趙采芹，王燕碧，朱 杰, 唐 宏，董運韜，段志強*

(1.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025； 2. 貴州大學(xué)貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025； 3. 山東濱州沃華生物工程有限公司，濱州 256600)

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor(TNF) receptor-associated factor 6, TRAF6)是一個具有典型環(huán)指結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶[1]，它作為一種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵接頭蛋白，可通過激活下游的細胞核因子κB(nuclear factor-kB, NF-κB)、激活因子蛋白-1(activator protein-1, AP-1)、PI3K/Akt和JNK/p38以及干擾素調(diào)節(jié)因子等信號通路影響細胞的增殖、分化和凋亡，并且調(diào)控細胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和骨代謝等生物學(xué)過程[2-3]。研究表明，TRAF6蛋白在人和不同動物的組織中廣泛表達，其中在肺、肝、脾、胸腺和法氏囊中高表達，在腦、心和腿肌中低表達[4-5]。Jin等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6基因在新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)未感染雞的肺和脾中呈現(xiàn)高表達，而在NDV感染雞后的免疫器官(法氏囊、脾和胸腺)中表現(xiàn)為高表達，這表明TRAF6蛋白在抵抗NDV感染中有著重要作用。研究人員利用基因敲除小鼠試驗進一步證實，TRAF6蛋白還在動物的天然免疫和獲得性免疫，以及淋巴結(jié)、脾、胸腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[7]。此外，TRAF6蛋白還是病毒感染細胞后的靶標(biāo)分子，如仙臺病毒和水泡性口炎病毒能分別以蛋白酶依賴或不依賴的方式降解TRAF6蛋白，抑制NF-κB的激活和I型干擾素以及促炎性細胞因子的產(chǎn)生，進而促進病毒在細胞中的復(fù)制[8-9]。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相互作用的具有叉形頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白(TNF receptor associated factor(TRAF)-interacting protein with a forkhead-associated(FHA)domain, TIFA)是一種在白細胞介素1(interleukin 1, IL-1)信號通路中將TRAF6蛋白連接到IL-1受體相關(guān)激酶1的蛋白分子[10]。研究表明，TIFA蛋白與先天性免疫相關(guān)，它通過調(diào)節(jié)TRAF6蛋白的泛素化和寡聚化激活NF-κB信號通路，促進細胞因子的產(chǎn)生[11]。例如，在細菌感染人胚腎細胞過程中，α蛋白激酶1 (alpha-protein kinase 1，ALPK1)的N-端結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合細菌脂多糖合成的前體糖分子ADP-heptose，通過蛋白構(gòu)象變化誘導(dǎo)C-端激酶結(jié)構(gòu)域活化，進而磷酸化TIFA使其發(fā)生寡聚化，并進一步通過與TRAF6蛋白的相互作用激活下游NF-κB信號通路[12-13]。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，在NDV感染過程中，病毒的M蛋白可以通過劑量依賴的方式降低幼倉鼠腎細胞中TIFA和TRAF6蛋白的表達，進而抑制NF-κB信號通路介導(dǎo)的細胞因子產(chǎn)生，促進NDV復(fù)制[14]。因此，TIFA和TRAF6蛋白相互作用所介導(dǎo)的NF-κB信號通路在抵抗微生物感染方面具有重要作用，逐漸得到研究人員的重視和關(guān)注。

目前，TRAF6和TIFA蛋白相互作用的報道僅在非洲爪蟾[15]和人[16]可見。由于雞與人和非洲爪蟾TRAF6和TIFA蛋白的同源性較低，雞TRAF6和TIFA蛋白是否也具有相互作用尚不清楚。因此，本研究首先擴增雞TRAF6和TIFA基因，構(gòu)建其重組真核表達載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA，并進行雞TRAF6和TIFA蛋白的序列分析；將構(gòu)建的重組真核表達載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA共轉(zhuǎn)染細胞，利用熒光共定位和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)試驗驗證雞TRAF6和TIFA蛋白的相互作用。本研究將為后續(xù)進一步探究雞TRAF6和TIFA蛋白相互作用參與的NF-κB信號通路調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制的作用機制奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞

真核表達載體pEGFP-C1、pCMV-HA 購自Invitrogen公司；雞胚成纖維細胞(DF-1)、人胚胎腎細胞(HEK-293T)和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

TRIzol、2×Taq PCR starMix、T4 DNA連接酶購自Invitrogen 公司；卡那霉素、氨芐青霉素、DAPI購自Sigma公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ、EcoR Ⅰ、DNA Marker購自Thermo Fisher公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega 公司；FuGENE?HD Transfection Reagent購自Promega公司； anti-HA和anti-GFP鼠單克隆抗體購自Proteintech公司；RIPA(弱)細胞裂解液、Protein A+G瓊脂球、預(yù)染蛋白Marker、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、SDS-PAGE上樣緩沖液(5×)、 極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中雞TRAF6基因登錄號(XM_015287208.2)和TIFA基因登錄號(XM_015276339.2)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增雞TRAF6和TIFA基因ORF序列的特異性引物(表1)。引物由擎科(成都)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 構(gòu)建重組真核表達載體所用引物信息

1.4 雞TRAF6和TIFA 基因的RT-PCR擴增

使用TRIzol法從DF-1細胞中提取總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，以設(shè)計合成的特異性引物分別擴增雞TRAF6和TIFA基因的CDS區(qū)。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1.0 μL，2×Taq PCR starMix 10.0 μL，上、下游引物 (10 μmol·L-1)各1.0 μL，加ddH2O加至20.0 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；12 ℃保存。將獲得的PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 雞TRAF6和TIFA 基因重組真核表達載體的構(gòu)建

分別使用SalⅠ、KpnⅠ和XhoⅠ、EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶對真核表達載體pCMV-HA和pEGFP-C1以及TRAF6和TIFA基因的膠回收產(chǎn)物進行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行切膠純化，回收目的片段后進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組真核表達載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA送擎科(成都)生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 雞TRAF6和TIFA基因的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)在線軟件ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html/)、SOPMA(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/nps a_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.ex-pasy.org/)分別對雞TRAF6和TIFA基因編碼的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析；從GenBank下載不同物種TRAF6和TIFA蛋白序列，用MegAlign軟件進行氨基酸同源性分析；用NCBI服務(wù)器上的Protein數(shù)據(jù)庫和MegAlign軟件對雞TRAF6和TIFA蛋白氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域保守性進行預(yù)測分析；用PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html)軟件進行蛋白質(zhì)亞細胞定位分析；用在線軟件STRING(https://version11.string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=TqSW5v1qFKp0&input_page_show_search=on)對TRAF6和TIFA蛋白相互作用的細胞蛋白進行預(yù)測。

1.7 HEK-293T細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將HEK-293T細胞用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，按5×105個·孔-1的量將消化后的HEK-293T細胞鋪在35 mm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，待細胞完全貼壁生長至80%左右，將純化的空載體或重組真核表達載體和脂質(zhì)體混合后分別共轉(zhuǎn)染細胞(轉(zhuǎn)染組分為3組，分別為pEGFP-C1和pCMV-HA-TRAF6；pCMV-HA和pEGFP-C1-TIFA；pEGFP-C1-TIFA和pCMV-HA-TRAF6)，輕輕吹打混勻后室溫靜置25 min，然后加入細胞培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 重組蛋白的熒光觀察

重組真核表達載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞后24 h，PBS洗滌細胞3次，依次加入適量4%多聚甲醛固定、0.25% Triton X-100破膜、含10%小牛血清的PBS封閉；PBS洗滌3遍，加入anti-HA鼠多克隆抗體于37 ℃作用2 h；PBS洗滌3遍，加入Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)于37 ℃作用1 h；PBS洗滌3遍，加入DAPI染細胞核10 min，最后用倒置熒光顯微鏡觀察熒光。將獲得的熒光圖片用Photoshop CS3軟件進行Merge處理，觀察重組蛋白的共定位。

1.9 免疫共沉淀(Co-IP)試驗

將重組真核表達載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞后36 h，用PBS清洗細胞3次，加入適量RIPA(弱)細胞裂解液(含PMSF)裂解細胞，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，加入2 μg anti-GFP鼠單克隆抗體，4 ℃作用過夜；加入40 μL protein A+G 瓊脂球繼續(xù)作用3 h；用預(yù)冷的RIPA洗滌protein A+G瓊脂球，重復(fù)3次后加入20 μL SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5 min，離心收集上清，對樣品進行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)膜，最后用anti-HA鼠單克隆抗體進行Western blot，檢測蛋白之間是否存在相互作用。反之，以anti-HA鼠單克隆抗體進行免疫沉淀，用anti-GFP鼠單克隆抗體進行Western blot檢測。

2 結(jié) 果

2.1 雞TRAF6和TIFA基因的RT-PCR擴增

以DF-1細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用特異性引物分別擴增雞TRAF6和TIFA基因的CDS區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得與預(yù)期大小相符的TRAF6 (1 657 bp，圖1A)和TIFA(586 bp，圖1B)基因的目的條帶，但特異性引物含酶切位點和保護堿基的長度，分別為19和22 bp，因此，最終的CDS區(qū)長度分別為1 638和564 bp。

A. 雞TRAF6基因PCR擴增結(jié)果(M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2. 雞TRAF6基因)；B. 雞TIFA基因PCR擴增結(jié)果(M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2. 雞TIFA基因)

2.2 雞TRAF6和TIFA基因重組真核表達載體的構(gòu)建

將獲得的雞TRAF6和TIFA基因片段分別亞克隆至真核表達載體pCMV-HA和pEGFP-C1，用于構(gòu)建重組真核表達載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA。雙酶切鑒定結(jié)果顯示，重組真核表達載體pCMV-HA-TRAF6酶切后獲得3 782 bp的載體條帶和1 657 bp的目的基因條帶(圖2A)，而重組真核表達載體pEGFP-C1-TIFA酶切后則獲得約4 731 bp的載體條帶和586 bp的目的基因條帶(圖2B)。測序結(jié)果顯示，與GenBank中登錄的雞TRAF6和TIFA基因序列相比，送測的9個樣中雞TRAF6基因CDS區(qū)第148位核苷酸均存在堿基突變(T→C)，導(dǎo)致苯丙氨基酸(F)變?yōu)榱涟被?L)，但F和L均為非極性疏水性氨基酸，推測該位點本身就存在突變；而TIFA基因第265位核苷酸發(fā)生一個堿基突變(T→C)，但沒有引起氨基酸的改變。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1～2. 重組真核表達載體pCMV-HA-TRAF6雙酶切產(chǎn)物；3～4. 重組真核表達載體pEGFP-C1-TIFA雙酶切產(chǎn)物

2.3 雞TRAF6和TIFA蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 雞TRAF6和TIFA蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用生物信息學(xué)在線軟件ProtParam、SOPMA和SWISS-MODEL對雞TRAF6和TIFA蛋白進行理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，雞TRAF6蛋白共編碼545個 氨基酸，分子量約為 62 ku，理論pI為6.14；雞TIFA蛋白共編碼187個氨基酸，分子量約為22 ku， 理論pI為5.18。雞TRAF6蛋白含有豐富的二級結(jié)構(gòu)，其中無規(guī)則卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸鏈占11.86%、β-轉(zhuǎn)角占2.92%；雞TIFA蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸鏈占16.58%、β-轉(zhuǎn)角占3.74%。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，雞TRAF6和TIFA蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖3)與二級結(jié)構(gòu)相符，主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成。

圖3 雞TRAF6(A)和TIFA(B)蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.2 雞TRAF6和TIFA蛋白氨基酸同源性分析 用MegAlign 軟件將雞與人、鼠、牛、豬和非洲爪蟾的TRAF6和TIFA蛋白進行氨基酸同源性分析，結(jié)果表明，雞與人和其他哺乳動物TRAF6和TIFA蛋白的同源性分別為76.4%～80.3% 和49.7%～53.3%，而與非洲爪蟾的同源性分別為 69.4% 和49.7%(圖4A、B)，其中雞與牛TRAF6蛋白的同源性最高(80.3%)，與非洲爪蟾的同源性最低(69.4%)，而雞與牛TIFA蛋白的同源性最高(53.3%)，與豬和非洲爪蟾的同源性最低(49.7%)。

數(shù)字1～9表示不同物種；表格右上角數(shù)字表示氨基酸同源性，表格左下角數(shù)字表示變異度

2.3.3 雞TRAF6和TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域保守性分析 用NCBI服務(wù)器上的Protein數(shù)據(jù)庫和MegAlign 軟件對雞TRAF6和TIFA蛋白氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域保守性進行預(yù)測和分析。功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，雞TRAF6蛋白中存在3個明顯的功能結(jié)構(gòu)域，主要包括RING結(jié)構(gòu)域、zinc-finger結(jié)構(gòu)域和MATH結(jié)構(gòu)域，分別在69～107、204～360和378～505位氨基酸區(qū)域。TIFA蛋白存在1個FHA結(jié)構(gòu)域，位于47～104個氨基酸區(qū)域。分別對雞、人和非洲爪蟾的TRAF6和TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域進行保守性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，與非洲爪蟾和人TRAF6蛋白相比，雞TRAF6蛋白的RING結(jié)構(gòu)域氨基酸變異位點主要位于92(G/A)位氨基酸，zinc-finger結(jié)構(gòu)域氨基酸變異位點主要位于325(Q/E)和340(V/I)位氨基酸，MATH結(jié)構(gòu)域氨基酸變異位點主要位于394(R/K)、398(M/I)、414(L/M)、428(F/Y)、488(H/P)位氨基酸；與非洲爪蟾和人TIFA蛋白相比，雞TIFA蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域變異位點主要位于47～48(MA/VV)、75～77(FYR/LFK)位氨基酸。以上結(jié)果說明，雞和人以及非洲爪蟾TRAF6和TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點的保守性較低。

方框表示氨基酸變異位點

2.3.4 雞TRAF6和TIFA蛋白亞細胞定位分析 運用在線軟件PSORTⅡ預(yù)測雞TRAF6和TIFA 蛋白的亞細胞定位，結(jié)果表明，雞TRAF6蛋白在細胞核中占82.6%、細胞質(zhì)占13.0%，表明雞 TRAF6蛋白主要定位在細胞核。TIFA蛋白在細胞核中占56.5%、細胞質(zhì)占17.4%、線粒體占17.4%，表明雞TIFA蛋白主要定位在細胞核。

2.3.5 雞TRAF6和TIFA蛋白相互作用蛋白的預(yù)測 運用在線軟件STRING對雞TRAF6和TIFA蛋白可能存在的互作蛋白進行預(yù)測，結(jié)果顯示(圖6)，與TRAF6和TIFA蛋白可能存在互作的蛋白有IL1R1、IL1RL2、IRAK4、UBE2N、TICAM1、TAB2、TAB1、MAP3K7、IRF7、TLR4、MYD88、TRAF3等。其中，IL1R1和IL1RL2同屬于IL-1家族受體，IL1R1在許多細胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和宿主防御中發(fā)揮重要作用[17-18]，IL1RL2是炎癥反應(yīng)中重要的銜接分子[19]。TLR4可以通過MYD88和TRAF6來調(diào)控NF-κB信號通路參與炎癥反應(yīng)， TLR4/MYD88/NF-κB信號通路通過調(diào)控促炎因子的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)心肌組織的炎癥反應(yīng)[20]。IRF7是I型干擾素的重要調(diào)節(jié)因子，在抵抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用，另外，研究表明，IRF7的過表達會增加人巨噬細胞中免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)的復(fù)制，在NF-κB信號通路中TRAF6的下調(diào)也會導(dǎo)致巨噬細胞中HIV-1復(fù)制增強[21]。

圖6 與TRAF6和TIFA相互作用蛋白的預(yù)測

2.4 雞TRAF6和TIFA蛋白的熒光共定位

將雞TRAF6和TIFA基因重組真核表達載體共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞后24 h，對其進行熒光觀察。熒光共定位結(jié)果顯示，當(dāng)pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA共轉(zhuǎn)染細胞后，重組蛋白EGFP-TIFA和HA-TRAF6主要定位在細胞核；當(dāng)pEGFP-C1和pCMV-HA-TRAF6共轉(zhuǎn)染細胞后，EGFP標(biāo)簽蛋白和重組蛋白HA-TRAF6在細胞核和細胞質(zhì)均存在；而當(dāng)pEGFP-C1-TIFA和pCMV-HA共轉(zhuǎn)染細胞后，重組蛋白EGFP-TIFA和HA標(biāo)簽蛋白同樣定位在細胞核和細胞質(zhì)(圖7)。

圖7 雞TRAF6和TIFA重組蛋白在HEK-293T細胞中的共定位(200×)

2.5 雞TRAF和TIFA蛋白相互作用的驗證

為驗證雞TRAF6和TIFA蛋白在細胞內(nèi)是否存在相互作用，將重組真核表達載體pMCV-HA-TRAF6和pEGFP- C1-TIFA以及空載體pMCV-HA和pEGFP-C1分別進行組合共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，轉(zhuǎn)染細胞后36 h收集細胞裂解上清進行Co-IP試驗。Western blot檢測結(jié)果顯示，重組蛋白HA-TRAF6能與 EGFP-TIFA發(fā)生相互作用，而重組蛋白HA-TRAF6和EGFP標(biāo)簽蛋白以及重組蛋白EGFP-TIFA和HA標(biāo)簽蛋白均不發(fā)生相互作用 (圖8)。

圖8 Co-IP驗證雞TRAF6和TIFA蛋白的相互作用

3 討 論

TRAF6作為重要的多功能信號接頭分子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[22]。研究表明，TRAF6蛋白含有RING、zinc-finger和MATH結(jié)構(gòu)域[1]，其中MATH結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，可以介導(dǎo)TRAF蛋白分子間同源三聚體的形成以及與不同受體蛋白MATH結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)中含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白相結(jié)合[23]；而RING和zinc-finger結(jié)構(gòu)域在信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮泛素連接酶的作用，可以激活下游信號通路和催化底物的泛素化[24]。本研究進行了雞、人和非洲爪蟾TRAF6蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點的變異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞和人及非洲爪蟾TRAF6蛋白中存在多個氨基酸位點變異，這些變異的氨基酸位點可能會導(dǎo)致雞TRAF6蛋白在細胞中的免疫調(diào)控機制不同。而NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細胞受到病毒和細菌感染，NF-κB通過TARF6細胞因子刺激后可被激活，增強基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，TRAF6與NF-κB受體激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB, RANK)相結(jié)合，參與IL-1及脂多糖等因子介導(dǎo)的信號通路，激活NF-κB信號通路[25]。近年來，關(guān)于TRAF6上游蛋白分子介導(dǎo)的TRAF6/NF-κB信號通路相關(guān)報道越來越多，如TLR4/TRAF6/NF-κB、IRAK1/TRAF6/NF-κB和IL-17RA/ TRAF6/NF-κB等[26-28]。已有研究表明，廣州管圓線蟲引起的曲霉菌感染可以通過下調(diào)IL-17RA/TRAF6/NF-κB信號通路來降低TRAF6的表達，從而促進曲霉菌的感染[28]。志賀菌感染可以抑制宿主的TRAF6/NF-κB信號通路，從而抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生來促進志賀菌的復(fù)制[29]。另外，Zhang等[30]研究表明，博爾納病毒1感染下調(diào)了人小膠質(zhì)細胞中IRAK1和TRAF6蛋白的表達，并抑制NF-κB信號途徑，從而在宿主細胞中降低細胞因子的產(chǎn)生，促進病毒的復(fù)制。這些研究結(jié)果表明，TRAF6蛋白介導(dǎo)的NF-κB信號通路在研究病毒和細菌感染方面有重要意義。

TIFA是由Takatsuna等[10]通過酵母菌雙雜交技術(shù)首次篩選并被鑒定為一種與TRAF6相互作用的蛋白。在結(jié)構(gòu)上，TIFA具有N末端叉形頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域(the forkhead-associated，F(xiàn)HA)和C末端有1個共同的TRAF6結(jié)合基序[31]。其中，F(xiàn)HA結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被證實可以與磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸結(jié)合，其主要功能與細胞周期調(diào)控有關(guān)，以及在細胞生長、DNA損傷修復(fù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中都發(fā)揮關(guān)鍵作用[32-33]。本研究對TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點變異分析發(fā)現(xiàn)，雞和人及非洲爪蟾TIFA蛋白中存在多個氨基酸位點變異，說明TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域在哺乳動物中的保守性較低，而雞TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點的變異可能會導(dǎo)致其功能的改變。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，相對于人正常的TIFA與TRAF6蛋白結(jié)構(gòu)域之間的弱結(jié)合，將人TIFA蛋白的C末端第174位氨基酸S突變?yōu)镼和第179位氨基酸M突變?yōu)镈可以增強TIFA與TRAF6蛋白TRAF結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。對雞TIFA蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，雞TIFA蛋白第174位氨基酸為Q，因此，該位點的變化可能會增強雞TIFA與TRAF6蛋白之間的相互作用。

Inoue等[15]在非洲爪蟾中首次證實，TIFA蛋白C末端的TRAF6結(jié)合基序結(jié)合TRAF6蛋白后可以激活NF-κB信號通路，而攜帶TRAF6結(jié)合位點突變的TIFA無法激活NF-κB[10]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，人TRAF6蛋白的TRAF結(jié)構(gòu)域和TIFA蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域之間的相互作用是介導(dǎo)NF-κB激活的重要因素[16]，并且TIFA/TRAF6/NF-κB信號通路的活化也是產(chǎn)生炎性細胞因子的關(guān)鍵通路[13-14]。駱磊[34]研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6及其下游基因在NDV感染的雞胚成纖維細胞或SPF雞免疫器官中均表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達，可能在雞抵抗NDV感染過程中發(fā)揮作用，但是TIFA/TRAF6/NF-κB信號通路在雞相關(guān)病毒感染方面的研究還未見報道。近年來，ALPK1控制TIFA/TRAF6/NF-κB依賴的先天免疫抵抗細菌感染的研究也逐漸被報道[35-37]。例如，鼠傷寒沙門菌和志賀菌感染細胞后會降低ALPK1的產(chǎn)生，并且誘導(dǎo)TIFA和TRAF6蛋白在感染的細胞中形成寡聚體，進而抑制NF-κB的活化以及細胞因子的產(chǎn)生[37]。鑒于TRAF6和TIFA蛋白相互作用在NF-κB信號通路調(diào)控的免疫應(yīng)答中發(fā)揮的重要作用，開展TIFA/TRAF6/NF-κB信號通路調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制作用機制的研究具有重要意義。本研究通過對雞TRAF6和TIFA蛋白的同源性分析發(fā)現(xiàn)，雞與人和其他哺乳動物及其非洲爪蟾的TRAF6和TIFA蛋白之間的同源性差異較大，并且它們功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸并不保守。另外，雖然雞TRAF6和TIFA重組蛋白單獨表達時定位在細胞核和細胞質(zhì)，但是兩者共表達時卻共同定位在細胞核。進一步通過Co-IP證實，雞TRAF6和TIFA蛋白存在相互作用，說明兩者主要在細胞核中發(fā)生相互作用。以上研究將為后續(xù)深入探討與雞TRAF6和TIFA蛋白相互作用的細胞蛋白以及兩者互作調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制的作用機制奠定重要基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了雞TRAF6和TIFA基因的重組真核表達載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA；雖然雞與人和其他哺乳動物以及非洲爪蟾TRAF6和TIFA蛋白的序列同源性及功能結(jié)構(gòu)域保守性均較低，但是利用熒光共定位和Co-IP試驗證實，雞TRAF6和TIFA蛋白能在細胞核中發(fā)生相互作用。