張 立,郭孝靜,高葉萌,李 季,王 璐,辛貴樂

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省農(nóng)墾總醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150088)

慢性低灌注性(CCH)認(rèn)知功能障礙是指在長期且慢性的腦供血不足情況下，腦組織細(xì)胞代謝功能異常所引起的腦功能減退的一種臨床表現(xiàn)?，F(xiàn)代研究表明，白質(zhì)對缺血缺氧等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病損害密切相關(guān)，極易出現(xiàn)不可逆損傷。少突膠質(zhì)細(xì)胞(OLGs)參與了髓鞘的形成，對于維持有髓神經(jīng)纖維作用的發(fā)揮及認(rèn)知功能具有重要作用[1]。CCH可造成OLGs損傷、白質(zhì)完整性破壞(白質(zhì)脫髓鞘)。大量實(shí)驗(yàn)研究表明CCH發(fā)生時會釋放炎性因子[2]，尤其是腫瘤壞死因子-α、細(xì)胞白介素1會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)皮和OLGs的信號失調(diào)，最終導(dǎo)致OLGs的凋亡[3]。前期研究表明針刺聯(lián)合康復(fù)法對非癡呆型血管性認(rèn)知功能損害具有顯著的治療效果[4]。本實(shí)驗(yàn)主要探究針刺聯(lián)合康復(fù)法對慢性低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及胼胝體內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響，闡明針刺聯(lián)合康復(fù)法治療慢性低灌注所致的學(xué)習(xí)記憶能力下降的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

清潔級8周齡Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量215～265 g，采購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心[合格證書編號：SYXK(黑)201,000,7]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，依據(jù)訓(xùn)練結(jié)果選擇水平相近的Wistar大鼠30只作為研究對象，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組及針康組(每組6只)。除假手術(shù)組外各組均采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(2-VO)制備慢性低灌注大鼠模型[5]。實(shí)驗(yàn)過程中各項操作均嚴(yán)格遵守動物倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器和試劑

ZH-PT型動物實(shí)驗(yàn)跑臺(徐州利華)；Morris水迷宮(上海欣軟信息科技)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；勻漿機(jī)(德國IKA)；Olig2(北京博奧森)；PV6001試劑盒、DAB顯色劑(北京中杉金橋)；蘇木素 、伊紅(碧云天生物技術(shù))；濃度10%的水合氯醛(北京化工產(chǎn))；多聚甲醛(北京市化學(xué)試劑研究所)；二甲苯(上海建貝邦工公司)；激光多普勒血流儀(LDF)；脫脂牛奶(完達(dá)山乳業(yè))。

1.3 動物造模

1.3.1 慢性低灌注模型制備 各組大鼠造模前12 h禁食，造模前4 h禁水。采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉成功后，大鼠取仰臥位放置并固定于手術(shù)臺，頸前部皮膚行剃毛處理并進(jìn)行常規(guī)消毒操作后，持眼科剪沿頸部前正中線劃開皮膚，長度約2 cm，暴露頸部筋膜及皮下組織并進(jìn)行鈍性分離，向外撥開胸鎖乳突肌，暴露一側(cè)頸總動脈，用4.0結(jié)扎線永久性結(jié)扎頸總動脈的近端和遠(yuǎn)端，并用手術(shù)剪從中間剪斷，同樣方法操作另一側(cè)，逐層縫合并消毒(注意不要觸及迷走神經(jīng))。

1.3.2 假手術(shù)組 術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉操作同上，手術(shù)操作僅分離雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，不剪斷。無明顯行為學(xué)與異常體征。

1.3.3 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 慢性低灌注模型動物行為學(xué)表現(xiàn)為大鼠反應(yīng)遲鈍，行為學(xué)出現(xiàn)異常，比如找不到平臺或者表現(xiàn)出攀爬行為及沿著迷宮側(cè)壁轉(zhuǎn)圈，逃避潛伏期變長，游泳距離變長，學(xué)習(xí)記憶功能嚴(yán)重受損。體征上表現(xiàn)為同側(cè)眼瞼眼裂變小，瞳孔縮小，眼球內(nèi)陷，皮毛失去光澤。同時能夠發(fā)現(xiàn)慢性低灌注大鼠的尋找平臺策略呈現(xiàn)為周圍式和隨機(jī)式，與正常大鼠的直線式尋找平臺策略相比，慢性低灌注大鼠的游過路程明顯延長，空間學(xué)習(xí)能力明顯下降[6]。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 假手術(shù)組、模型組 僅進(jìn)行同等程度的抓取，不做跑臺及針刺處理。

1.4.2 康復(fù)組 造模成功后，康復(fù)組給予4周的跑臺訓(xùn)練。跑臺的每個通道可以獨(dú)立控制，防止造成個別老鼠被夾的情況。放置大鼠于電動跑臺內(nèi)進(jìn)行適度的運(yùn)動，大鼠為逃避入口處的電擊而不停地向前奔跑，能夠有效提高訓(xùn)練效果。訓(xùn)練方案：坡度為 0°;訓(xùn)練時間：30 min/次，1次/d;訓(xùn)練速度：1～3 d為8 m/min，4～7 d為12 m/min，7 d后為15 m/min，1次/d[7]。

1.4.3 針刺組 造模成功后，給予針刺治療，采用0.25 mm×25 mm無菌針灸針，參考大鼠穴位圖譜[8],取百會穴及其左、右各旁開2 mm處針刺，快速捻轉(zhuǎn)1 min，1次/d，每次針刺留針2 h。

1.4.4 針康組 在針刺治療期間給予跑臺訓(xùn)練1次/d，具體操作方案同針刺組、康復(fù)組。

治療4周后，進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)與空間探索測試，測試完成予以斷頭處死，獲取腦組織標(biāo)本。

1.5 標(biāo)本取材及處理方法

大鼠完成學(xué)習(xí)記憶能力檢測和定位航行實(shí)驗(yàn)后，給予腹腔注射麻醉(同造模麻醉)，行腹部切開術(shù)，剝離腹膜，剪斷肋骨，暴露心臟，從心尖處注入4%多聚甲醛固定液300～400 mL進(jìn)行灌注[9]。灌注完成后，剝離腦組織并修塊，置于4 ℃中的4%多聚甲醛固定液中固定48 h。常規(guī)石蠟包埋，制備4～6 μm薄片，用于免疫組化檢測。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測 本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮試驗(yàn)對各組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力進(jìn)行檢測[9]。治療4周后，各組大鼠分別進(jìn)行連續(xù)6 d的Morris水迷宮試驗(yàn)檢測。實(shí)驗(yàn)時應(yīng)選擇光線均勻、安靜的環(huán)境，保持水溫與室溫相同(20～24 ℃)，倒入脫脂牛奶，以保證水為不透明的乳白色，同時確保避光、安靜的環(huán)境中周圍參照物的一致性。

1.6.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 具體操作如下：以水池的4個象限為入水點(diǎn)，隨機(jī)放入面向水池池壁的大鼠，攝像機(jī)跟蹤拍攝。計算大鼠尋找平臺所需要的時間、游泳的距離及其行為學(xué)的改變。如果大鼠在60 s內(nèi)無法找到平臺，則需要記錄成績?yōu)?0 s。逃避潛伏期的試驗(yàn)2次/d，2次間隔4 h。最后取平均值作為大鼠此次逃避潛伏期試驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.6.1.2 空間探索試驗(yàn) 在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去水池內(nèi)平臺，隨機(jī)選取水池任意一個象限作為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠在游泳過程中經(jīng)過平臺的次數(shù)。

Chalker等[22]提出測量界面結(jié)合性能需要有準(zhǔn)確的模型參量?？紤]到實(shí)際服役環(huán)境的復(fù)雜多變，測量方法還需符合工況，即涂層和基體在界面處的分離并非瞬時破壞，而是較長時間內(nèi)作用的結(jié)果[23]。楊班權(quán)等[24]根據(jù)脆韌性材料斷裂行為不同將涂層和基體劃分為脆性和韌性并相互組合形成四大類。不同的測試方法、力學(xué)模型、計算方法之間均會產(chǎn)生一定的誤差，但是如果誤差不大，則可以認(rèn)為是準(zhǔn)確的，Zhang等[25]采用基體側(cè)面壓入法和垂直拉伸法兩種方法測量Al2O3/Al 6061基體界面結(jié)合的拉伸強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)測試結(jié)果在誤差范圍內(nèi)。

1.6.2 HE染色 取大鼠腦組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，切片厚6 μm，二甲苯脫蠟兩次，每次5 min；經(jīng)無水乙醇5 min×2次，90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇各5 min，使用雙蒸餾水浸5 min，再經(jīng)蘇木素復(fù)染5 min，自來水沖洗；使用含1%鹽酸的70%乙醇中分化20 s，蒸餾水浸5 min，70%、80%乙醇各5 min；之后經(jīng)90%伊紅醇溶液5 min，無水乙醇5 min×2次；再經(jīng)二甲苯5 min×2次；最后在顯微鏡下觀察其中性樹膠封片。

1.6.3 ELISA檢測 將切片置于4 ℃預(yù)冷的PBS溶液中制備10%腦組織勻漿，3 000 r/m，10 min，離心取上清，置于-20℃冰箱中保存?？捡R斯亮藍(lán)法蛋白定量后，ELISA法檢測組織勻漿中TNF-α、IL-1β蛋白含量，并最終計算出每毫克腦組織中TNF-α、IL-1β的含量。

1.6.4 免疫組化 切片常規(guī)脫蠟到水；后放入3% H2O2中孵育10 min，PBS沖洗3次，每次2 min；切片入構(gòu)橡酸鹽緩沖液(PH6)，后置于微波爐中加熱2次，每次5 min，中間間隔10 min。自然冷卻至室溫后，加入一抗，放入4 ℃冰箱中孵育過夜，次日取出，PBS沖洗3次，每次3 min；加入二抗，放入37 ℃恒溫箱中留置35 min，PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色6～10 min，沖洗干凈后；蘇木素復(fù)染2 min；常規(guī)脫水透明，封片處理完成后，400倍顯微鏡下觀察并拍照。采用IPP6.0圖像軟件分析計算OLGs陽性細(xì)胞數(shù)，取3個視野的均值作為該樣本的OLGs陽性細(xì)胞數(shù)的相對表達(dá)量[10]。

1.6.5 腦血流檢測 給予腹腔注射麻醉(同造模麻醉)，麻醉成功后，大鼠俯臥位放置于手術(shù)臺，頭部皮膚剃毛處理并進(jìn)行常規(guī)消毒操作后，用外科剪刀在頭蓋骨上的皮膚上做1個橢圓形的切口約2 cm暴露出顱骨,用棉簽去除結(jié)締組織，確保頭蓋骨清潔和干燥。將激光多普勒血流儀的探頭用膠水固定于顱骨上，監(jiān)測大鼠的腦血流(CBF)變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

通過Mrioss水迷宮檢測各組大鼠行為學(xué)變化，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，搜索原平臺次數(shù)顯著減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，搜索原平臺次數(shù)顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針刺組和康復(fù)組比較，針康組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，搜索原平臺次數(shù)顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1～2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期結(jié)果比較

表2 各組大鼠搜索原平臺區(qū)次數(shù)結(jié)果比較

2.2 各組大鼠HE染色結(jié)果比較

假手術(shù)組大鼠腦白質(zhì)形態(tài)無異常。模型組大鼠腦白質(zhì)肉眼可見腦部不同程度萎縮，顯微鏡下可觀察到其胼胝體、腦室旁和皮質(zhì)下白質(zhì)疏松、纖維排列凌亂，胼胝體可見明顯的空泡樣改變，皮質(zhì)下白質(zhì)出現(xiàn)軟化灶等病理性改變；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組和針康組腦白質(zhì)神經(jīng)纖維排列緊密，胼胝體空泡面積明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針刺組、康復(fù)組相比，針康組神經(jīng)纖維排列更為規(guī)則，病理學(xué)改善更為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠腦白質(zhì)形態(tài)改變(200×)

2.3 各組大鼠腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β水平比較

ElISA法檢測結(jié)果顯示[11]：與假手術(shù)組相比，模型組誘導(dǎo)了促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，各治療組TNF-α、IL-1β水平降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針刺組、康復(fù)組相比，針康組大鼠腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β水平降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-1β檢測結(jié)果比較

2.4 各組大鼠胼胝體部位OLGs的陽性表達(dá)情況比較

表4 胼胝體區(qū)Olig2陽性表達(dá)積分光密度

圖2 各組大鼠OLGs表達(dá)情況(200×)

2.5 各組大鼠腦血流量結(jié)果比較

通過LDF檢測各組大鼠腦血流量變化，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦血流量顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，各治療組大鼠腦血流量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針刺組和康復(fù)組相比，針康組大鼠腦血流量增加最明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腦血流量

3 討論

慢性腦灌注不足(CCH)是由于慢性神經(jīng)退行性變亦或是腦血管疾病而產(chǎn)生的血液供應(yīng)不足從而導(dǎo)致的認(rèn)知障礙、情緒障礙和解決問題的能力喪失[12]。CCH所引起的腦組織血流降低、腦組織供血不足的病理狀態(tài)是血管性癡呆和阿爾茲海默病等疾病的病理基礎(chǔ)。關(guān)于CCH引起認(rèn)知功能障礙的許多潛在機(jī)制，如神經(jīng)元損傷、微血管病變、白質(zhì)損傷和炎性反應(yīng)。近年來，由CCH致認(rèn)知障礙比例漸增，但對其發(fā)病機(jī)制、防治方法的研究等尚不成熟。

據(jù)報道，腦白質(zhì)損傷(WML)影響學(xué)習(xí)記憶功能。腦白質(zhì)占人腦質(zhì)量的50%，在人腦中占據(jù)相當(dāng)大的比例，主要由軸突纖維、少突膠質(zhì)細(xì)胞和其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成[11]。OLGs是構(gòu)成白質(zhì)的主要細(xì)胞類型，長期圍繞著神經(jīng)元的軸突形成髓鞘，特別易受到缺血性等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的損害，髓鞘有助于加速沿軸突傳遞的電信號，如果無少突膠質(zhì)細(xì)胞，動作電位的速度會慢很多。據(jù)報道，在2-VO大鼠模型中，腦血流量僅達(dá)到正常值的1/3，阻塞雙側(cè)頸總動脈可在實(shí)驗(yàn)動物中誘發(fā)慢性腦灌注不足，大鼠會出現(xiàn)白質(zhì)完整性破壞、OLGs損傷和白質(zhì)脫髓鞘(髓鞘密度降低)，誘發(fā)神經(jīng)元之間的傳遞障礙，導(dǎo)致認(rèn)知障礙持續(xù)存在[13]。認(rèn)知功能的恢復(fù)依賴于神經(jīng)元之間電信號的傳遞，OLs是神經(jīng)元通信所必須的最相關(guān)的細(xì)胞類型。已有文獻(xiàn)表明，少突膠質(zhì)細(xì)胞的形成可以促進(jìn)認(rèn)知功能的恢復(fù)[14]，新生的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量與學(xué)習(xí)記憶功能呈正比[15]。此外，炎性因子在CCH誘導(dǎo)的WML的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，從而造成腦損傷，脫髓鞘誘導(dǎo)CCH可能會損壞不僅白質(zhì)還會增加炎性因子的釋放。文獻(xiàn)表明通過調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子表達(dá)，在CCH誘導(dǎo)的WML和認(rèn)知障礙的發(fā)展中起保護(hù)作用[16]。當(dāng)慢性腦低灌注發(fā)生時，大腦循環(huán)中持續(xù)的葡萄糖和氧氣供應(yīng)減少，LDF檢測顯示血流異常，大腦皮層腦血流量減少，導(dǎo)致了大腦蛋白質(zhì)合成減弱，從而促進(jìn)了缺血性損傷。神經(jīng)活動和局部腦血流量之間的密切時空關(guān)系被稱為“神經(jīng)血管耦合”[17]。目前研究表明學(xué)習(xí)記憶能力提高可能是由神經(jīng)耦合所需的局部腦血流量(CBF)的適當(dāng)增加所決定的。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對治療慢性低灌注認(rèn)知功能障礙并無明確有效的治療方法。目前，藥物治療有鹽酸多奈哌齊、美金剛、丁苯酞[18]和尼莫地平等，這些藥物在使用過程中對于認(rèn)知功能障礙的改善，但療效并不理想，這是由于這些藥物在使用時急性腦梗死已經(jīng)發(fā)生，患者認(rèn)知功能已經(jīng)下降或者加重。而中醫(yī)學(xué)在治療認(rèn)知障礙擁有不可逾越的優(yōu)勢。申偉等[19]概括總結(jié)出中藥改善認(rèn)知功能具有絕對優(yōu)勢，對改善行為能力有明顯的作用。另外，針灸治療具有操作簡單、副作用小和適用范圍廣范等特點(diǎn)，針灸在改善腦供血、保護(hù)及修復(fù)受損腦組織損傷等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。除此之外，隨著康復(fù)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，康復(fù)訓(xùn)練在慢性低灌注認(rèn)知功能障礙方面的療效逐漸引起關(guān)注。目前，較為有效的認(rèn)知訓(xùn)練包括注意力、記憶力、定向力和邏輯思維等訓(xùn)練。有針對性的康復(fù)訓(xùn)練包括有氧運(yùn)動是促進(jìn)認(rèn)知功能恢復(fù)的有效策略[20]，有氧運(yùn)動能對認(rèn)知功能方面做出明顯的改善，有效增強(qiáng)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。由于計算機(jī)輔助認(rèn)知訓(xùn)練等儀器局限于醫(yī)院，且花費(fèi)巨大，給患者及家庭造成較大的經(jīng)濟(jì)壓力，而有氧運(yùn)動彌補(bǔ)了場地限制的缺點(diǎn)，且安全、簡便和有效。故在本研究中采用ZH-PT型動物實(shí)驗(yàn)跑臺來代替有氧運(yùn)動康復(fù)。中醫(yī)學(xué)針灸與康復(fù)的結(jié)合可以產(chǎn)生最大化的治療功效，且二者有疾病治療的交集。由此，鄭婷婷等[21]提出了針康法的治療理念，即頭穴叢刺長留針同時伴有現(xiàn)代康復(fù)治療，以使治療達(dá)到最優(yōu)化及最大化的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刺聯(lián)合康復(fù)法能夠增加CCH大鼠認(rèn)知功能障礙后胼胝體部OLGs標(biāo)志物的表達(dá)，使腦白質(zhì)完整性增加，排列更加緊密。

本項研究表明，Morris水迷宮顯示，各治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均有提高，且針康組大鼠改善最明顯；HE染色后，各治療組大鼠腦白質(zhì)損傷改善，針康組大鼠腦白質(zhì)改善較為明顯；ELISA測定結(jié)果顯示，各治療組的TNF-α、IL-1β水平均有下降，針康組下降尤其顯著；免疫組化結(jié)果表明各治療組OLGs的陽性標(biāo)志物表達(dá)均增加；激光多普勒血流儀測定結(jié)果顯示，各治療組的腦血流量均有增加，針康組增加最明顯。

綜上所述，針刺聯(lián)合康復(fù)法(針康法)能夠顯著提高CCH大鼠認(rèn)知功能障礙后胼胝體內(nèi)OLGs標(biāo)志物表達(dá)，減少大鼠腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β水平，這可能是針刺聯(lián)合康復(fù)法改善CCH大鼠認(rèn)知功能障礙的部分作用機(jī)制。除此之外，針刺聯(lián)合康復(fù)法的治療效果明顯優(yōu)于單純的針刺或者康復(fù)治療，這為針刺聯(lián)合康復(fù)法治療認(rèn)知功能障礙臨床應(yīng)用提供了理論支撐，具有良好的社會效益。