N，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CA-1115A冷去水循環(huán)裝置，上海愛郎儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，廣州貝立思儀器有限公司；Heal Force低溫高速離心機(jī)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；iMark酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；自制霧化吸入箱；超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；OLYMPUS顯微鏡，日本奧林巴斯公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；PCR儀器T100 Thermal Cycler，美國BIO-RAD公司；電泳系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 沉香提取物溶液制備

沉香由廣東寶盛沉香制品有限公司提供，經(jīng)廣東寶盛沉香制品有限公司鑒定為正品。沉香揮發(fā)油：取沉香藥材，適當(dāng)粉碎，過3號篩，準(zhǔn)確稱取50 g粉末于1000 mL圓底燒瓶中，加入500 mL蒸餾水，利用揮發(fā)油采集器提取，待煮沸后調(diào)至微沸狀態(tài)煎煮6~8 h，關(guān)閉電源，待溫度降至室溫時收集揮發(fā)油，4 ℃儲存?zhèn)溆?。沉香醇提物：取沉香藥材，適當(dāng)粉碎，過3號篩，準(zhǔn)確稱取50 g，加入500 mL 95%乙醇，室溫浸泡48 h后，過濾，收集濾液，濾液減壓濃縮后用適量95%乙醇復(fù)溶，均勻傾倒于表面皿中，置于-80 ℃冰箱過夜，次日取出于凍干機(jī)中凍干過夜。24 h后收集凍干粉末，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。沉香水提物：取沉香藥材，適當(dāng)粉碎，過3號篩，準(zhǔn)確稱取50 g，加入500 mL蒸餾水煎煮6~8 h提取，煮完后過濾，所得濾液濃縮至50 mL，即為1 g/mL的沉香水提物，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 建模及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，腹腔注射PCPA混懸液（350 mg/kg），1次/d，連續(xù)2 d。于第一次腹腔注射36 h后，大鼠失去正常晝夜節(jié)律，白天夜間皆活動不停，表示模型復(fù)制成功。

將90只實驗大鼠按雌雄分別進(jìn)行編號1~45，然后分別稱重，記錄好體重數(shù)據(jù)，并將體重數(shù)據(jù)的結(jié)果按編號輸入EXCEL表格，按體重從小到大重新排序，運用公式RAND進(jìn)行隨機(jī)分組，隨機(jī)分成空白組10只、模型組10只、沉香揮發(fā)油高劑量組10只、沉香揮發(fā)油低劑量組10只、沉香醇提物高劑量組10只，沉香醇提物低劑量組10只，沉香水提物高劑量組10只，沉香水提物低劑量組10只，地西泮組10只，以上分組均是雌雄各半。空白組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，每天1次。沉香醇提物低劑量組（0.5 g/kg，按生藥量計）、沉香醇提物高劑量組（2 g/kg，按生藥量計）、沉香水提物低劑量組（0.5 g/kg，按生藥量計）、沉香水提物高劑量組（2 g/kg，按生藥量計）、地西泮組（2 mg/kg）根據(jù)相應(yīng)濃度灌胃等體積灌胃，每天1次。沉香揮發(fā)油低劑量組（50 μL）、沉香揮發(fā)油低劑量組（100 μL）采用超聲霧化吸入給藥，將大鼠置于自制霧化吸入箱內(nèi)，預(yù)先將霧氣充滿，在將大鼠置于箱內(nèi)，持續(xù)霧化1 h，每天1次。各組根據(jù)相應(yīng)給藥方式連續(xù)給藥6 d。

1.3.3 樣品采集及處理

大鼠末次給藥4 h后，給予過量戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠，迅速取出大腦，冰生理鹽水洗凈血液，冰盤迅速分離下丘腦，取一部分下丘腦組織，用預(yù)冷的PBS沖洗組織，去除組織殘留血液，稱重而后將組織用剪刀剪碎，將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS加入玻璃勻漿器中（相應(yīng)體積是根據(jù)1:9的重量體積比，即1 g的下丘腦組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS），然后冰上充分研磨，最后將勻漿液置于低溫離心機(jī)進(jìn)行離心，設(shè)置參數(shù)為5000×g的離心力，離心10 min，離心后取上清液置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取部分下丘腦組織投入到4%多聚甲醛液進(jìn)行固定，備用用于HE染色。取一部分下丘腦組織置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 5-HT、DA、NE、GABA、Glu含量檢測

取已制備好的上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測5-HT、DA、NE、GABA、Glu含量，根據(jù)試劑盒說明書步驟操作。

1.3.5 GABAARα1、GABAARγ2和5-HT1A受體mRNA表達(dá)水平檢測

取出下丘腦組織，運用RT-PCR法檢測GABAARα1、GABAARγ2和5-HT1A受體mRNA表達(dá)情況。操作方法：（1）設(shè)計引物：根據(jù)GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A、β-actin核苷酸序列設(shè)計引物，由廣州擎科生物科技有限公司合成。β-actin：F：ATATCGCTGCGCTGGTCGTC，R：AGGATGGCGTG AGGGAGAGC。GABAARα1：F：5'-AGACAAAACCA CCAGAACCC-3'，R：5'-TTGACGAATAAAAACATA AGCAC-3'；GABAARγ2：F：5'-CGTGGTTTGCTTACT CCCTA-3'，R：5'-TCCGACAATCCAATACTTTT-3；5-HT1A：F：5'-AAGGTGGAAAAGAAGGGAGC-3'，R：5'-AATAACTGGGTTGAGCAGGG-3'。（2）提取下丘腦總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行PCR實驗，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃~60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30~60 s/kb，由變性、退火、延伸經(jīng)過35循環(huán)，最后72 ℃終延伸10 min。（3）電泳：取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（4）定量分析：運用凝膠成像系統(tǒng)對所拍攝的照片進(jìn)行密度掃描，以GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A對β-actin的光密度值的比值表示相應(yīng)的相對量。

1.3.6 HE染色

取出已用4%多聚甲醛固定好的下丘腦組織，按以下步驟進(jìn)行：（1）脫水透明。使用全自動脫水機(jī)進(jìn)行組織脫水。設(shè)定程序要求：讓組織按從低濃度到高濃度酒精的順序進(jìn)行梯度脫水，酒精濃度一般為75%、85%、95%、100%無水乙醇；浸泡時間：95%的酒精浸泡兩次，浸泡第二次時間約12 h，其余浸泡時間約2 h。將脫水后的組織放入酒精和二甲苯溶液中浸泡，浸泡時間大約30 min。（2）浸蠟：將保溫箱溫度調(diào)到56 ℃，將組織置于已經(jīng)融化的石蠟中，在放入溶蠟箱中保溫，浸蠟40 min。（3）包埋：使用鑷子將下丘腦組織塊置于入包埋盒中，浸上石蠟，而后迅速轉(zhuǎn)移至冷凍臺上，使蠟塊冷凍后，最后取出蠟塊組織。（4）蠟塊切片：使用切片機(jī)，將切片厚度調(diào)到3 μm，同時調(diào)節(jié)刀片角度(約5 °)，切出完整切片后，平攤于40 ℃溫水的恒溫水箱中。平攤約5~10 min，然后用載玻片輕輕撈起，置于攤平器上，最后放入恒溫箱中60 ℃烘干過夜。（5）脫蠟、HE染色：這個過程使用全自動染色機(jī)，調(diào)節(jié)程序按以下參數(shù)進(jìn)行設(shè)置：切片浸入二甲苯脫蠟30 min，而后行梯度乙醇，從高濃度到低濃度100%、95%、85%、75%，接著予水沖洗5 min，然后浸潤蘇木精30 min，水沖洗10 min，浸伊紅5 s，再予水沖洗2 min，最后再行梯度乙醇，按低濃度到高濃度75%、85%、95%、100%，浸二甲苯Ⅰ、Ⅱ。（6）封片、烤片：在載玻片上滴石蠟中性樹膠，小心謹(jǐn)慎蓋上蓋玻片進(jìn)行封固，注意蓋的時候需排空氣泡。（7）顯微鏡下觀察并拍片：運用Olympus顯示微拍照一體機(jī)，對下丘腦組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，對所需視野拍片，編號并保存。

顯微鏡下觀察每組切片，細(xì)胞質(zhì)明顯淡染，尼氏體明顯減少的神經(jīng)元細(xì)胞為發(fā)生病理性改變的細(xì)胞，定義為陽性細(xì)胞，運用Image J 1.8軟件對HE染色圖片進(jìn)行分析，人工計數(shù)同一高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析取已制備好的上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測5-HT、DA、NE、GABA、Glu含量，根據(jù)試劑盒說明書步驟操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布的使用（ˉx±s）進(jìn)行統(tǒng)計描述，不符合正態(tài)分布則用M（P25，P75）描述；符合正態(tài)分布與方差齊性的多組資料采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；不符合正態(tài)分布與方差齊性的多組計量資料比較采用秩合檢驗（Kruskal-Wallis），兩兩比較用Dunn-Bonferroni檢驗。p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)情況

PCPA是5-HT合成抑制劑，能高度選擇作用于色氨酸羥化酶，通過抑制酶的活性抑制5-HT的合成，有學(xué)者研究指出在足量注射PCPA（350 mg/kg）每天1次，連續(xù)2 d后可較理想復(fù)制失眠大鼠模型，在注射后3 d睡眠覺醒百分比開始發(fā)生變化，6 d達(dá)到高峰，此時幾乎可以造成完全失眠的狀態(tài)，7 d睡眠便開始恢復(fù)，9 d時已恢復(fù)正常，但此時腦內(nèi)5-HT仍處于較低水平[9]。本研究觀察各組大鼠一般狀態(tài)情況，正常組：白天安靜多倦臥，夜晚活動，性情溫和，不易攻擊同類，飲食基本正常，皮毛順滑有光澤；模型組：造模后第1~3 d大鼠行為較活躍，表現(xiàn)出一定興奮性，稍受聲光等刺激就異常狂躁，同類相互攻擊性增多，晝夜節(jié)律紊亂，皮毛較蓬松光澤少。造模后第4~6 d，大鼠疲勞狀態(tài)，興奮性降低，精神狀態(tài)欠佳、活動減少，團(tuán)縮，行走不穩(wěn)，皮毛光澤進(jìn)一步減退；揮發(fā)油高劑量組、揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量組、醇提物低劑量組、地西泮組：給藥1~3 d，白天活動減少，倦臥；給藥4~6 d，白天活動進(jìn)一步減少，倦臥，有睡意，能入睡，精神改善。水提物高劑量組、水提物低劑量組：實驗過程中大鼠行為表現(xiàn)與模型組表現(xiàn)基本一致。從結(jié)果得知，模型組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)與文獻(xiàn)報道基本一致，給藥干預(yù)后沉香揮發(fā)油、沉香醇提物可以改善大鼠失眠情況。

2.2 各組大鼠5-HT、DA、NE水平比較

腦干中縫核含5-HT神經(jīng)元胞體，楊岑等[10]研究發(fā)現(xiàn)5-HT具有促進(jìn)睡眠的作用，提示5-HT是調(diào)節(jié)睡眠的重要神經(jīng)遞質(zhì)。DA主要存在于下丘腦與大腦黑質(zhì)，腦內(nèi)DA神經(jīng)元興奮則誘發(fā)睡眠覺醒，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)失眠大鼠在治療后比治療前DA含量顯著的降低[11]，提示若DA神經(jīng)元興奮性降低則睡眠可能增加，覺醒可能減少。NE能神經(jīng)元胞體主要位于中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、腦橋的藍(lán)斑以及延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的腹外側(cè)部分，上行部分投射到大腦皮層、邊緣前腦和下丘腦，有研究表明在抑制腦內(nèi)酪氨酸羥化酶后，NE含量減少而睡眠時間相應(yīng)增加[12]，提示NE含量減少時睡眠可能增加。本研究結(jié)果如表1、表2、表3所示。

表1 各組大鼠下丘腦中5-HT含量結(jié)果比較Table 1 Comparison of 5-HT contents in hypothalamus of rats in each group[M (P25, P75), n=10]

表2 各組大鼠下丘腦中DA含量結(jié)果比較Table 2 Comparison of DA contents in hypothalamus of rats in each group [M (P25, P75), n=10]

表3 各組大鼠下丘腦中NE含量結(jié)果比較Table 3 Comparison of NE contents in hypothalamus of rats in each group [M (P25, P75), n=10]

模型組大鼠5-HT含量為3.72 ng/mL，低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；模型組大鼠DA、NE含量分別為320.50 pg/mL、1.86 ng/mL，均高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。給藥干預(yù)后，沉香揮發(fā)油高劑量組、沉香揮發(fā)油低劑量組、沉香醇提物高劑量組、沉香醇提物低劑量組，5-HT含量顯著上升，DA、NE含量顯著下降，揮發(fā)油高劑量組、揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量組、醇提物低劑量組下丘腦5-HT含量分別為4.85 ng/mL、4.84 ng/mL、4.81 ng/mL、4.49 ng/mL，均高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；DA含量分別為277.96 pg/mL、269.11 pg/mL、277.34 pg/mL、275.00 pg/mL，NE含量分別為1.56 ng/mL、1.54 ng/mL、1.57 ng/mL，1.58 ng/mL，均顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。上述研究結(jié)果說明，沉香揮發(fā)油、沉香醇提物能夠增加5-HT含量，降低DA、NE含量，對PCPA致失眠大鼠具有鎮(zhèn)靜催眠作用。

2.3 各組大鼠GABA、Glu水平比較

GABA和Glu為氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中較為廣泛的神經(jīng)遞質(zhì)，是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜、催眠等功能。Glu廣泛分布于腦內(nèi)，對丘腦、大腦皮層、小腦的神經(jīng)元起興奮性作用。在缺乏有效睡眠時，Glu功能增強(qiáng)，GABA與Glu是腦內(nèi)主要的抑制性與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，Glu在腦內(nèi)多屬中間代謝產(chǎn)物，只有少數(shù)發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用，Glu是GABA合成的重要原料，而GABA本身不能通過血腦屏障，因此大腦中的GABA均由腦內(nèi)Glu作為原料而生成，故實驗中常以Glu與GABA的比值作為客觀評價中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能興奮和抑制狀態(tài)的指標(biāo)[13,14]。研究表明，GABA與Glu在不同腦區(qū)的含量及相應(yīng)受體功能的改變參與睡眠-覺醒的過程，在睡眠調(diào)節(jié)中起著重要作用[15,16]。本研究結(jié)果如表4、表5、表6所示。

表4 各組大鼠下丘腦中GABA含量結(jié)果比較Table 4 Comparison of GABA contents in hypothalamus of rats in each group (x±s, n=10)

表5 各組大鼠下丘腦中Glu含量結(jié)果比較Table 5 Comparison of Glu contents in hypothalamus of rats in each group (x±s, n=10)

表6 各組大鼠下丘腦中Glu/GABA含量結(jié)果比較Table 6 Comparison of Glu/GABA contents in hypothalamus of rats in each group [M (P25, P75), n=10]

模型組大鼠GABA含量為1.16 ng/mL，低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；模型組大鼠Glu含量為9.85 pg/mL，高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；模型組大鼠Glu/GABA為8.51，高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。給藥干預(yù)后，沉香揮發(fā)油高劑量組、沉香揮發(fā)油低劑量組、沉香醇提物高劑量組、沉香醇提物低劑量組，GABA含量顯著上升，Glu含量顯著下降，Glu/GABA顯著降低，揮發(fā)油高劑量組、揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量組、醇提物低劑量組GABA含量分別為1.46 ng/mL、1.44 ng/mL、1.41 ng/mL、1.39 ng/mL，高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；Glu含量分別為8.73 pg/mL、8.94 pg/mL、8.55 pg/mL、8.85 pg/mL，低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；Glu/GABA分別為6.00、6.31、6.09、6.37，低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。上述研究結(jié)果說明，沉香揮發(fā)油、沉香醇提物能夠增加GABA含量，降低Glu含量，降低Glu/GABA，對PCPA致失眠大鼠具有鎮(zhèn)靜催眠作用。

2.4 各組大鼠GABAARα1、GABAARγ2和5-HT1A受體mRNA表達(dá)水平比較

Sookoian等[17]發(fā)現(xiàn)處于冬眠期的松鼠其大腦內(nèi)5-HT1A受體的表達(dá)較非冬眠期增加，通過相應(yīng)檢測手段也顯示5-HT1A受體mRNA在此時期是處于高表達(dá)水平。GABAA受體在成熟腦組織內(nèi)含量較多，GABA能神經(jīng)元效應(yīng)的發(fā)揮多數(shù)是通過GABAA受體介導(dǎo)調(diào)控的，GABAA受體上含有GABA識別點、氯離子通道、苯二氮?識別點，因此當(dāng)GABA與GABAA受體上的GABA識別點結(jié)合后，氯離子通道開放而使氯離子內(nèi)流，氯離子內(nèi)流引起膜電位改變使神經(jīng)元去極化，從而發(fā)揮GABA的中樞性抑制作用，其中在成熟腦組織中GABAARα1、GABAARγ2是組合較多的亞型之一，有學(xué)者研究失眠動物GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A受體mRNA表達(dá)降低，使用抗失眠藥物干預(yù)表達(dá)升高[18]。本研究結(jié)果如表7、表8、表9所示。

表7 各組大鼠下丘腦中GABAARα1 mRNA結(jié)果比較Table 7 Comparison of GABAARα1 mRNA contents in hypothalamus of rats in each group [M (P25, P75), n=10]

表8 各組大鼠下丘腦中GABAARγ2 mRNA結(jié)果比較Table 8 Comparison GABAARγ2 mRNA contents in hypothalamus of rats in each group [M (P25, P75), n=10]

表9 各組大鼠下丘腦中5-HT1A mRNA結(jié)果比較Table 9 Comparison 5-HT1A mRNA contents in hypothalamus of rats in each group [M (P25, P75), n=10]

模型組大鼠GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A受體mRNA相對表達(dá)量分別為0.55、0.35、0.46，均低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。給藥干預(yù)后，沉香揮發(fā)油高劑量組、沉香揮發(fā)油低劑量組、沉香醇提物高劑量組，GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A受體mRNA表達(dá)顯著升高，揮發(fā)油高劑量組、揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量組GABAARα1mRNA相對表達(dá)量分別為0.94、0.84、0.85，GABAARγ2mRNA相對表達(dá)量分別為0.74、0.70、0.73，5-HT1A受體mRNA相對表達(dá)量為0.81、0.79、0.74，均高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。上述研究結(jié)果表明，沉香揮發(fā)油、沉香醇提物能夠增加GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A受體mRNA表達(dá)，進(jìn)一步證明對PCPA致失眠大鼠具有鎮(zhèn)靜催眠作用。

2.5 各組大鼠病理組織學(xué)觀察

如圖1所示，空白組大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞核居中，細(xì)胞質(zhì)染色深，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體均勻分布；模型組可見神經(jīng)元細(xì)胞核居中，細(xì)胞質(zhì)染色淡，尼氏體比空白組減少；給藥干預(yù)后，揮發(fā)油高劑量組、揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量、醇提物低劑量組以及地西泮組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核居中，細(xì)胞質(zhì)染色較深，尼氏體分布較均勻。水提物高劑量及低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞核尚無明顯偏位，但細(xì)胞質(zhì)染色淡，尼氏體減少。發(fā)油高劑量組；e：醇提物低劑量組；f：醇提物高劑量組；g：水提物低劑量組；h：水提物高劑量組；i：地西泮組。

圖1 沉香提取物對PCPA致失眠大鼠下丘腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（HE，×400）Fig.1 Effect of agarwood extract on morphology of hypothalamus cells in rats with insomnia caused by PCPA (HE,×400)

對各組陽性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計分析，如表10所示，模型組大鼠下丘腦陽性細(xì)胞數(shù)均值為48.30，高于空白組，差異具有顯著性（p<0.05）；給藥干預(yù)后沉香揮發(fā)油高劑量組、沉香揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量組、醇提物低劑量組陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低，揮發(fā)油高劑量組、揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量組、醇提物低劑量組陽性細(xì)胞數(shù)均值分別為12.00、18.00、15.50、23.20，均低于模型組，差異具有顯著性（p<0.05）。結(jié)合上述實驗研究結(jié)果，使用沉香揮發(fā)油、醇提物對PCPA致失眠大鼠進(jìn)行干預(yù)，出現(xiàn)5-HT、GABA含量升高，Glu、DA、NE含量降低，Glu/GABA降低，GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A受體mRNA表達(dá)增加，說明沉香揮發(fā)油、醇提物具有鎮(zhèn)靜催眠活性。段宙位等[19]研究沉香茶脫澀方法，制作復(fù)合型沉香茶飲料，口感更佳，營養(yǎng)更豐富；韓衛(wèi)娟[20]通過實驗研究表明沉香茶具有保護(hù)DNA氧化損傷活性；陳地靈等[21]研究發(fā)現(xiàn)沉香茶具有抗氧化、降血脂，可作為保健類茶飲。因此沉香在應(yīng)用上除熏香安神外，同時可作為養(yǎng)生保健茶飲，可制作為養(yǎng)身保健茶，成為家庭養(yǎng)生保健的一個重要方法，為沉香產(chǎn)品進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供新的途徑。

表10 各組大鼠下丘腦中陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果比較Table 10 Comparison of positive cell mass results in the hypothalamus of each group of rats (x±s, n=10)

3 結(jié)論

對PCPA所致失眠大鼠，沉香揮發(fā)油、醇提物使大鼠5-HT、GABA含量升高，DA、NE、Glu含量降低，以及增加GABAARα1、GABAARγ2、5-HT1A受體mRNA表達(dá)，改善失眠大鼠睡眠情況，具有鎮(zhèn)靜催眠的作用，對失眠的治療具有一定作用。由此初步篩選對失眠具有治療作用的沉香提取物，并推斷沉香揮發(fā)油、醇提取物對單胺類、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用。從神經(jīng)遞質(zhì)含量變化推斷在一定范圍內(nèi)，對睡眠的作用程度與沉香揮發(fā)油、醇提取物的濃度呈正相關(guān)，沉香水提物對睡眠無明顯作用。沉香揮發(fā)油可通過吸入的方式給藥，從給藥方式的簡便性、滿足家庭性用藥需求的角度，沉香揮發(fā)油的作用更優(yōu)，更有利于臨床的應(yīng)用與日常保健的推廣，有望為治療失眠提供新穎、有效、簡便的治療方式。