唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，葛慶聯(lián)，陸俊賢，馬麗娜，韓 威，高玉時(shí)*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225125； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095； 3. 江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225125)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)為動(dòng)物核外遺傳物質(zhì)，發(fā)生變異的機(jī)率相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)遺傳重組，具有從母系起源上確定品種間遺傳關(guān)系的特點(diǎn)，通常能夠全面反映種群內(nèi)和種群間的遺傳變異[1]，已成為探討種群遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化及種質(zhì)鑒定研究的重要研究對(duì)象[2-4]。線粒體控制區(qū)又稱D-環(huán)區(qū)(D-loop區(qū))，是一段非編碼區(qū)，其進(jìn)化速率較線粒體其它區(qū)域快5～10倍，是研究親緣關(guān)系較近群體的起源進(jìn)化和種質(zhì)鑒定理想的分子標(biāo)記[5-8]，目前已成功應(yīng)用于豬[9-11]、牛[12-14]、羊[15-17]、馬[18-20]、驢[21-23]、鹿[24]和鴿[25]等多個(gè)物種的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究。近年來(lái)，在對(duì)我國(guó)地方雞種遺傳多樣性和母系起源方面的研究顯示，線粒體D-loop區(qū)作為目標(biāo)位點(diǎn)已逐漸成為研究熱點(diǎn)[26-28]。黃勛和等[29]基于線粒體DNA D-loop序列研究了廣東省和鄰省共12個(gè)地方雞品種間的遺傳距離和系統(tǒng)關(guān)系，系統(tǒng)評(píng)估了其遺傳變異水平并追溯了其母系起源。賈曉旭等[30]基于線粒體DNA控制區(qū)序列研究了我國(guó)華東地區(qū)11個(gè)地方雞品種的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，并構(gòu)建了其與紅色原雞系統(tǒng)發(fā)生的鄰接樹(shù)，探討了11個(gè)品種的母系起源。

隨著對(duì)線粒體基因組序列研究的關(guān)注熱度越來(lái)越高，在探討基于線粒體DNA的物種遺傳多樣性和起源進(jìn)化的同時(shí)，對(duì)線粒體單倍型(世系)的劃分也有相關(guān)研究。Liu等[31]以線粒體控制區(qū)第一高變區(qū)為遺傳標(biāo)記，深入研究了家雞的母系起源，揭示世界家雞和紅色原雞由9個(gè)母系世系構(gòu)成，分別為A、B、C、D、E、F、G、H和I型。研究顯示，94.84%的家雞屬于A、B、C、E、F、G和I型，其中A和B型普遍存在于東亞和東南亞地區(qū)，C型為東亞特有，E型普遍存在于南亞和歐美地區(qū)，F(xiàn)和G型僅分布在中國(guó)云南地區(qū)，I型主要分布在中國(guó)云南地區(qū)。Miao等[32]構(gòu)建了基于家雞線粒體全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，詳細(xì)界定了各單倍型類群，并對(duì)世界各地家雞樣本mtDNA控制區(qū)序列進(jìn)行了重新分析，確定了世界家雞及其近緣種紅色原雞可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、W和X等世系。然而，這些研究的關(guān)注點(diǎn)基本集中于物種的遺傳多樣性和起源進(jìn)化，即在不同單倍型的來(lái)源方面取得了諸多成就。但是很少有人關(guān)注不同單倍型究竟去了哪里，即對(duì)雜交后代(配套系)中單倍型的分布情況研究少之又少，迄今為止，對(duì)線粒體優(yōu)勢(shì)單倍型在后代的分布和傳遞情況以及與雞生產(chǎn)性能相關(guān)性研究甚少，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究擬通過(guò)研究不同雜交組合雞群體中線粒體控制區(qū)遺傳多樣性特點(diǎn)和單倍型分布特征，探討線粒體優(yōu)勢(shì)單倍型在不同世代間的傳遞規(guī)律，并通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中紅色原雞序列的聚類分析探究其遺傳起源，為肉雞品種選育和溯源以及資源化開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以固始雞、藏雞、隱性白羽雞、正交F1代、反交F1代以及F2代等6個(gè)雞群共387只個(gè)體為試驗(yàn)材料(表1)，雞種來(lái)源于國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)(江蘇)，翅靜脈采血，ACD抗凝。其中正交F1代為固始雞(♂)×隱性白羽雞(♀)、反交F1代為隱性白羽雞(♂)×固始雞(♀)、F2代為藏雞(♂)×正交F1代(♀)。

表1 6個(gè)雞群體采樣數(shù)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA的提取 采用常規(guī)酚/氯仿法[33]提取血樣基因組DNA，利用0.8%瓊脂糖(Promega，美國(guó))凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果。

1.2.2 引物合成 利用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)GenBank發(fā)布的紅色原雞線粒體控制區(qū)全序列(序列號(hào): NC_007235)設(shè)計(jì)特異性引物1對(duì)，PF：5′-AAACACCCAAACTCACTAAC-3′；PR：5′- CACTGGGATGCGGATACTTGC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)為1 586 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 擴(kuò)增體系50 μL：2×PCR Master Mix(大連寶生物公司)25 μL，10 μmol·L-1上、下游引物(上海生工生物工程公司)各1.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸2 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖(Promega，美國(guó))凝膠電泳檢測(cè)，之后選擇擴(kuò)增效果良好的產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序，所有序列均采用雙向一代Sanger測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DNAStar 5.02 軟件SeqMan程序拼接序列，剪去多余片段，然后與參考序列進(jìn)行逐堿基比對(duì)。利用MEGA 4.0軟件計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建基于雙參數(shù)遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(neighbor-jointing, NJ)[34]。利用DnaSP 5.10 軟件統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)總數(shù)(total number of mutations)、單倍型數(shù)(number of haplotype)、單倍型多樣度(haplotype diversity,Hd)、核苷酸多樣度(nucleotide diversity,Pi)以及平均核苷酸差異(average number of nucleotide differences,K)等遺傳多樣性信息[35]。利用Network 10.1軟件構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(median- joining)(www.fluxus-technology.com)。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體控制區(qū)序列分析

統(tǒng)計(jì)分析6個(gè)群體387個(gè)個(gè)體PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所研究雞樣本線粒體控制區(qū)全序列大小為1 231 bp，與參考序列NC_007237比對(duì)顯示，所有個(gè)體均在859 bp處存在C堿基缺失。多態(tài)性分析顯示，387條序列共檢測(cè)到28個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)，其中單一多態(tài)位點(diǎn)3處，分別位于211、321和927 bp處；其余突變位點(diǎn)均為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。突變類型以轉(zhuǎn)換為主，其中T-C轉(zhuǎn)換20處，A-G 轉(zhuǎn)換8處。 堿基組成分析顯示，T、C、A和G堿基含量分別為33.5%、26.6%、26.5%和13.4%，A+T含量為60.0%，G+C含量為40.0%。

2.2 線粒體控制區(qū)單倍型分析

6個(gè)群體單倍型分析顯示，28個(gè)突變位點(diǎn)共組成19種單倍型，可以劃分為A、B、C、E 4個(gè)單倍型群(分支)，其中A單倍型群包括7個(gè)單倍型共116個(gè) 個(gè)體，B單倍型群包括4個(gè)單倍型共36個(gè)個(gè)體，C單倍型群包括5個(gè)單倍型共132個(gè)個(gè)體，E單倍型群包括3個(gè)單倍型共103個(gè)個(gè)體。各單倍型數(shù)量及在群體間的分布情況見(jiàn)表2。其中，單倍型C1出現(xiàn)頻率最高，在5個(gè)群體中共出現(xiàn)122個(gè)個(gè)體；其次是單倍型E1，在3個(gè)群體中共出現(xiàn)92次；第三是單倍型A1，在4個(gè)群體中共出現(xiàn)72次；這3種單倍型共計(jì)286個(gè)個(gè)體，占樣品總數(shù)的73.9%。

表2 6個(gè)群體線粒體D-loop區(qū)單倍型數(shù)量分布

進(jìn)一步分析顯示，固始雞(GS)主要有A、C單倍型，占比分別為53.42%和46.58%，反交F1代(YG)與GS一樣，主要有A、C單倍型，占比分別為50.75%和49.25%。正交F1代(GY)、F2代和隱性白羽雞(YXB)的A、B、C、E四種單倍型占比相近，E單倍型為這3個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)單倍型，占比分別為48.84%、50.00%和48.89%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同群體D-loop區(qū)全序列單倍型匯總

2.3 6個(gè)雞群體線粒體控制區(qū)遺傳多樣性和遺傳距離

6個(gè)雞群體遺傳多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表4，平均核苷酸差異(K)分布在4.192～6.655之間，其中最高為正交F1代(GY)，最低為藏雞(Z)；核苷酸多樣度(Pi)分布在0.003 40～0.005 41之間，其中最高為GY，最低為Z；單倍型多樣度(Hd)分布在0.496～0.729之間，其中最高為GY，最低為Z。反交F1代(YG)與固始雞(GS)遺傳多樣性相近，GY和F2代與YXB遺傳多樣性相近。

表4 6個(gè)雞群體線粒體控制區(qū)的遺傳多樣性

6個(gè)雞群體平均遺傳距離結(jié)果見(jiàn)表5，種群內(nèi)遺傳距離范圍為0.003 4～0.005 5，最小為藏雞(Z)，最大為正交F1代(GY)。種間遺傳距離大小體現(xiàn)了雞種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，最大為Z與隱性白羽雞(YXB)、GY、F2之間(均為0.009 1)；最小為固始雞(GS)與反交F1代(YG)之間(0.004 3)；YXB、GY以及F2代兩兩之間遺傳距離相近。

表5 基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算的6個(gè)群體平均遺傳距離

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和中介網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

對(duì)6個(gè)群體387個(gè)個(gè)體19種單倍型構(gòu)建了NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1所示，19種單倍型明顯地被分成了A、B、C和E等4個(gè)支系，分別含有116、36、132和103條序列。用Network10.1軟件構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖也證實(shí)了這一點(diǎn)，如圖2所示，中介網(wǎng)絡(luò)圖主要有4個(gè)進(jìn)化枝，分別以A1、B1、C1和E1為中心節(jié)點(diǎn)，這4種單倍型在各自的單倍型類群里出現(xiàn)的頻率最高。

圖1 基于NJ法構(gòu)建的6個(gè)雞群體線粒體控制區(qū)不同單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 6個(gè)雞群體mtDNA 控制區(qū)19種單倍型Network圖

同時(shí)，結(jié)合本研究中387條序列19種單倍型和從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的19條紅色原雞線粒體控制區(qū)全長(zhǎng)序列，采用K2P模型構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示，單倍型A、B、C和E在發(fā)育樹(shù)中形成了4個(gè)大分枝，2個(gè)原雞海南亞種個(gè)體GGJ1和GGJ2單獨(dú)形成一枝。7種A單倍型和4種B單倍型僅與原雞滇南亞種交叉聚為一枝，其中A單倍型群均與滇南亞種GGS5(GU261695)聚為一枝；B單倍型群均與滇南亞種GGS1(NC007235)和GGS8(GU261704)2條序列交叉聚為一枝。3種E單倍型均與紅色原雞印度亞種(GGM1、GGM3和GGM4)交叉聚為一枝。5種C單倍型與印尼亞種(GGB)、指名亞種(GGG1、GGG2)、印度亞種(GGM2)以及滇南亞種(GGS10、GGS3、GGS9)等4種 紅色原雞亞種7條序列交叉聚為一枝。

GGG. 原雞指名亞種；GGS. 原雞滇南亞種；GGM. 原雞印度亞種；GGJ. 原雞海南亞種；GGB. 原雞印尼亞種

3 討 論

3.1 6個(gè)群體mtDNA控制區(qū)全序列單倍型特征

本研究中，6個(gè)群體387個(gè)個(gè)體測(cè)序結(jié)果顯示，線粒體控制區(qū)全序列大小為1 231 bp，所有個(gè)體均在859 bp處有1個(gè)C堿基缺失，共檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)28個(gè)，發(fā)現(xiàn)單倍型19種，按照雞線粒體DNA單倍型分類通用標(biāo)準(zhǔn)[31]，可分為A、B、C和E共4個(gè) 單倍型群(分支)，每個(gè)分支分別有116、36、132和103個(gè)個(gè)體。由構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和Network中介網(wǎng)絡(luò)圖均可以看出，387個(gè)個(gè)體明顯地被分成了A、B、C和E等4個(gè)支系，其中A1、B1、C1和E1分別為各個(gè)支系的主要單倍型。

進(jìn)一步分析顯示，反交F1代與固始雞一樣，主要有A、C兩種單倍型，他們的占比非常接近，固始雞A、C兩種單倍型占比分別為53.42%和46.58%，反交F1代占比分別為50.75%和49.25%。正交F1代和F2代與隱性白羽雞一樣，均含有A、B、C和E共4種單倍型，3個(gè)群體4種單倍型占比相近，均是以E單倍型為優(yōu)勢(shì)單倍型，其中隱性白羽雞的占比為48.89%，正交F1代和F2代 E單倍型占比分別為48.84%和50.00%。在本研究中，試驗(yàn)雞主要采用自由交配的方式，因此后代的幾種單倍型比例均與母系的單倍型比例相似。但在實(shí)際生產(chǎn)或進(jìn)化過(guò)程中由于自然選擇和人工選擇的干預(yù)，或者基因序列的突變，往往造成某些單倍型的遺失或改變，進(jìn)而影響后代的單倍型比例。雖然一直以來(lái)，研究者認(rèn)為mtDNA遵循母系遺傳方式遺傳，但也有研究顯示，動(dòng)物mtDNA存在重組現(xiàn)象，且最可能的途徑是父系滲漏[36]，在人類線粒體遺傳研究中發(fā)現(xiàn)存在雙親線粒體DNA遺傳的可能性[37]，但在其他物種中還未發(fā)現(xiàn)雙親遺傳的證據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在固始雞與隱性白羽雞的雜交傳代過(guò)程中，線粒體D-loop區(qū)在世代傳遞過(guò)程中仍遵循著嚴(yán)格的母系遺傳特點(diǎn)。

線粒體E分支為印度半島、中東和歐洲大陸地方雞種的主要單倍型，研究顯示，E單倍型在中快速型肉雞以及高產(chǎn)蛋雞中普遍存在，在中國(guó)少數(shù)地方雞種中也能檢測(cè)到，但是所占比例均較低，至今為止未發(fā)現(xiàn)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(比例在80%以上)的品種[38]。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，在對(duì)固始雞和臧雞研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，所采集的111個(gè)樣本中均未發(fā)現(xiàn)E單倍型個(gè)體，說(shuō)明這兩個(gè)地方雞種在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中受外來(lái)雞種入侵機(jī)會(huì)較小，可能跟當(dāng)?shù)亟煌ú槐慊蛘吒呱降忍烊黄琳嫌嘘P(guān)，從而保護(hù)了該品種的獨(dú)有特性。有研究顯示，利用線粒體標(biāo)記可以進(jìn)行分子輔助育種，早在1985年，Bell等[39]研究認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)對(duì)奶牛的產(chǎn)奶量、乳脂率等生產(chǎn)性能有影響，且假設(shè)這種影響是mtDNA的遺傳效應(yīng)引起的。Toelle等[40]通過(guò)研究杜洛克豬和約克夏豬的細(xì)胞質(zhì)母系效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)對(duì)初生重、斷奶重和背膘厚度等有重要影響。錢(qián)明娟等[41]采用線粒體基因組DNA超純提取和多態(tài)性擴(kuò)增的方法，開(kāi)發(fā)了一套水稻線粒體基因組分子標(biāo)記，并用于水稻不育系品種鑒定和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)化研究。雖然目前有關(guān)線粒體分子標(biāo)記在雞育種方面的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，然而基于線粒體E單倍型在中快速型商品代肉雞培育過(guò)程中的重要貢獻(xiàn)以及線粒體母系遺傳的獨(dú)有特性，在今后的育種工作中，可以結(jié)合線粒體單倍型特征和育種目標(biāo)，加快培育出滿足消費(fèi)者需求的品種(配套系)。

3.2 6個(gè)雞群體mtDNA 控制區(qū)遺傳多樣性

單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是衡量一個(gè)群體mtDNA變異程度的重要指標(biāo)，通常情況下Hd和Pi值越大，群體遺傳多樣性越豐富，選擇潛力也越大[42-43]。本研究中，藏雞Hd、Pi值以及K值均較低，說(shuō)明藏雞遺傳多樣性相對(duì)較為貧乏，選擇潛力相對(duì)較小，質(zhì)量性狀趨于穩(wěn)定。藏雞主要采用保護(hù)區(qū)和基因庫(kù)保護(hù)，據(jù)資料顯示，自2002年開(kāi)始已經(jīng)過(guò)多個(gè)世代選育，目前群體的遺傳特性和生產(chǎn)性能均保持相對(duì)穩(wěn)定[44]。進(jìn)一步分析顯示，固始雞遺傳多樣性程度與以其為母本的F1代(反交F1代)相近，而隱性白羽雞遺傳多樣性程度與以其為母本的F1代(正交F1代)以及以F1代母雞為母本的F2代相近?？梢?jiàn)線粒體控制區(qū)的變異程度也是遵循著母系遺傳特征世代傳遞的。

種間遺傳距離大小體現(xiàn)了不同雞種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，本研究中，Kiumura雙參數(shù)距離結(jié)果顯示，固始雞與以其為母本的F1代(反交F1代)之間遺傳距離最小，藏雞與隱性白羽雞、正交F1代以及F2代之間遺傳距離最大。藏雞和正交F1代分別為F2代群體的父本和母本，研究顯示，藏雞與F2代之間的遺傳距離為0.009 1，而正交F1代與F2代之間的遺傳距離為0.005 3，可見(jiàn)相對(duì)于父本，母本與其子代之間的親緣關(guān)系更近，而隨著線粒體的世代傳遞，母本與下一代的親緣關(guān)系基本不變，本試驗(yàn)中，母本隱性白羽雞、以隱性白羽雞為母本的F1代(正交F1代)以及以F1代母雞為母本的F2代兩兩之間遺傳距離非常相近。

3.3 6個(gè)雞群體系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

迄今為止，家雞究竟起源于哪種紅色原雞還沒(méi)有明確定論。Fumihito等[45]的研究提出，生活在泰國(guó)及其周邊的原雞指名亞種(Gallusgallusgallus)是家雞的唯一祖先。而Kanginakudru等[46]研究表明，生活在印度及其周邊的原雞滇南亞種(Gallusgallusspadiceus)和印度亞種(Gallusgallusmurghi)在家雞進(jìn)化過(guò)程中貢獻(xiàn)相當(dāng)。本研究將所發(fā)現(xiàn)的19種單倍型與從NCBI下載的19條紅色原雞線粒體控制區(qū)全長(zhǎng)序列聯(lián)合分析，構(gòu)建了K2P模型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，A分支中的7種單倍型和B分支中的4種單倍型均僅與原雞滇南亞種聚為一枝，A、B單倍型為我國(guó)地方雞種的主要單倍型[13]，推測(cè)原雞滇南亞種在我國(guó)地方雞種長(zhǎng)期馴化形成過(guò)程中母系貢獻(xiàn)較大。E分支中3種單倍型均與原雞印度亞種聚為一枝，E單倍型在南亞和西方商品雞中普遍存在，我國(guó)快長(zhǎng)型雞種在培育過(guò)程中可以引入這些外來(lái)雞種血液，從而提高肉雞生長(zhǎng)速度或者蛋雞產(chǎn)蛋性能。C分支中5種單倍型與原雞指名亞種、滇南亞種、印度亞種以及印尼亞種(Gallusgallusbankiva)等4種紅色原雞亞種交叉聚為一枝，母系起源頗為豐富，推測(cè)擁有C單倍型的雞種在其形成過(guò)程中可能受到了多種紅色原雞血液的入侵，然后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的馴化逐漸形成了具有本身獨(dú)特個(gè)性的群體。

4 結(jié) 論

本研究在6個(gè)雞群體387個(gè)個(gè)體線粒體控制區(qū)全序列共發(fā)現(xiàn)了28個(gè)突變位點(diǎn)和19種單倍型；在固始雞與隱性白羽雞的雜交過(guò)程中，線粒體控制區(qū)在雞種中遵循著嚴(yán)格的母系遺傳，不同雜交組合和不同世代中后代與其母本的遺傳多樣性、單倍型數(shù)以及單倍型比例非常接近；19種單倍型共分為A、B、C和E共4個(gè)分支，A、B分支均主要起源于原雞滇南亞種，E分支主要起源于原雞印度亞種，C分支母系起源較為豐富，包括原雞印度亞種、滇南亞種、指名亞種和印尼亞種。