張青，高遠(yuǎn)，程梟杰，王志廣，李春君，林碧音，唐慶娟

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）（2.馬來亞大學(xué)海洋與地球科學(xué)研究所，吉隆坡 50603）

化療是一種治療惡性腫瘤常用且有效的方法，但會對腸黏膜造成損傷，進而導(dǎo)致腸道屏障功能障礙。而氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一種抗代謝藥物（化療藥物），是氟化嘧啶類抗腫瘤藥[1]。它主要通過競爭性抑制胸苷酸合酶來抑制DNA合成，從而發(fā)揮作用。與5-FU相關(guān)的最明顯的副作用包括粘膜炎、皮炎、心臟毒性和骨髓抑制[2]。另外，5-FU還會引起肝損傷、機體免疫功能和造血功能的低下等。5-FU臨床使用時，可對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，同時對具有快速分化能力的小腸細(xì)胞也具有殺傷作用，使得腸粘膜屏障損傷是化療的主要毒副作用[3,4]。5-FU誘導(dǎo)的腸粘膜改變有5個階段，包括化學(xué)療法介導(dǎo)的信使信號的產(chǎn)生和上調(diào)，通過炎性介質(zhì)的信號傳遞以及粘膜損傷的放大、潰瘍和最終愈合過程的開始[5,6]。研究還發(fā)現(xiàn)，促炎因子（例如TNF-α、IL-1β和IL-6）的合成與5-FU所致的腸粘膜屏障損傷的發(fā)展有關(guān)[7]。據(jù)統(tǒng)計，在化療過程中50%~80%的患者患有腸粘膜屏障損傷，隨后出現(xiàn)潰瘍、腹瀉和腹痛的臨床表現(xiàn)[8]。這直接增加了內(nèi)腔中病原體入侵的風(fēng)險，削弱了患者消化和吸收營養(yǎng)的能力，降低了治療功效并影響了患者的生活質(zhì)量。如今，臨床上常用藥物治療化療誘發(fā)的腸粘膜屏障損傷，包括5-氨基水楊酸、米諾環(huán)素（Minocycline）以及中藥復(fù)方制劑等[9]。而這些藥物治療效果并不顯著且有一定的副作用。因此，有必要研究天然產(chǎn)物，將其活性功能應(yīng)用于化療所致腸粘膜屏障損傷中。

在過去的十年中，海藻由于豐富的生物活性，已被醫(yī)藥、食品和營養(yǎng)保健等多個領(lǐng)域關(guān)注。其中，卡帕藻（Kappaphycus alvarezii）是一種重要經(jīng)濟紅藻，“海燕窩”[10,11]?？ㄅ猎甯缓?卡拉膠、多酚、類黃酮以及花青素等多種海洋天然活性成分[12-14]。同時，研究表明卡帕藻或其提取物具有極好的抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎和促進人體腸道健康等功效，在功能性食品、保健食品及藥品的開發(fā)和應(yīng)用方面具有巨大潛力[15,16]。通常，從海洋中采集的海藻藻體中含有大量的水份，在用于營養(yǎng)研究或食品加工之前要先進行干燥。同時，干燥也是海藻收獲后最常用的加工貯藏方法。但是，植物材料干燥過程中去除水分的同時會發(fā)生明顯的變形，從而使植物基質(zhì)及其細(xì)胞壁和膜的功能退化，進而導(dǎo)致抗氧化化合物或多或少地暴露在氧化反應(yīng)中[17]。已有文獻(xiàn)證明，不同干燥方式會影響卡帕藻的活性成分及其功能[17]。Ling等研究表明晾干條件下卡帕藻中的總酚、總黃酮、總花青素及總類胡蘿卜素含量均高于曬干條件下，其抗氧化活性也優(yōu)于曬干卡帕藻[18]。然而，目前研究都集中于體外的抗氧化研究，缺乏體內(nèi)的活性研究比較。

因此，基于目前的研究現(xiàn)狀，本研究以兩種干燥加工下的卡帕藻為受試物，將其添加到標(biāo)準(zhǔn)飼料中，通過腹腔注射5-FU建立小鼠腸粘膜損傷模型，記錄和測定卡帕藻對小鼠表觀指標(biāo)、空腸組織病理學(xué)及血清中炎癥因子的影響，探討兩種干燥加工下卡帕藻對5-FU所致腸黏膜損傷的保護作用，明確其具有改善化療患者的生活質(zhì)量的潛力，為卡帕藻的加工及深入開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Balb/c小鼠（15~21 g，6周齡，SPF級），購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK（浙）2019-0001）。將小鼠圈養(yǎng)在環(huán)境可控的條件下（溫度為23±2 ℃；相對濕度為50%±10%；光照/黑暗周期為12 h），并且可以自由使用經(jīng)認(rèn)證的飼料和清潔水（礦泉水）。所有的動物實驗均按照中華人民共和國的道德準(zhǔn)則和法規(guī)進行，并得到中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

卡帕藻（K. alvarezii），馬來西亞仙本那地區(qū)，蘇拉威西海域；5-氨基水楊酸、5-氟尿嘧啶，上海源葉生物科技有限公司；AIN93標(biāo)準(zhǔn)飼料，南通特洛菲飼料科技有限公司；氯化鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，卡爾文生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

食品研磨機，小熊電器；超低溫冰箱（DW-86L486），青島海爾特種電器有限公司；電子天平（CP224C），奧豪斯儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機（NEOFUGE 23R），上海力申科學(xué)儀器有限公司；微孔板恒溫震蕩器（B E-9008），上海坤誠科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（SPARK 10M），帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；電動熒光顯微鏡（NIKON/Ni-E），日本尼康公司。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 動物飼料

先將收獲的新鮮卡帕藻分為兩組，第一組是將海藻放入透明的塑料袋中，在陽光下放置到卡帕藻顏色變成白色為止（2~3 d），然后從透明的塑料袋中取出，經(jīng)清洗干凈后再在陽光下干燥3~4 d，此組記為曬干組；第二組是直接將收獲的卡帕藻懸掛起來，直到它們變?yōu)樽仙?，風(fēng)吹日曬下干燥3~4 d，將其記為晾干組。之后，將經(jīng)干燥處理的新鮮卡帕藻在-60 ℃冷凍干燥48 h后，使用食品研磨機將其磨碎，并過80目篩。最后，將卡帕藻粉末保存在-20 ℃以備制作動物飼料使用。

動物飼料選自南通特洛菲飼料科技有限公司的AIN93標(biāo)準(zhǔn)飼料（產(chǎn)品代碼LAD3001G）。根據(jù)美國FDA標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定飼料中受試物的添加量不得超過5%，以不影響正常飲食結(jié)構(gòu)為目的，將所得到的兩種干燥條件的卡帕藻粉末分別以3%的比例分量拌入各自標(biāo)準(zhǔn)飼料中，參照J(rèn)AWAD等[19]報道的方法，將5-氨基水楊酸（作為陽性對照）以0.005%的比例分量拌入標(biāo)準(zhǔn)飼料中，最終飼料的組別見表1。

表1 飼料組別與標(biāo)簽Table 1 Feed group and label

1.3.2 動物分組與給藥

將35只雄性Balb/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按照體重隨機分成5組（n=7）：正常組（N）、模型組（M）、陽性對照組（5-ASA）、曬干卡帕藻組（SKA）和晾干卡帕藻組（AKA）。從第0 d起，M組、5-ASA組、SKA組和AKA組的小鼠腹腔注射5-FU（50 mg/kg，溶于生理鹽水）誘導(dǎo)腸粘膜損傷，而N組的小鼠腹腔注射等體積滅菌生理鹽水，連續(xù)3 d。同時，各組小鼠喂食不同的飼料，給予N組和M組小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料（LAD3001 G），而其他三組的飼料分別為5-ASA、SKA、和AKA，持續(xù)7 d（見圖1及表2）。小鼠在整個實驗期間（7 d）飼養(yǎng)在專門動物飼養(yǎng)籠內(nèi)，每日給予小鼠正常飲食并維持小鼠生活的衛(wèi)生環(huán)境。在實驗過程中，每天記錄小鼠的體重和攝食量。實驗結(jié)束時（第8 d）麻醉小鼠并快速摘眼球取血，頸椎脫臼處死?？焖俜蛛x空腸，取出相應(yīng)臟器稱重后放于液氮速凍，再放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 小鼠分組及給藥情況Table 2 Grouping and administration of mice

圖1 實驗流程圖Fig.1 Experimental flowchart

1.3.3 一般情況的觀察

實驗期間記錄各組小鼠體重、攝食量，觀察各組小鼠食欲、毛發(fā)及其整體狀態(tài)。實驗結(jié)束后計算小鼠體重增長指數(shù)和免疫器官指數(shù)。

1.3.4 組織病理學(xué)分析

為了進行組織病理學(xué)檢查，將小鼠1 cm空腸段浸泡于4%多聚甲醛中，固定48 h以上后，每組取3只小鼠的空腸切片，進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）。之后，使用電動熒光顯微鏡在200倍下觀察組織病理切片。每張照片選取5個視野統(tǒng)計空腸絨毛長度（villus）、隱窩深度（crypt），并計算絨毛長度/隱窩深度的比值（villus/crypt，V/C值）。

1.3.5 血清炎癥因子測定

小鼠處死后，將血液于4 ℃、3500 r/min條件下離心15 min，TNF-α和IL-10的檢測按照酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒說明書操作進行。

1.4 實驗數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)均以（Mean±SEM）呈現(xiàn)，制圖軟件為GraphpadPrism8，統(tǒng)計學(xué)分析軟件為SPSS 20。用單因素方差分析方法（One-Way ANOVA）分析，同時進行LSD組間比較。p<0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，p<0.01視為具有統(tǒng)計學(xué)極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 卡帕藻對小鼠基本情況的影響

整個實驗期間觀察到，N組小鼠表現(xiàn)出正常的晝夜節(jié)律、沒有痛苦癥狀、絨毛正常且精神狀態(tài)良好。同時，觀察到注射5-FU的M組、5-ASA組、SKA組和AKA組小鼠在白天表現(xiàn)的異?；钴S，隨后出現(xiàn)活動減少、絨毛松弛以及背部弓形，而在第5 d得到好轉(zhuǎn)，晝夜節(jié)律逐漸恢復(fù)正常。這與ATIQ等的研究一致，觀察到注射5-FU的小鼠出現(xiàn)駝背、聳肩和毛發(fā)松弛等現(xiàn)象[20]。

2.2 卡帕藻對小鼠體重的影響

在研究廣藿香醇對5-FU所致腸粘膜損傷的保護作用中發(fā)現(xiàn)5-FU會導(dǎo)致大鼠體重的降低，隨后第6天體重開始恢復(fù)[21]。圖2a表明N組小鼠在實驗期間保持穩(wěn)定增長，M組、5-ASA組、SKA組和AKA組小鼠在腹腔注射5-FU后第1 d體重出現(xiàn)下降，之后隨著腹腔注射結(jié)束和實驗時間的延長，在第5 d各組小鼠體重開始升高。至實驗結(jié)束M組體重明顯低于N組（p<0.01），5-ASA組、SKA組和AKA組體重略高于M組。通過圖2b發(fā)現(xiàn)M組（-7.50%）的體重增長率低于N組（8.32%），具有顯著性差異（p<0.01），而5-ASA組（-3.30%）、SKA組（-6.19%）和AKA組（-5.09%）比M組的體重增長率略高。而分析第三天小鼠體重發(fā)現(xiàn)（圖2c），M組（15.75 g）體重明顯低于N組（21.88 g）（p<0.01），5-ASA組（16.85 g）、SKA組（16.83 g）和AKA組（16.76 g）體重明顯高于M組。結(jié)果表明，卡帕藻對5-FU所致腸黏膜損傷小鼠體重的降低具有抑制作用，且第3 d時，卡帕藻可顯著抑制小鼠體重的降低。

圖2 小鼠體重變化Fig.2 Changes in mouse body weight

2.3 卡帕藻對小鼠攝食量的影響

在砂仁揮發(fā)油對5-FU誘導(dǎo)腸粘膜炎的保護作用中發(fā)現(xiàn)5-FU會導(dǎo)致大鼠攝食量的降低，在造模結(jié)束后，模型組和各受試物組的攝食量開始恢復(fù)[22]。從圖3可以看到，N組在實驗期間平均攝食量在3.50 g左右，基本保持不變。M組、5-ASA組、SKA組和AKA組小鼠在腹腔注射5-FU后第1 d出現(xiàn)攝食量低于N組，之后隨著腹腔注射結(jié)束和實驗時間的延長，M組、5-ASA組、SKA組和AKA組小鼠攝食量開始逐漸升高與N組達(dá)到一致。接著，分析第三天小鼠攝食量發(fā)現(xiàn)（見圖3b），M組攝食量（1.54 g）顯著低于N組（3.51 g）（p<0.01），而5-ASA組（2.15 g）、SKA組（2.18 g）和AKA組（2.19 g）攝食量明顯高于M組。結(jié)果表明，卡帕藻對5-FU所致腸粘膜損傷小鼠攝食量的降低具有抑制作用，且第3 d時，卡帕藻可顯著抑制小鼠攝食量的降低。

圖3 小鼠攝食量變化Fig.3 Changes in food intake of mice

2.4 卡帕藻對小鼠免疫器官的影響

5-FU是一種細(xì)胞毒性藥物，持續(xù)使用可以靶向快速的分裂細(xì)胞，使具有快速增殖潛能的正常細(xì)胞（如骨髓）和胃腸道粘膜細(xì)胞與癌細(xì)胞一樣，受到損害，進而造成腸粘膜屏障損傷。而胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，其質(zhì)量與所含的免疫細(xì)胞數(shù)量及免疫功能密切相關(guān)，臟器指數(shù)可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱[23]。由圖4及表3所示，與N組小鼠相比，M組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均降低，呈現(xiàn)極顯著性差異（p<0.01）。與M組小鼠相比，各受試物組小鼠的免疫器官指數(shù)有所改善，但無顯著性差異。結(jié)果說明，注射5-FU會使小鼠免疫器官受損，免疫力降低，本實驗造模成功，而卡帕藻可改善免疫器官受損情況，進而緩解5-FU的細(xì)胞毒性。

表3 小鼠免疫器官指數(shù)Table 3 Mouse immune organ index

圖4 小鼠免疫器官指數(shù)Fig.4 Mouse immune organ index

2.5 卡帕藻對小鼠空腸組織病理學(xué)的影響

形態(tài)學(xué)分析表明，注射5-FU會導(dǎo)致小腸巨大的組織學(xué)損傷，包括絨毛長度縮短、絨毛結(jié)構(gòu)喪失、隱窩變形以及炎性細(xì)胞浸潤等[24]。組織學(xué)分析顯示（見圖5a），N組小鼠的空腸無組織形態(tài)變化，絨毛與完整的隱窩對齊，細(xì)長且排列緊密，腸粘膜結(jié)構(gòu)清晰。觀察到M組空腸黏膜明顯的組織病理學(xué)改變，引起腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為隱窩結(jié)構(gòu)明顯喪失，嚴(yán)重萎縮的跡象，絨毛的縮短和雜亂無章，大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜和囊腫均出現(xiàn)空泡和水腫，這與YU等研究一致[25]。而各受試物組可顯著逆轉(zhuǎn)5-FU所致的空腸組織病理學(xué)改變，表現(xiàn)為絨毛細(xì)長，排列緊密，腸粘膜結(jié)構(gòu)相對完整。

圖5 小鼠空腸形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Morphological structure of mouse jejunum

小腸的隱窩和絨毛功能單元是腸上皮持續(xù)更新的基礎(chǔ)，并參與消化吸收功能，進而維持腸粘膜功能的正常[26]。對空腸的絨毛長度和隱窩深度統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)（見圖5b和圖5c），與N組（360.22 μm）相比，M組（252.09 μm）絨毛長度顯著降低；而5-ASA組（332.58 μm）、SKA組（334.44 μm）和AKA組（350.75 μm）與M組相比，絨毛長度顯著增加（p<0.01）。隱窩深度也表現(xiàn)為同樣的趨勢。V/C值表明，與N組（6.40）相比，M組（5.12）小鼠的V/C值明顯下降，而5-ASA組（6.39）和AKA組（6.35）的V/C值顯著優(yōu)于M組（p<0.05）。這與JAWAD等的研究結(jié)果一致，經(jīng)5-FU處理的小鼠在小腸中表現(xiàn)出明顯的絨毛長度和隱窩深度改變，而陽性組和皂苷A組可以減弱這種現(xiàn)象[19]。以上發(fā)現(xiàn)表明，卡帕藻顯著保護了5-FU所致小鼠腸粘膜損傷，其中晾干卡帕藻具有更好的保護作用。

2.6 卡帕藻對小鼠血清炎癥因子的影響

炎性標(biāo)志物的過量產(chǎn)生主要與腸粘膜屏障損傷有關(guān)，5-FU誘發(fā)小鼠腸粘膜屏障損傷后，促炎因子表達(dá)顯著增加，抗炎因子顯著降低[27]。由圖6所示，檢測小鼠血清中炎癥因子，發(fā)現(xiàn)M組小鼠有炎癥反應(yīng)。其中，AKA組（470.43 pg/mL）與M組（580.69 pg/mL）相比，顯著降低了促炎因子TNF-α的含量（p<0.05），提高了抗炎因子IL-10的含量。ZHANG等的研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5-FU處理的小鼠血清檢測發(fā)現(xiàn)促炎因子TNF-α升高和抗炎因子IL-10降低，而清結(jié)扶正顆粒組可以顯著改變這一現(xiàn)象[28]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)AKA組與SKA組相比，AKA組可顯著降低TNF-α含量和升高IL-10含量。結(jié)果表明，卡帕藻能夠降低小鼠血清TNF-α的釋放和提高IL-10的釋放，進而對腸粘膜損傷起到保護作用，其中晾干卡帕藻可更好地保護卡帕藻的這一活性。

圖6 小鼠血清炎癥因子指標(biāo)Fig.6 Mouse serum inflammatory factor indicators

本研究表明，卡帕藻對由5-FU引起的胃腸道毒性具有強大的預(yù)防潛力，可有效改善相關(guān)的臨床癥狀。這可能是卡帕藻含有多糖、多酚以及黃酮等多種活性物質(zhì)，其中的一種成分或是幾種成分協(xié)同發(fā)揮了抗炎、抗氧化、抗癌、提高免疫力及調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功效[29-31]。此外，研究證明不同干燥方式下的卡帕藻對5-FU引起腸粘膜損傷的保護作用具有不同的影響。其中，晾干卡帕藻的活性更好。這可能是因為不同干燥條件對生物活性化合物的含量、活性和生物利用度都有不同程度的影響。Tomaino等研究表明干燥過程通常會導(dǎo)致植物原料中天然抗氧化劑的消耗[32]。這是因為溫度，過長干燥時間，陽光中的紫外線以及干燥過程中樣品的脫水可能會破壞某些活性化合物，包括抗壞血酸、生育酚和類胡蘿卜素等，進而導(dǎo)致植物化學(xué)含量和抗氧化活性受到不同程度的影響[33]。而本研究中的干燥條件在很大程度上取決于天氣和白天的時間，這導(dǎo)致了干燥時間長（在陽光直射下需要3~4 d），干燥速度慢，延長了海藻在空氣中的暴露時間，進而不同程度的影響了活性成分的氧化并降低了其活性。研究已證明，晾干條件下卡帕藻中的總酚（41.33>26.67 mg沒食子酸/100 g）、總黃酮（16.17>9.83 mg/兒茶素100 g）、總花青素（1.05>0.53 mg氰化物-3-葡萄糖苷/g）及總類胡蘿卜素（0.10>0.03 mgβ-胡蘿卜素/g）含量均高于曬干條件下，其清除2-2-二苯基-1-吡啶基肼基能力的IC50值（22.93>48.73 mg/mL）、清除2,2-疊氮基雙-（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）能力（0.34>0.20 mg抗壞血酸/g）等也高于曬干卡帕藻[18]。Vairappan等研究顯示晾干條件下卡帕藻中的卡拉膠含量（58.3>42.8%）和質(zhì)量（粘度57.8>42.4 cPs，凝膠強度1424.6>898.2 g/cm2）均優(yōu)于曬干條件下的卡拉膠[17]。因此，與曬干相比，晾干干燥可更好的保護卡帕藻的活性，在改善化療所致腸粘膜損傷中表現(xiàn)出更強的健腸功效。

3 結(jié)論

本研究通過5-FU構(gòu)建腸粘膜損傷模型來比較研究兩種干燥方式下卡帕藻的保護作用。觀察到兩種干燥方式下卡帕藻均可抑制5-FU導(dǎo)致的小鼠體重和攝食量的降低。對免疫器官指數(shù)的統(tǒng)計分析也發(fā)現(xiàn)卡帕藻可改善胸腺和脾臟免受損傷，進而減輕5-FU對機體造成的細(xì)胞毒性。通過組織學(xué)分析，卡帕藻的干預(yù)可改善5-FU引起的組織病理學(xué)變化和顯著上調(diào)絨毛長度。另外，與模型組相比，晾干卡帕藻可顯著上調(diào)V/C值，更好地保護粘膜的結(jié)構(gòu)和組織。在炎癥方面，施用5-FU后，在血清中觀察到促炎因子（TNF-α）升高和抗炎因子（IL-10）降低，而晾干卡帕藻可顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，支持了卡帕藻的干預(yù)抑制了腸粘膜損傷模型中炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。此外，研究結(jié)果還表明，不同干燥方式影響了卡帕藻活性的發(fā)揮，通過V/C值和血清炎癥因子可分析到，晾干卡帕藻的效果優(yōu)于曬干卡帕藻。綜上所述，卡帕藻干預(yù)可以通過緩解相關(guān)的臨床癥狀、減緩5-FU的細(xì)胞毒性、改善腸道形態(tài)學(xué)損傷和調(diào)節(jié)炎癥穩(wěn)態(tài)來預(yù)防5-FU誘導(dǎo)的腸粘膜損傷，其中，晾干卡帕藻的效果優(yōu)于曬干卡帕藻。這說明卡帕藻可作為理想的功能性食品原料，有望為卡帕藻的精深加工提供科技支撐。