麻 園，石正旺，羅俊聰，楊 波，王麗娟，萬 穎，宋 銳，曹麗艷，周改靜，田 宏，鄭海學(xué)*，陳軼霞*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 國家重點實驗室，蘭州 730046)

豬瘟(classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一種急性、熱性、高度傳染性的豬病毒性疾病[1-2]。世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties, OIE)將其列為須通報疫病，我國將其列為一類動物疫病。CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員之一，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約12.5 kb[3-4]。CSFV基因組含有一個開放閱讀框，編碼1個含3 898個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白被病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶加工成12個成熟蛋白，包括4個結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1、E2)和8個非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[5-7]。E2蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，也是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白，去糖基分子量為42 ku，用E2蛋白免疫豬時，可刺激宿主機(jī)體產(chǎn)生中和抗體從而提供針對CSFV的免疫保護(hù)[8-9]。

豬瘟是世界范圍內(nèi)流行的豬病毒性疾病，該病的高發(fā)病率和高死亡率對豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，盡管有些地區(qū)已經(jīng)根除，但在根除和流行的邊界地區(qū)及一些野豬群中仍然存在豬瘟的點狀散發(fā)流行[10]。因此，豬瘟仍是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一個重要流行性疾病。在預(yù)防豬瘟方面，早期檢測對防制該病的暴發(fā)至關(guān)重要。目前，病毒中和試驗(VNTs)、熒光抗體試驗(FATs)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、病毒分離、逆轉(zhuǎn)錄鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(RT-PCR)等均是OIE官方推薦的CSFV診斷方法[11-13]，其中，ELISA是CSFV血清學(xué)診斷中最為主要的方法，但傳統(tǒng)的ELISA操作時間較長，不能滿足臨床高通量快速檢測的要求。

化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)是基于免疫反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)而建立的一種免疫檢測技術(shù)[14]。與ELISA相比，CLIA具有特異性強(qiáng)、檢測線性范圍寬、檢測效率高、操作簡便、反應(yīng)時間短、可實現(xiàn)高通量和自動化檢測等優(yōu)點[15]，并且靈敏度提高了6個數(shù)量級[16]。目前，CLIA作為一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡單快速的檢測方法已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但在動物疫病檢測方面仍處于發(fā)展階段，應(yīng)用尚不廣泛[17]。

為了實現(xiàn)CSFV抗體的高特異性、高靈敏性的快速檢測，本研究以CHO細(xì)胞表達(dá)的E2蛋白作為包被抗原，山羊抗豬IgG-HRP抗體作為酶標(biāo)抗體，魯米諾作為發(fā)光底物溶液，成功建立了一種高特異性、高靈敏性、準(zhǔn)確快速的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法，該方法可廣泛用于臨床血清樣品的CSFV抗體檢測。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

采自甘肅省康樂縣某豬場的92份背景清晰豬血清樣品(56份陽性和36份陰性)均經(jīng)兩種商品化ELISA試劑盒檢測、1份CSFV抗體陽性對照血清(中和效價為1∶600)、1份CSFV抗體陰性對照血清、1份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(由陽性對照血清1∶20稀釋獲得)、1份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(由陰性對照血清制備)、A型口蹄疫病毒抗體陽性血清、O型口蹄疫病毒抗體陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性血清、塞內(nèi)卡病毒抗體陽性血清、非洲豬瘟病毒抗體陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜病原學(xué)國家重點實驗室制備與保存；152份田間豬血清樣品采自不同豬場。

1.2 主要試劑與儀器

豬瘟病毒抗體檢測試劑盒(批號:99-43200)購自IDEXX公司；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒購自深圳芬德生物技術(shù)有限公司；豬瘟病毒(GenBank ID: AF092448)E2蛋白胞外區(qū)由本實驗室通過CHO細(xì)胞表達(dá)制備；96孔化學(xué)發(fā)光板購自北京博生欣科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自TaKaRa公司；海藻糖購自南寧中諾生物公司；抗體稀釋液(批號：17032206)購自濟(jì)南百迪泰生物科技有限公司；山羊抗豬IgG-HRP抗體購自上海群己生物科技有限公司；魯米諾發(fā)光底物液購自Thermo公司；化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自上海鳴捷生物科技有限公司。

1.3 抗原E2蛋白最佳包被濃度及血清樣品稀釋倍數(shù)的確定

將原始濃度為0.68 mg·mL-1E2蛋白用包被液從1∶100倍比稀釋包被96孔化學(xué)發(fā)光板，4 ℃包被12 h。將陽性對照血清和陰性對照血清用樣品稀釋液分別稀釋成1∶50、1∶100、1∶200、1∶300 4個梯度，每孔加入50 μL血清，室溫反應(yīng)10 min， 棄液，加入240 μL 1×PBST溶液洗4次，棄液拍干。用抗體稀釋液(批號：17032206)將山羊抗豬IgG-HRP抗體1∶120 000稀釋，每孔加入50 μL，室溫反應(yīng)10 min，棄液，加入240 μL 1×PBST溶液洗4次，棄液拍干。每孔加入100 μL魯米諾底物溶液，讀取化學(xué)發(fā)光值。根據(jù)陽性血清發(fā)光值/陰性對照血清發(fā)光值(P/N值)最大為最佳條件原則，確定E2蛋白的最佳包被濃度及血清樣品最佳稀釋倍數(shù)。

1.4 樣品稀釋液的篩選

分別選?。孩?%BSA(PBST溶液)，②1% BSA[0.9%NaCl，0.5%Tween-20，0.05 mol·L-1MOPS(pH7.0)]，③1%BSA[0.9%NaCl，0.5%Tween-20，1%海藻糖，0.05 mol·L-1MOPS(pH7.0)]作為樣品稀釋液，用這3種稀釋液對陽性對照血清和陰性對照血清1∶200稀釋。將稀釋好的血清加入化學(xué)發(fā)光板進(jìn)行檢測，讀取化學(xué)發(fā)光值并計算分析P/N值。根據(jù)最大P/N值為最佳條件原則，篩選最佳樣品稀釋液。

1.5 封閉液的篩選

分別選?。孩?.5% BSA(1.5 g BSA，100 mL PBST溶液)，②5%脫脂奶粉(5 g脫脂奶粉，100 mL TBST溶液)，③ 2%海藻糖(2 g海藻糖，1%酪蛋白，100 mL PBS溶液)作為封閉液，每孔加入120 μL封閉液，4 ℃封閉10 h。用制備好的化學(xué)發(fā)光板檢測陰陽性對照血清，讀取化學(xué)發(fā)光值并計算分析P/N值。根據(jù)最大P/N值為最佳條件原則，篩選最佳封閉液。

1.6 封閉條件的確定

在4 ℃分別設(shè)置6、8、10、12 h等不同封閉條件，按照以上所設(shè)置封閉條件用③封閉液進(jìn)行封閉。用封閉好的化學(xué)發(fā)光板檢測陰陽性對照血清，讀取化學(xué)發(fā)光值并計算分析P/N值，根據(jù)最大P/N值為最佳條件原則，確定最佳封閉條件。

1.7 反應(yīng)條件的確定

將反應(yīng)條件設(shè)置為37 ℃ 5、10、15、20 min和室溫 5、10、15、20 min，按照所設(shè)計的不同反應(yīng)條件對陰陽性對照血清進(jìn)行檢測，讀取化學(xué)發(fā)光值并計算分析P/N值。依據(jù)最大P/N值為最佳條件原則，確定最佳反應(yīng)條件。

1.8 酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)的確定

用抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋成1∶10 000、1∶20 000、 1∶40 000、1∶80 000、1∶120 000、1∶160 000、1∶200 000等不同濃度梯度。按照設(shè)計的不同條件對陰陽性對照血清進(jìn)行檢測，讀取化學(xué)發(fā)光值，并計算分析P/N值，依據(jù)P/N值最大為最佳條件原則，確定酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.9 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

用本研究建立的方法檢測92份背景清晰的豬血清樣品(56份陽性血清和36份陰性血清)，使用SPSS 17.0軟件將化學(xué)發(fā)光值繪制成橫坐標(biāo)為1-特異性和縱坐標(biāo)為敏感度的ROC(receiver operating characteristic)曲線，并以約登(Youden)指數(shù)[Youden指數(shù)=敏感性-(1-特異性)]最大時所對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值作為臨界值(CO值)[18]。

1.10 特異性試驗

用本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法對A型口蹄疫病毒(FMDV A)、O型口蹄疫病毒(FMDV O)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、塞內(nèi)卡病毒(SVA)、非洲豬瘟病毒(ASFV)抗體陽性血清進(jìn)行檢測，并設(shè)置CSFV抗性陽性血清作為對照。讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算S/CO值，判定待檢血清樣品的陰陽性，從而分析本方法的特異性。

1.11 靈敏性試驗

用本研究建立的化學(xué)發(fā)光檢測方法和市售IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒分別檢測1∶200、1∶2倍 比稀釋的陽性對照血清(中和抗體效價為1∶600)， 讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算S/CO值，判定陰陽性，并與市售IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行對比，從而分析本方法的靈敏性。

1.12 重復(fù)性試驗

1.12.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗 選取6份血清樣品(3份CSFV抗體陽性血清和3份CSFV抗體陰性血清)，用同批包被的化學(xué)發(fā)光板檢測6份血清樣本，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算變異系數(shù)。

1.12.2 批間重復(fù)性試驗 選取2份血清樣品(1份CSFV抗體陽性血清和1份CSFV抗體陰性血清)，用3個不同批次化學(xué)發(fā)光板檢測2份血清樣本，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算變異系數(shù)。

1.13 臨床樣本的檢測

用本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法和商品化CSFV抗體檢測試劑盒共同檢測152份田間豬血清樣品，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算Kappa值。當(dāng)0

2 結(jié) 果

2.1 抗原E2蛋白最佳包被濃度及血清樣品最佳稀釋倍數(shù)的確定

利用棋盤滴定法對抗原E2蛋白最佳包被濃度及最佳血清稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)E2蛋白和血清稀釋倍數(shù)均為1∶200稀釋時，P/N值最大。通過BCA法測定E2蛋白初始濃度為0.68 mg·mL-1(圖1)，因此E2蛋白的最佳包被濃度為3.4 μg·mL-1，血清樣品的最佳稀釋倍數(shù)為1∶200。

M.蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 純化后E2蛋白；2. E2蛋白與CSFV抗體陽性血清反應(yīng)原性鑒定；3. E2蛋白與CSFV抗體陰性血清反應(yīng)原性鑒定

2.2 樣品稀釋液的篩選

用①、②、③樣品稀釋液分別按照最佳稀釋倍數(shù)對血清樣品進(jìn)行稀釋，將稀釋好的陰陽性對照血清加入化學(xué)發(fā)光板檢測。讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算P/N值，比值最大時的樣本稀釋液為最佳樣品稀釋液。結(jié)果表明，用②樣品稀釋液稀釋血清樣品時，P/N值最大。因此，最佳樣品稀釋液為1%BSA。

2.3 封閉液的篩選

將已包被好的化學(xué)發(fā)光板用①、②、③3種不同的封閉液4 ℃ 封閉10 h。用本批次包被的化學(xué)發(fā)光板檢測以最佳稀釋倍數(shù)稀釋的陰陽性對照血清，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算P/N值。P/N值最大時該封閉液則為最佳封閉液。結(jié)果表明，③封閉液封閉時，P/N值最大。因此，最佳封閉液為2%海藻糖。

2.4 封閉條件的確定

用2%海藻糖按照所設(shè)計條件封閉化學(xué)發(fā)光板，通過對陽性對照血清和陰性對照血清檢測，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算P/N值。結(jié)果表明，在4 ℃封閉8 h時，P/N值最大，證實了4 ℃封閉8 h為最佳封閉條件。

2.5 反應(yīng)條件的確定

按照所設(shè)置的反應(yīng)條件對陰陽性對照血清進(jìn)行檢測，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算P/N值。結(jié)果表明，在室溫反應(yīng)10 min條件下，P/N值最大。因此，最佳反應(yīng)條件為室溫反應(yīng)10 min(圖2)。

圖2 反應(yīng)條件的篩選結(jié)果

2.6 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的確定

用抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體分別稀釋成1∶10 000、 1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶120 000、1∶ 160 000、1∶200 000 7個梯度。在最佳反應(yīng)條件下，檢測陰陽性對照血清，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算P/N值。結(jié)果表明，酶標(biāo)抗體1∶40 000稀釋時，P/N值最大。因此，酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)為1∶40 000 (圖3)。

圖3 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的篩選結(jié)果

2.7 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

利用SPSS 17.0軟件將化學(xué)發(fā)光值繪制成ROC曲線(圖4)，并分析計算每個化學(xué)發(fā)光值Youden指數(shù)。Youden指數(shù)最大時為0.946，特異性為100%，靈敏性為94.6%，所對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值為42 378.5，即臨界值為42 378.5。分別檢測1份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和1份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各重復(fù)8次，計算化學(xué)發(fā)光值的平均值。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清化學(xué)發(fā)光值的平均值為293 691.1，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清發(fā)光值的平均值為14 454.8，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)陽性發(fā)光值系數(shù)(a)為0.1時，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清發(fā)光值系數(shù)(b)為0.9，此時兩者之和為42 378.5，與CO值42 378.5一致。當(dāng)S/CO ≥1時，判定為陽性；當(dāng)S/CO <1時，則判定為陰性。

圖4 ROC曲線繪制結(jié)果

2.8 特異性試驗

用本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法，對FMDV A型、FMDV O型、PRRSV、SVA、ASFV抗體陽性血清和CSFV抗體陽性血清進(jìn)行檢測，讀取化學(xué)發(fā)光值并判定陰陽性。結(jié)果表明，以上5種豬病抗體陽性血清的S/CO值均小于1，為CSFV抗體陰性血清，證實了本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法與這5種豬病并無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。

2.9 靈敏性試驗

用本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法和市售IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測倍比稀釋的陽性對照血清，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算S/CO值，判定陰陽性，與IDEXX CFSV 抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果對比，從而分析本方法的靈敏性。結(jié)果表明，本方法的最低稀釋度為1∶6 400，而IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒的最低稀釋度為1∶64，因這兩種方法分別是在1∶200和1∶2的基礎(chǔ)上稀釋，故靈敏度相當(dāng)。

2.10 重復(fù)性試驗

在最佳條件，用本研究建立的化學(xué)發(fā)光檢測方法對6份血清樣品(陽性血清和陰性血清各3份)進(jìn)行檢測，以評估該方法的批內(nèi)重復(fù)性。選取3個不同生產(chǎn)批次的發(fā)光板對2份血清樣品(陽性血清和陰性血清各1份)進(jìn)行檢測，用于批間重復(fù)性的評估。每個血清設(shè)置4個平行孔，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算變異系數(shù)。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為1.80%～6.88%，批間變異系數(shù)為1.11%～9.18%，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于10%，表明本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法重復(fù)性好(表1)。

表1 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.11 臨床樣本的檢測

用本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法與商品化CSFV抗體檢測試劑盒共同檢測152份田間豬血清樣品，讀取化學(xué)發(fā)光值并分析計算Kappa值。結(jié)果表明，Kappa值為0.929>0.75，說明本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法具有高度一致性(表2)。

表2 比對試驗結(jié)果

3 討 論

迄今為止，豬瘟在全球多個國家已得到基本控制，但某些地區(qū)仍存在豬瘟點狀散發(fā)流行、種豬的嚴(yán)重帶毒，并通過胎盤傳染導(dǎo)致仔豬的先天性帶毒以及后備豬潛伏帶毒形成亞臨床感染，這是豬瘟在豬場持續(xù)發(fā)生的重要原因，也給豬瘟的根除和凈化工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)[20]。目前，我國對豬瘟的防控主要以豬瘟兔化弱毒疫苗和亞單位E2蛋白重組疫苗免疫接種，結(jié)合抗體水平監(jiān)測，因而CSVF血清學(xué)診斷顯得尤為重要。E2蛋白是CSFV主要保護(hù)性抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，提供保護(hù)性免疫，從而能有效抵御豬瘟強(qiáng)毒的攻擊[21]。因此，E2蛋白常被用作CSFV血清學(xué)診斷和疫苗開發(fā)研究的對象之一[22]。

ELISA是CSFV血清學(xué)診斷中最為常用的檢測方法，但其在檢測線性范圍小、操作時間長等方面的不足[23]，在很大程度上降低了高通量檢測的效率。CLIA作為一種高特異性、高靈敏性、快速簡單準(zhǔn)確的檢測方法，不僅符合食品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的快速靈敏檢測的需求，更是在獸醫(yī)、動物疫病檢測上具有廣泛的潛在應(yīng)用價值[23]。Tan等[24]用CLIA、商品化ELISA試劑盒和以重組人源α3(IV)NC1蛋白包被自制的ELISA檢測31例抗腎小球基底膜(anti-GBM)疾病患者體內(nèi)的anti-GBM抗體，檢測結(jié)果一致性較好，但在疑似患者檢測上，CLIA要優(yōu)于商品化ELISA試劑盒。熊玲紅等[25]用化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)并對兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，化學(xué)發(fā)光和 ELISA 檢測方法對SARS-CoV-2 IgG檢測的靈敏度均高于SARS-CoV-2 IgM，并且化學(xué)發(fā)光檢測靈敏度要高于 ELISA方法。

ELISA檢測試劑盒CO值的設(shè)定方法大多采用陰性樣品OD450 nm均值±2s或3s，這種方法可能會導(dǎo)致假陰性比例過高，從而影響結(jié)果判定的準(zhǔn)確性[26]。ROC曲線是一種兼顧靈敏度和特異性設(shè)定CO值的好方法，其主要通過Youden指數(shù)來篩選最佳的CO值，當(dāng)Youden指數(shù)越大時，真實性越高[27]。本研究應(yīng)用ROC曲線篩選最佳的CO值具有較好的科學(xué)性和真實性。Kappa值是檢驗兩個檢測方法一致性的重要指標(biāo)，Kappa值越大時，兩種檢測方法的一致性越高[28-29]。應(yīng)用Kappa一致性檢驗分析不同豬瘟抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果一致性，比國內(nèi)同類研究更加科學(xué)[30]。本研究建立的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法與常規(guī)ELISA相比，不僅能在20 min完成對田間血清樣品中CSFV抗體的檢測，還能在加入魯米諾發(fā)光底物之后直接讀取化學(xué)發(fā)光值，省去終止反應(yīng)這一步驟，縮短了檢測時間。本文成功建立的CSFV化學(xué)發(fā)光檢測方法不僅具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、快速簡單準(zhǔn)確等優(yōu)點，并且能極大地提高了CSFV抗體檢測的效率，也為化學(xué)發(fā)光檢測方法在其他動物疫病檢測方法上的應(yīng)用提供了參考。

4 結(jié) 論

成功建立了基于E2蛋白的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法，該方法不僅具有高特異性、高靈敏性，并且能在20 min完成對田間血清樣品中CFSV抗體的檢測，極大地提高了高通量檢測的效率。