陳 勝，廖志宏，謝 姿，陳 峰，謝青梅，舒 薇

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 畜禽健康養(yǎng)殖與疾病防控實驗室，廣州 510642； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心，廣州 510642)

禽白血病(avian leukosis，AL)是一種由禽白血病病毒(ALV)感染宿主引起的腫瘤性疾病，包括血管瘤、腎細(xì)胞瘤和結(jié)締組織瘤等[1-2]。在能夠感染禽的ALV中，根據(jù)囊膜蛋白的抗原模式，ALV被分為7個亞群(A～E、J和K)[3]。其中,J亞群禽白血病病毒(ALV-J)于1988年首次在英國報道[4]，由于其傳染性強，隨即迅速擴散到世界各地，成為養(yǎng)禽業(yè)重大病毒性疾病之一。ALV-J屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬的單股RNA病毒，原型株HPRS-103基因組長度為7.2 kb。其中，gag、pol和env基因分別編碼特異性抗原、多聚酶和囊膜蛋白(gp85和gp37)[5-6]。ALV-J可以水平傳播和垂直傳播，并且其水平傳播效率比其他ALV亞群更高[7]。由于缺乏疫苗保護，根除計劃是迄今為止唯一有效的控制ALV-J的方法[2]。

生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45(growth arrest and DNA damage 45，GADD45)，包含了GADD45α、GADD45β/Myd118和GADD45γ 3種蛋白成員，其轉(zhuǎn)錄水平能在脅迫性生長停滯條件下增加[8]。GADD45β可參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞多種生理進程，包括腫瘤生成及轉(zhuǎn)移、細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡等[9-10]。研究表明GADD45β可通過作用于NF-κB，減少促炎性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的激活和腫瘤內(nèi)相關(guān)免疫細(xì)胞的浸潤，從而促進腫瘤的生成[11]。Myint等[12]在膽管癌中發(fā)現(xiàn)GADD45β蛋白可能參與EMT通路的調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)移。最新研究表明GADD45β表達能影響卵巢漿液性囊腺癌患者的總生存時間，表明GADD45β可能參與化療誘導(dǎo)的凋亡或腫瘤免疫反應(yīng)[13]。此外，本實驗室前期在ALV-J抗性基因篩選過程中發(fā)現(xiàn)了GADD45β的顯著上調(diào)[14]。這些研究結(jié)果均表明GADD45β與病毒感染及腫瘤生成密切相關(guān)。但是，GADD45β在ALV-J感染方面的具體研究鮮有報道。

本研究中，作者發(fā)現(xiàn)ALV-J感染可顯著上調(diào)GADD45β的表達水平。在DF-1細(xì)胞中，通過過表達試驗，作者發(fā)現(xiàn)GADD45β的上調(diào)能顯著抑制ALV-J的復(fù)制，而干擾GADD45β則促進了ALV-J的復(fù)制，這說明GADD45β具有抗ALV-J復(fù)制的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒 雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1)和pRK5-Flag空載質(zhì)粒，為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院畜禽健康養(yǎng)殖與疾病防控實驗室保存。ALV-J SD1005毒株為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授實驗室饋贈。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α菌株購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、磷酸緩沖液PBS、Lip3000轉(zhuǎn)染試劑、羊抗兔IgG二抗均購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。Flag標(biāo)簽抗體與內(nèi)參抗體均購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。gp37多克隆抗體由上海生工生物工程有限公司制備。SalⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶購自BioLabs公司。PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物技術(shù)有限公司。蛋白Marker、ECL發(fā)光液、ProLongTMGold Antifade Mountant with DAPI染料購自賽默飛世爾科技有限公司(中國)。4%多聚甲醛溶液和0.1%曲拉通X100購自開封市沛瑜生物科技有限公司。ALV抗原檢測ELISA試劑盒購自IDEXX生物科技有限公司。

1.2 總RNA的提取

Trizol法提取總RNA：在培養(yǎng)細(xì)胞的六孔板中加入適量Trizol試劑，裂解2 min，吹打轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，加入200 μL氯仿，混勻靜置5 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻靜置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。棄上清，加入75%乙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。棄上清，在通風(fēng)櫥干燥5 min，加入適量DEPC水溶解RNA沉淀。

1.3 GADD45β真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

首先用PrimeScript RT試劑盒將總RNA進行兩步法反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。以cDNA為模板擴增GADD45β基因，在引物兩端加入SalⅠ和BamHⅠ酶切位點，引物序列： 5′-GGATCCATGACTCTGGAAGAGACGCA-3′(F)；5′-GTCGACTCACTCAGG TAAGGCAATAGTTGC-3′(R)。

將GADD45β擴增片段與pRK5-Flag線性化載體進行連接，構(gòu)建pRK5-Flag-GADD45β真核表達質(zhì)粒。之后進行轉(zhuǎn)化涂板，挑取單克隆菌落進行PCR鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，證實構(gòu)建成功。

1.4 病毒感染

將DF-1細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達到70%～80%時，進行ALV-J SD1005毒株(103.6TCID50·0.1 mL-1) 感染試驗，感染2 h后換成含2%胎牛血清的維持液，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 Western blot

轉(zhuǎn)染一定時間后，收集細(xì)胞蛋白樣品，經(jīng)SDS上樣緩沖液裂解樣品，于沸水中煮沸5 min后進行凝膠電泳。電泳時，設(shè)定電壓為80 V，待樣品壓成一條直線后，改為110 V恒壓直至結(jié)束。電泳結(jié)束后，將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉完成后，將相應(yīng)蛋白抗體(Flag抗體、β-actin內(nèi)參抗體、GADD45β抗體與gp37多克隆抗體，均為兔源抗體)經(jīng)TBST 1∶1 000 稀釋后，室溫孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌3次，每次10 min， 再使用經(jīng)TBST 1∶10 000稀釋的山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，經(jīng)TBST洗滌3次，每次5 min。最后，按照ECL發(fā)光液試劑盒的指示配制發(fā)光液，并使用超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀C600進行成像。

1.6 實時熒光定量PCR

以cDNA作為模板進行實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green，上下游引物各1 μL， 1 μL cDNA，7 μL DEPC水。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共40循環(huán)。引物: 5′-GCCTTCTGCTGCGACAATGA-3′(GADD45β-qPCR-F)；5′-GGCTCTCGGCGCAGTAAT-3′(GADD45β-qPCR-R)。

1.7 間接免疫熒光試驗

將DF-1細(xì)胞接種于15 mm共聚焦培養(yǎng)皿，經(jīng)轉(zhuǎn)染孵育一定時間后，進行樣品處理，步驟如下：棄液，PBS洗滌3次，加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min， 棄液經(jīng)TBST洗滌3次后，加入500 μL 0.1%曲拉通X100穿孔15 min，棄液，經(jīng)TBST洗滌3次后，加入500 μL 5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，封閉完成后，將gp37多克隆抗體經(jīng)TBST 1∶100稀釋后，室溫孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌3次，每次10 min， 再使用熒光抗兔二抗經(jīng)TBST 1∶100稀釋后，室溫孵育1 h，再經(jīng)TBST洗滌3次，每次10 min。最后，滴加一滴ProLongTMGold Antifade Mountant with DAPI染料，4 ℃保存或進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

收取待檢測細(xì)胞上清液，按照禽白血病病毒抗原檢測試劑盒(Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit)的步驟檢測p27 抗原。

1.9 GADD45β-siRNA干擾試驗

將DF-1細(xì)胞接種于六孔板，待密度為70%～80%時分別轉(zhuǎn)染2 μg的NC siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)和GADD45β siRNA(5′-CCAGAUAACGUGGCGUUCUTT-3′)，轉(zhuǎn)染24 h后，分別感染ALV-J SD1005毒株(103.6TCID50·0.1 mL-1)，在24、48、72 h不同時間點收取樣品用于后續(xù)檢測。

1.10 統(tǒng)計分析

使用Image Pro Plus 6.0軟件對Western blot條帶進行灰度分析。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行統(tǒng)計分析。采用Student-t檢驗組間差異。P<0.05為統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 GADD45β真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

利用引物對GADD45β基因進行PCR擴增后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測到509 bp擴增條帶(圖1A)，大小與預(yù)期相符。將經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切的片段與pRK5-Flag載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，劃線涂板，挑取單克隆菌落進行PCR鑒定，如圖1B所示，檢測到509 bp擴增條帶，經(jīng)測序正確，說明GADD45β真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

為了鑒定pRK5-Flag-GADD45β真核表達質(zhì)粒是否能夠成功表達，將其與pRK5-Flag空載對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，36 h收取細(xì)胞樣品，用Flag抗體進行Western blot檢測，檢測到18 ku條帶，大小與預(yù)期相符，證明pRK5-Flag-GADD45β在DF-1細(xì)胞中成功表達(圖1C)。為了進一步驗證這一結(jié)果，還通過激光共聚焦檢測了GADD45β的表達，并且觀察到其均勻分布于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中(圖1D)。

A. GADD45β PCR擴增；B. 菌液PCR鑒定；C. 蛋白質(zhì)印跡法檢測pRK5-Flag-GADD45β質(zhì)粒表達；D. 激光共聚焦檢測pRK5-Flag-GADD45β質(zhì)粒表達及其細(xì)胞定位

2.2 ALV-J感染上調(diào)GADD45β的表達水平

將DF-1細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞密度達到70%～80%時，進行ALV-J SD1005毒株(103.6TCID50·0.1 mL-1)感染試驗，分別收集24、48與72 h細(xì)胞樣品進行檢測。熒光定量PCR結(jié)果表明，ALV-J感染能顯著上調(diào)GADD45β的mRNA表達水平(圖2A)。同時，用Western blot方法檢測內(nèi)源性GADD45β蛋白表達變化，如圖2B所示，ALV-J感染能顯著上調(diào)GADD45β的蛋白水平。對目的條帶進行了灰度分析(圖2C)，與對照組相比，攻毒組GADD45β/β-actin的比值顯著上調(diào)。為了進一步證明這一結(jié)果，還通過激光共聚焦檢測了GADD45β的蛋白表達情況。結(jié)果表明，ALV-J感染顯著上調(diào)了GADD45β的表達，并且改變了GADD45β的表達模式，從核質(zhì)均勻分布轉(zhuǎn)移到主要分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖2D)。此外，我們前期研究表明在ALV-J攻毒后的雞體免疫器官中也檢測到了GADD45β基因的顯著上調(diào)[14]?？偟膩碚f，上述試驗結(jié)果說明了ALV-J感染能顯著上調(diào)GADD45β的表達水平。

A. 實時熒光定量PCR檢測GADD45βmRNA水平變化；B. Western blot檢測GADD45β蛋白水平變化；C.灰度分析GADD45β/β-actin比值；D. 激光共聚焦檢測GADD45β蛋白表達變化；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001

2.3 過表達GADD45β抑制ALV-J的復(fù)制

為了驗證GADD45β過表達對ALV-J復(fù)制的影響，將GADD45β真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，并于24 h后進行ALV-J SD1005毒株(攻毒劑量103.6TCID50·0.1 mL-1)感染試驗，收取24、48、72 h細(xì)胞蛋白進行Western blot檢測。結(jié)果表明(圖3A～C)，與空載對照組相比，過表達GADD45β顯著下調(diào)了gp37表達，即降低ALV-J的復(fù)制水平(圖3A)。灰度分析也進一步說明了這一結(jié)果(圖3C)。此外，我們收集了感染后第1～6天的細(xì)胞上清液進行ELISA檢測，SP值顯示感染后第2、3、5和6天，過表達組細(xì)胞上清p27抗原水平均顯著低于對照組(圖3B)。間接免疫熒光試驗也證明了GADD45β蛋白的過表達能下調(diào)ALV-J在DF-1細(xì)胞的復(fù)制水平(圖3D)。

A. Western blot檢測gp37蛋白水平變化；B. 灰度分析gp37/β-actin；C. ELISA檢測細(xì)胞上清p27抗原水平變化；D. 間接免疫熒光試驗檢測gp37蛋白表達變化(20×)；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001

2.4 下調(diào)GADD45β促進ALV-J的復(fù)制

為了進一步探究GADD45β對ALV-J復(fù)制的影響，筆者還進行了GADD45β的干擾試驗。首先合成了3條GADD45β siRNA，并分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集蛋白檢測GADD45β的表達水平，以驗證siRNA的干擾效率。結(jié)果如圖4A與4B所示，GADD45β siRNA-3的干擾效率最佳。

將GADD45β siRNA-3與NC siRNA分別轉(zhuǎn)染70%生長密度的DF-1細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24 h感染ALV-J SD1005(103.6TCID50·0.1 mL-1)，收集24、48、72 h細(xì)胞蛋白進行Western blot檢測。目的條帶及灰度分析結(jié)果表明，下調(diào)GADD45β的表達水平能顯著增加ALV-J的復(fù)制(圖4C與4D)。同樣的，我們收集了感染后第1～6 天的細(xì)胞上清液進行ELISA檢測，結(jié)果顯示，從第3 天開始，GADD45β siRNA組細(xì)胞上清液p27抗原水平顯著高于NC siRNA對照組(圖4D)。間接免疫熒光試驗結(jié)果也表明干擾GADD45β的表達能夠有效促進ALV-J的復(fù)制水平。

A. Western blot檢測siRNA 干擾效率；B. Western blot檢測gp37蛋白水平變化；C. 灰度分析siRNA干擾效率；D. 灰度分析gp37蛋白水平變化；E. ELISA檢測細(xì)胞上清p27抗原水平變化；F. 間接免疫熒光試驗檢測gp37蛋白表達變化(10×)；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001

3 討 論

禽白血病是一種高度危害養(yǎng)禽業(yè)的傳染性疾病。ALV-J是典型的致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒，其生命周期高度依賴宿主細(xì)胞蛋白。然而，很少有研究揭示負(fù)責(zé)ALV-J復(fù)制的宿主蛋白。最近的一項研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1)與ALV-J的復(fù)制顯著相關(guān)，并且通過試驗證明了CTHRC1能夠抑制ALV-J的復(fù)制水平[15]。TRIM62(tripartite motif containing 62)同樣在限制ALV-J的復(fù)制中起著重要作用，并且其是通過靶向SPRY結(jié)構(gòu)域而發(fā)揮抗病毒活性[16]。此外，chZAP(chicken zinc finger antiviral protein)在mRNA水平和蛋白水平上均能顯著抑制ALV-J在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制[17]。宿主蛋白在ALV-J的復(fù)制過程中起著重要作用，但具體有哪些宿主蛋白參與其中還未可知，豐富這一過程對于ALV-J的抗病毒研究及開發(fā)新的抗病毒藥物具有重要意義。

GADD45β是公認(rèn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的功能性蛋白[9]，其能通過介導(dǎo)p38-MAPK/JNK信號通路的激活來響應(yīng)環(huán)境壓力，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。不僅如此，GADD45β還與細(xì)胞生長控制，以及細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)相關(guān)，缺乏GADD45β可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長或凋亡[10]。例如，在肝癌中，GADD45β的下調(diào)水平就與腫瘤惡性程度的升高密切相關(guān)[18]。GADD45β已被鑒定為肝癌和慢性肝病的潛在分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[19]。此外，在丙型肝炎病毒感染的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了GADD45β的表達下調(diào)，且啟動子活性降低[20]。在腦垂體腫瘤中，GADD45β通過遏制腫瘤的增殖與存活被鑒定為腫瘤抑制因子[21]。這些研究充分證明GADD45β與腫瘤發(fā)生之間有著密切的聯(lián)系。本試驗前期研究也在致瘤性病毒ALV-J的抗性基因篩選過程中發(fā)現(xiàn)了GADD45β的差異表達[14]，但是其在ALV-J復(fù)制過程中的具體作用尚未報道。本研究表明，GADD45β與ALV-J的復(fù)制密切相關(guān)。ALV-J感染能顯著上調(diào)GADD45β的mRNA和蛋白表達水平。通過過表達GADD45β和siRNA敲低其表達水平，分別得到了抑制和促進ALV-J復(fù)制的結(jié)果，這表明GADD45β能夠抑制ALV-J的復(fù)制。在ALV-J感染DF-1細(xì)胞后，通過激光共聚焦檢測，筆者發(fā)現(xiàn)GADD45β的表達模式從核質(zhì)均勻分布轉(zhuǎn)變?yōu)橹辉诩?xì)胞質(zhì)中表達。GADD45β本身無酶活性，其可通過蛋白間相互作用來執(zhí)行其生理功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活等[22]。目前研究中發(fā)現(xiàn)GADD45β蛋白能與MEKK4結(jié)合，其蛋白可以從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，進而介導(dǎo)p38MAPK/JNK途徑的激活來發(fā)揮其生理功能[23]。而p38MAPK和JNK信號通路的變化很可能是GADD45β發(fā)揮抗病毒作用的關(guān)鍵，這也是接下來研究的重點。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建GADD45β真核表達質(zhì)粒，且在DF-1細(xì)胞中成功表達并均勻分布于核質(zhì)。ALV-J感染可顯著上調(diào)GADD45β的表達水平，提示GADD45β與ALV-J之間存在著緊密聯(lián)系。通過過表達與干擾試驗，發(fā)現(xiàn)GADD45β上調(diào)能顯著抑制ALV-J的復(fù)制，而干擾GADD45β的表達則能促進ALV-J在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制水平。綜上所述， GADD45β能夠抑制ALV-J在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制水平。