肖葉懿，郜重丞，包文斌,2，吳正常,2*，吳圣龍,2*

(1．揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 2. 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

RNA修飾發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，包括100余種調(diào)控方式，其中RNA甲基化是RNA修飾的主要方式[1]。RNA甲基化與DNA甲基化類似，都是以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)為甲基供體，在一系列酶的作用下，將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過(guò)程[2]。近年來(lái)，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一系列RNA甲基化修飾方式，6-甲基腺嘌(N6-methyladenosine，m6A)、5-甲基胞嘧啶(N5-methylcytosine，m5C)、1-甲基腺苷(N1-methyl-adenosine，m1A)是較為常見(jiàn)的類型[3]，其中對(duì)m6A的研究較為深入。腎母細(xì)胞瘤1-相關(guān)蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein，WTAP)是m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心組分之一。現(xiàn)有大量研究表明，WTAP基因的表達(dá)紊亂能夠造成m6A甲基化調(diào)控失衡，與人類多種腫瘤通路的抑制和激活有關(guān)[4-8]；m6A甲基化修飾還與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育以及疾病的發(fā)生和調(diào)控密切相關(guān)，然而在豬WTAP基因功能的報(bào)道較少。

斷奶仔豬腹瀉病(post-weaning diarrhoea, PWD)是造成仔豬死亡的主要原因之一，其中，F(xiàn)18大腸桿菌(E.coliF18)是引起仔豬細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌之一。目前，已有相關(guān)研究從DNA甲基化修飾水平闡述了仔豬細(xì)菌性腹瀉的調(diào)控機(jī)制[9-10]，而在m6A RNA甲基化水平上尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究在個(gè)體水平上利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)WTAP在斷奶蘇太仔豬E.coli抗性型與敏感型個(gè)體腸道組織的差異表達(dá)情況，并且在細(xì)胞水平上利用大腸桿菌F18ab、F18ac刺激和內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2，檢測(cè)處理前后WTAP基因mRNA表達(dá)水平的變化。同時(shí)，為了進(jìn)一步探究WTAP基因表達(dá)水平與F18大腸桿菌感染的關(guān)系，本研究構(gòu)建并獲得了RNA干擾WTAP基因的豬小腸上皮細(xì)胞系，并通過(guò)大腸桿菌菌毛定量和菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)以及間接免疫熒光檢測(cè)沉默WTAP基因?qū)ωi小腸上皮細(xì)胞大腸桿菌(F18ab、F18ac)黏附能力的影響。本研究初步驗(yàn)證了RNA甲基化酶WTAP與仔豬抗F18大腸桿菌感染的關(guān)系，為今后深入探討仔豬大腸桿菌抗性的RNA甲基化調(diào)控機(jī)制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

課題組前期進(jìn)行F18菌株口服攻毒試驗(yàn)，并通過(guò)糞便表型觀察、腸道E.coliF18菌落計(jì)數(shù)、組織病理檢測(cè)以及體外細(xì)菌黏附試驗(yàn)，將出現(xiàn)“水樣糞便”、小腸上皮細(xì)胞大量黏附大腸桿菌的仔豬定義為敏感型個(gè)體，“正常糞便”、小腸上皮細(xì)胞幾乎不黏附大腸桿菌的仔豬定義為抗性型個(gè)體，建立了蘇太豬(Susscrofa)F18大腸桿菌抗性型與敏感型群體，并且已經(jīng)基于抗性型與敏感型全同胞個(gè)體開(kāi)展了大量相關(guān)工作[11-12]，本研究選擇F18大腸桿菌抗性型與敏感型斷奶仔豬公豬各4頭，屠宰后采十二指腸組織和空腸組織置于無(wú)酶管中，-70 ℃保存?zhèn)溆?。豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)惠贈(zèng)；產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F18ab、F18ac由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、LB培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；血液/組織/細(xì)胞DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司(中國(guó)，北京)；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；干粉PBS緩沖液購(gòu)自塞因坦科技有限公司(北京)；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR、定量試劑盒購(gòu)自Vazyme公司(中國(guó)，南京)；E.coli抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTeX公司；Anti-rabbit lgG二抗購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.2 細(xì)胞總RNA的提取和RT-qPCR

1.2.1 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 按照Trizol法分別提取每孔細(xì)胞中RNA，通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ悦總€(gè)個(gè)體RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系：細(xì)胞總RNA 500 ng，5×qRT SuPerMix Ⅱ 2 μL，無(wú)酶水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。

1.2.2 熒光定量 PCR 根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中豬WTAP基因的序列(序列號(hào)： NM_001244241.1)，同時(shí)以大腸桿菌菌毛蛋白基因PILIN(M25302.1)為模板設(shè)計(jì)定量引物，利用Primer Express 2.0軟件跨外顯子設(shè)計(jì)Real-Time PCR引物，并以GAPDH作為內(nèi)參。上述引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 熒光定量引物序列

反應(yīng)體系包含模板cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol ·L-1)各0.4 μL，2 × AceQ qPCR SYBR Green 10 μL，50 × ROX Reference Dye I 0.4 μL，無(wú)酶水補(bǔ)足至20 μL，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序: 95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線和擴(kuò)增曲線分析產(chǎn)物特異性，程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

1.3 大腸桿菌侵染和LPS誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞

取IPEC-J2細(xì)胞以1×106個(gè)·孔-1的密度接種到12孔板中，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，至密度達(dá)到接近80%；在LB培養(yǎng)基中分別接種E.coliF18ab、F18ac菌株，37 ℃ 200 r·min-1搖菌12 h，然后3 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀，PBS緩沖液重懸反復(fù)洗滌3次；稀釋菌體沉淀，加入細(xì)胞培養(yǎng)液后稀釋至細(xì)菌密度在1.0×109CFU·mL-1左右；12孔板中，按1 mL·孔-1加入菌液，每組菌體刺激設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)置1個(gè)未經(jīng)菌體刺激空白孔作為對(duì)照，5 ℃ 恒溫培養(yǎng)4 h后，提取細(xì)胞RNA。

用細(xì)胞培養(yǎng)液將LPS稀釋至0.1 μg·mL-1，在12孔板中每孔加入1 mL細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，將只加細(xì)胞培養(yǎng)液的孔作為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行樣。分別在誘導(dǎo)后的2、4和6 h收集細(xì)胞。

1.4 構(gòu)建靶向WTAP基因的siRNA干擾載體

針對(duì)WTAPmRNA設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA序列和1個(gè)陰性對(duì)照序列(表2)，由上海吉瑪基因公司負(fù)責(zé)合成。使用Lipofectamine 2000將上述siRNAs和空白組(Mock)轉(zhuǎn)染至IPEC-J2細(xì)胞中，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染后在5% CO2的37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜孵育，24 h后觀察熒光素標(biāo)記(FAM)在IPEC-J2中的表達(dá)情況，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)并計(jì)算RNA干擾效率，選擇干擾效率較高的一組序列用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 siRNA干擾序列

1.5 菌毛蛋白基因定量法檢測(cè)大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附情況

F18ab和F18ac菌株分別接種至LB液體培養(yǎng)液，37 ℃搖床220 r·min-1培養(yǎng)12 h，4 000 r·min-1離心5 min收集菌體沉淀，用PBS重懸沉淀并離心，重復(fù)洗滌3次。用細(xì)胞培養(yǎng)液將菌體沉淀稀釋到1.0×109CFU·mL-1。設(shè)大腸桿菌侵染組及空白組，分別按5.0×105個(gè)·孔-1將細(xì)胞鋪板到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至90%左右的細(xì)胞覆蓋度。加入1.0 mL上述細(xì)菌稀釋液于細(xì)胞培養(yǎng)孔中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。吸去孔中細(xì)菌培養(yǎng)液，PBS緩沖液重懸洗滌3次。

向培養(yǎng)孔中加入200 μL的DNA提取裂解液，按照DNA提取試劑盒試驗(yàn)步驟提取細(xì)胞和細(xì)菌總DNA。以抽提所得混合DNA為擴(kuò)增模板，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)進(jìn)行相對(duì)定量分析，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，引物信息見(jiàn)表1。

1.6 細(xì)菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附情況

大腸桿菌制備及細(xì)胞培養(yǎng)同上， PBS緩沖液重懸洗滌3次。立即用0.5% Triton X-100 (超純水配制)溶液處理細(xì)胞 20 min，再用移液槍吹打收集細(xì)菌懸液，將其按10倍梯度稀釋后涂布于LB固體平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)1 000倍細(xì)菌稀釋液涂布的平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，利用Image J軟件統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，最終用平板上的菌落數(shù)×103表示黏附細(xì)菌數(shù)(單位：CFU·mL-1)。

1.7 間接免疫熒光法觀察大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附情況

取出細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%左右的細(xì)胞爬片，PBS漂洗3遍，置于4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，PBS沖洗5 min×3遍；1% Trtion X-100破膜處理15 min，PBS沖洗5 min×3遍；加入含5% BSA封閉液，37 ℃封閉1 h；加入抗E.coli一抗(濃度為1∶50， 使用含5% FBS的PBS配制)，37 ℃孵育2 h后，于4 ℃冰箱過(guò)夜；次日吸掉一抗，PBS沖洗5 min ×3遍；加入紅色熒光標(biāo)記的二抗(濃度為1∶200，使用5% FBS的PBS配制)，37 ℃避光孵育1 h；吸掉抗體，PBST沖洗5 min×3遍；加入DAPI 溶液(1 mg·mL-1) 進(jìn)行染核，37 ℃孵育5 min，PBST沖洗5 min×3遍；使用防熒光淬滅封片劑封片，于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用2-△△Ct法對(duì)熒光定量結(jié)果進(jìn)行處理，其中△△Ct=(待測(cè)目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值)-(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值)。利用SPSS 17.0軟件一般線性模型(general linear model，GLM)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌抗性型和敏感型仔豬十二指腸和空腸組織中WTAP差異表達(dá)分析

對(duì)蘇太斷奶仔豬大腸桿菌抗性和敏感型個(gè)體十二指腸和空腸組織進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖1)，在十二指腸和空腸組織中，抗性型個(gè)體WTAP基因mRNA表達(dá)量極顯著高于敏感型(P<0.01)。

*. P<0.05；**. P<0.01。下同

2.2 大腸桿菌感染豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后WTAP基因的表達(dá)水平

分別用F18ab、F18ac刺激小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，檢測(cè)WTAPmRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖2),與對(duì)照組(Control)相比，F(xiàn)18ab和F18ac處理組WTAP基因mRNA表達(dá)量均顯著下降(P<0.01)。

Control表示空白對(duì)照。下同

2.3 LPS誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后WTAP基因表達(dá)水平

由圖3可知，使用LPS誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞后，WTAP基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。與0 h相比，在誘導(dǎo)2和4 h后WTAP基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，但是在誘導(dǎo)6 h后其表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。

圖3 LPS誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后不同時(shí)間WTAP的表達(dá)差異

2.4 RNAi干擾效率分析

干擾載體成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，檢測(cè)WTAP基因mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示siRNA-1相對(duì)表達(dá)水平為0.46，干擾效率為54%，干擾效率最高，可用于后續(xù)試驗(yàn)(圖4)。

圖4 WTAP基因mRNA表達(dá)量及干擾效率分析

2.5 WTAP基因沉默對(duì)大腸桿菌黏附能力的影響

通過(guò)檢測(cè)大腸桿菌菌毛蛋白基因PILIN的表達(dá)水平以及對(duì)大腸桿菌的菌落計(jì)數(shù)來(lái)探究WTAP基因沉默對(duì)大腸桿菌黏附的影響，如圖5、6所示，WTAP基因沉默后，F(xiàn)18大腸桿菌(F18ab、F18ac)對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞的黏附能力均極顯著上升(P<0.01)，其中，F(xiàn)18ab的黏附量高于F18ac。間接免疫熒光結(jié)果顯示，WTAP基因沉默后，IPEC-J2對(duì)F18大腸桿菌黏附量明顯增多(圖7)。

圖5 WTAP基因沉默的IPEC-J2細(xì)胞與F18大腸桿菌黏附水平的關(guān)系

圖6 WTAP基因沉默的IPEC-J2細(xì)胞對(duì)F18大腸桿菌黏附水平的菌落計(jì)數(shù)

藍(lán)色熒光代表DAPI染色的細(xì)胞核；紅色熒光代表結(jié)合大腸桿菌抗體的大腸桿菌

3 討 論

RNA作為中心法則的重要一環(huán)，對(duì)基因表達(dá)起著十分重要的作用，在幾種RNA甲基化修飾中，m6A修飾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄組中最普遍、豐富、保守的內(nèi)轉(zhuǎn)錄修飾[13]。F18大腸桿菌是造成斷奶前后仔豬腹瀉的主要致病菌，F(xiàn)18大腸桿菌通過(guò)菌毛黏附在小腸內(nèi)壁上，分泌內(nèi)毒素(LPS)造成機(jī)體腸道的炎癥，打破小腸水鹽平衡，大量液體涌入腸腔引起腹瀉，雖然LPS是大腸桿菌造成細(xì)胞損傷的主要途徑，但并不代表大腸桿菌只能通過(guò)LPS破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其黏附素、菌毛等仍會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷[14-16]。因此，為了探究m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP是否與仔豬抗大腸桿菌感染有關(guān)，本研究在個(gè)體水平對(duì)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP在斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感性型個(gè)體之間進(jìn)行表達(dá)差異分析，同時(shí)在細(xì)胞水平用F18大腸桿菌(F18ab、F18ac)刺激和LPS誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WTAP基因的高表達(dá)可能有助于仔豬抵抗大腸桿菌的侵染。為了進(jìn)一步探究WTAP的表達(dá)水平與F18大腸桿菌感染的關(guān)系，本研究檢測(cè)WTAP基因沉默后，大腸桿菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞黏附能力的影響。結(jié)果顯示，WTAP基因沉默后，大腸桿菌的黏附量明顯上升，表明WTAP基因的高表達(dá)有利于仔豬抵抗F18大腸桿菌的感染，其中大腸桿菌F18ab的黏附量高于F18ac。大腸桿菌F18ab與仔豬水腫病有關(guān)，F(xiàn)18ac與仔豬腹瀉相關(guān)，沉默WTAP基因后大腸桿菌F18ab的黏附量高于F18ac，說(shuō)明WTAP可能在F18ab引起的仔豬水腫病中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究表明，WTAP本身并不具有甲基化活性，而是作為調(diào)節(jié)亞基在m6A修飾的形成過(guò)程中發(fā)揮定位作用，敲低WTAP表達(dá)量能夠顯著減少m6A修飾[17-18]，證明WTAP的表達(dá)水平與m6A修飾的形成密切相關(guān)。本研究中，大腸桿菌抗性型豬中WTAP基因表達(dá)量顯著高于敏感型，并且大腸桿菌刺激下調(diào)了該基因的表達(dá)，表明高m6A修飾可能有助于抵抗大腸桿菌F18的侵染，但是其具體機(jī)制仍有待研究。另一方面，在急性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌中[19-20]，WTAP過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，這可能是由于WTAP能夠影響某些細(xì)胞周期蛋白的mRNA穩(wěn)定性，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖周期[21]。同時(shí)，有研究表明，WTAP通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[22]，說(shuō)明WTAP對(duì)細(xì)胞周期的影響是包括轉(zhuǎn)錄后修飾、通路調(diào)控等一系列綜合調(diào)控的結(jié)果。大腸桿菌通過(guò)分泌腸毒素造成小腸上皮細(xì)胞凋亡，而WTAP基因的高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，因此該基因的表達(dá)或許能夠加快豬小腸上皮細(xì)胞更新，進(jìn)而維持腸道屏障的完整以抵抗大腸桿菌的侵染。

本研究發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了RNA甲基化酶WTAP的高表達(dá)有利于提高仔豬大腸桿菌抗性，但是其具體機(jī)制有待研究。因此，下一步將在蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證WTAP基因與大腸桿菌感染的關(guān)系，以及通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選與WTAP調(diào)控仔豬抵抗大腸桿菌有關(guān)的相關(guān)通路，以期進(jìn)一步探究RNA甲基化在仔豬抵御大腸桿菌侵染過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié) 論

在十二指腸和空腸組織中，WTAP基因在抗性型個(gè)體中的表達(dá)量顯著高于敏感型個(gè)體(P<0.01)；并且在F18ab和F18ac刺激后表達(dá)量顯著下降；沉默WTAP基因后，大腸桿菌黏附能力極顯著上升(P<0.01)，在細(xì)胞和個(gè)體水平上初步發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了RNA甲基化酶WTAP的高表達(dá)有利于提高仔豬大腸桿菌抗性。