吳志軍，王曉偉，陳默，胡紅艷，陶玲玲，徐淑艷，張華，曹宏偉，王紅

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)術(shù)理論研究部；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)理學(xué)院）

虎杖是我國傳統(tǒng)中藥，具有利濕退黃、散瘀止痛、清熱解毒、止咳化痰等功效。可用于治療濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛、癰腫瘡毒、水火燙傷、跌打損傷、肺熱咳嗽等癥狀，在臨床得到廣泛應(yīng)用[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，虎杖具有抗病毒、止血鎮(zhèn)痛、抑菌、消炎、抗腫瘤的作用。另外，對心血管疾病和相關(guān)脂代謝也有調(diào)節(jié)作用。其中的白藜蘆醇因具有抗腫瘤、抗發(fā)炎、抗病毒、降血壓等功效而受到廣泛關(guān)注[2-3]。

虎杖的主要藥用部位是根和根莖，隨著其藥理學(xué)性質(zhì)和藥用部分的化合物逐漸被鑒定，發(fā)現(xiàn)聚酮類化合物是虎杖的主要活性成分。包括二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類等次生代謝產(chǎn)物[4]。聚酮是一大類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣的次生代謝產(chǎn)物，與人健康密切相關(guān)。聚酮類化合物參與多種生物學(xué)過程，具有抗腫瘤、抗寄生蟲、抗炎癥和抗真菌、調(diào)節(jié)免疫活性等功能[5-6]。

生物堿、黃酮、苯丙烷、二苯乙烯、蒽醌、木質(zhì)素等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生過程多需要甲基化修飾。植物O-甲基轉(zhuǎn)移酶能將次生代謝產(chǎn)物中的氧原子進(jìn)行甲基化修飾，甲基化修飾可以提高脂溶性和穩(wěn)定性，能更好的發(fā)揮其生物活性[7-8]。甲基化修飾是植物中廣泛存在的催化甲基化反應(yīng)的蛋白，在植物苯丙烷衍生途徑、類黃酮合成途徑、二苯乙烯和蒽醌類糖苷等次生代謝產(chǎn)物合成過程中發(fā)揮重要作用，并在植物抗生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[9]。

虎杖作為重要的藥用植物，在臨床上有廣泛應(yīng)用。目前，虎杖的基因組信息尚未得到測序，相關(guān)功能基因組學(xué)的研究較少，僅有基因組草圖發(fā)布，嚴(yán)重制約虎杖的相關(guān)功能基因的研究[10]。許多化合物的合成途徑和相關(guān)基因尚未得到確定，僅有苯丙烷途徑中少數(shù)基因如查爾酮合酶和白藜蘆醇合酶和轉(zhuǎn)錄因子的基因得到報道。郝大程等[11]利用Illumina HiSeq 2000高通量測序技術(shù)測了虎杖根的短序列，并通過信息學(xué)方法拼接并注釋了86 000多個unigenes，其中有許多與次生代謝相關(guān)的同源基因。Chen等[12]報道了從虎杖基因組中擴(kuò)增出2-吡喃酮合酶的基因，研究了其催化特征和表達(dá)模式。柳忠玉等[13-14]獲得白藜蘆醇合成基因并觀察了其在擬南芥中的表型，同時驗證了轉(zhuǎn)錄因子PcMYB1基因的功能和表達(dá)特征。Bao等[15]從虎杖基因組中擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)錄因子基因PcWRKY，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，研究了其在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮的作用。

研究從虎杖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得O-甲基化酶全長序列，設(shè)計引物進(jìn)行克隆，構(gòu)建植物表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，并對其相關(guān)生物信息學(xué)進(jìn)行了分析。同時驗證了其植物在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。并不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了驗證。為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)，為利用合成生物學(xué)生產(chǎn)這些活性成分提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和植物材料

大腸桿菌DH5α、BL21菌株和根癌農(nóng)桿菌GV3101為實驗室保存，分別用于載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)和植物轉(zhuǎn)化，P19由實驗室保存，用于煙草瞬時轉(zhuǎn)化。PBI121質(zhì)粒和eGFP-PBI121質(zhì)粒由實驗室保存。野生型虎杖、擬南芥均在實驗室種植。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）由實驗室保存，用于轉(zhuǎn)基因煙草瞬時表達(dá)?；⒄仍?4℃溫室中培養(yǎng)，光周期為：16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)8周后用于實驗。分別進(jìn)行UV-B脅迫30 min、0.5 mM的MeJa、0.1 mM的ABA進(jìn)行處理。處理后樣品用液氮速凍后放-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

質(zhì)粒小提試劑盒購自全式金生物公司；膠回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；Silwet L-77購自科創(chuàng)欣達(dá)公司，用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化；Clon Express II One Step Cloning Kit一步克隆重組試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，引物合成、測序均由北京擎科生物科技有限公司完成；各種限制性內(nèi)切酶均購自Thermo Fisher Scientific公司；植物DNA快速提取試劑盒購自GeneMark公司；Plant Total RNA Purification Ki（tCat.TR02）試劑盒購自GeneMark公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金公司。

1.3 目的基因的獲得

用液氮研磨虎杖葉片，使用Plant Total RNA Purification Kit試劑盒提取虎杖葉片總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行10倍稀釋做模板。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，獲得待擴(kuò)增的氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因全長序列（去掉終止密碼子），并設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（上游引物ATGGGTTCAGCTGCTCCAGA，下游引物為：AGGATAAACCTCGATAACTG），PCR擴(kuò)增過程如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，60℃退火45 s，72℃延伸1 min；30個循環(huán)后72℃恒溫10 min。將PCR產(chǎn)物膠回收，同時以eGFP-PBI121為模板擴(kuò)增eGFP基因（上游引物：CAGTTATCGAGGTTTATCCTATGTCTAGAGTGAGCAAGGG，下游引物：GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA），膠回收用于融合片段的擴(kuò)增。

1.4 載體構(gòu)建

PCR擴(kuò)增eGFP的片段，利用Overlap extenation PCR分兩輪將PcOMT和eGFP基因片段連為融合表達(dá)載體。用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI對PBI121載體進(jìn)行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物。設(shè)計具有與線性化載體兩端區(qū)域重疊的引物（上游：CGGGGGACTCTAGAGGATCCATGGGTTCAGCTGCTCCAGA，下游：GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA），通過PCR擴(kuò)增出目的片段（兩端帶有與載體同源的序列），再利用一步克隆重組試劑盒進(jìn)行連接。在冰浴中按以體系（5×CE II Buffer：2μL；線性化載體：3μL（200 ng）；插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物：3μL（50 ng）；Exnase II：1μL；ddH20：1μL） 加入各種試劑后瞬時低速離心，在PCR儀中37℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成放于冰上5 min，然后通過熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。涂布含有50μg·mL-1卡那霉素的板子上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，菌液PCR，鑒定為陽性的提質(zhì)粒測序。測序正確的質(zhì)粒保存于-20℃?zhèn)溆谩?gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞中，用抗性平板篩選，并進(jìn)行PCR鑒定。載體構(gòu)建流程見圖1。

圖1 載體構(gòu)建流程圖Fig.1 The construction process of recombinant plasmid

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)總體系為10μL，包括：5μL HieffTM qPCR SYBR Green Master混合液（裕盛生物技術(shù)有限公司）、1μL cDNA、上下游引物各0.2μL和3.6μL去離子水。熒光定量qPCR反應(yīng)程序：95℃，5 mim；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量。引物為：q-F：ACAGACGCAGTTGTTCTA，q-R：GGTGAATCCAGCATTGTC；擴(kuò)增片段長度為103 bp。選擇actin為內(nèi)參基因，其引物為actin-F：TACCTACAACTCCATCAT和actin-R：TCATCCTGTCAGCTATA。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草構(gòu)建

用花序侵染法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因擬南芥，帶有目的載體的農(nóng)桿菌GV3101菌液接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基（含抗生素）中，28℃和200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，生長至OD600=1～1.5時，將菌液4 000 rpm離心10 min，棄上清液，用5%蔗糖溶液重懸稀釋菌體，使OD600在0.4～0.6之間；向蔗糖菌液中加入0.05%的表面活性劑silwetL-77，作為侵染液；侵染時將擬南芥已開的白色花蕾剪去，用綠色花蕾進(jìn)行侵染。將花蕾放入侵染液中8 min，然后取出擬南芥植株放于暗處24 h，繼續(xù)放回溫室培養(yǎng)，直至種子成熟；轉(zhuǎn)基因種子的篩選：將成熟的種子用75%乙醇和NaClO分別消毒。消毒后鋪在含有含35 mg·L-1卡那霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，4℃純化2 d，觀察擬南芥苗顏色變化，轉(zhuǎn)基因苗能夠正常生長，顏色呈正常的綠色，待生長至4片葉片后移入土培環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，至種子成熟。剪取擬南芥小片葉片用植物DNA快速提取試劑盒提取DNA，用目的基因的引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。

煙草瞬時轉(zhuǎn)化采用注射農(nóng)桿菌GV3101的方法。挑取農(nóng)桿菌GV3101培養(yǎng)至OD600=1～2，轉(zhuǎn)接至含有Rif和Kan的新鮮LB培養(yǎng)基中。28℃培養(yǎng)至OD600=1，4 000 rpm離心10 min，去上清。用infiltration buffer（10 mM MES，150μM的MAs，10 mM的MgCl2）重懸菌體用。P19重懸液OD600=1。用注射器針頭在煙草葉片背面扎小孔，用去針頭的注射器對準(zhǔn)葉片，把菌液注射進(jìn)葉片，直至水漬滿整個葉片，在葉柄上貼上標(biāo)簽。注射后2～3 d進(jìn)行觀測。

1.7 蛋白的生物信息學(xué)分析與進(jìn)化樹構(gòu)建

利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，通過在線軟件ProtParam對PcOMT蛋白的特性進(jìn)行分析，用I-TASSER在線軟件預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)并進(jìn)行PcOMT蛋白的結(jié)構(gòu)建模。利用Clustal W軟件對擴(kuò)增得到的蛋白質(zhì)序列和NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的其他植物來源OMT蛋白序列進(jìn)行同源比對，然后利用MEGA 7.1軟件Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)設(shè)置為1 000，并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆與載體構(gòu)建

利用植物RNA提取試劑盒，提取植物總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板用特異性引物和進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖1所示，PCR擴(kuò)增獲得一條1 116 bp的條帶，與預(yù)期大小一致（圖2 A）。同時擴(kuò)增eGFP片段，大小為726 bp，與預(yù)期一致（圖2 B）。利用重疊延伸PCR將PcOMT和eGFP基因進(jìn)行串聯(lián)融合，得到大小約為1 900 bp的條帶，顯示已經(jīng)將兩條帶融合為一條嵌合基因（PcOMT-eGFP）（圖2C）。用一步克隆試劑盒將所得的融合基因與雙酶切的載體同源重組，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有50μg·mL-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，同時進(jìn)行液體培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，BamH I和Sac I雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，重組載體切為2條帶，其中一條大小為1 900 bp左右，為融合片段（圖2 D）。測序結(jié)果證實PcOMT-eGFP融合片段正確連接至PBI121載體，且沒有發(fā)生突變。

圖2 PcOMT基因的克隆與融合片段的擴(kuò)增與連接載體PBI121Fig.2 Gene clone and construction the fused fragment of PcOMT and eGFPby overlap PCR，and ligated fused fragment to the plasmid of PBI121

2.2 PcOMT蛋白的生物信息學(xué)分析

根據(jù)測序結(jié)果顯示，PcOMT基因有1 116個堿基對組成，編碼371個氨基酸，通過在線軟件Prot－Param對PcOMT蛋白特性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，蛋白分子量為40.95 KDa，等電點為5.95。PcOMT的脂溶指數(shù)為87.57，親水性平均系數(shù)為-0.091，屬親水性蛋白質(zhì)，不穩(wěn)定系數(shù)為39.42，該蛋白的性質(zhì)較穩(wěn)定。在線軟件TMpred預(yù)測結(jié)果表明，在196～219處有跨膜區(qū)（圖3）。

圖3 PcOMT蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatics analysis of PcOMT protein

將PcOMT基因序列利用NCBI的BLAST進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)PcOMT存在兩個植物甲基化酶的保守結(jié)構(gòu)域（圖3-C）。即植物O-甲基轉(zhuǎn)移酶的二聚體結(jié)構(gòu)域（GenBank accession number：cl06920，38Met-85Thr）和AdoMet_MTases超家族（GenBank accession number：cl17173）序列（144Trp-362Phe）結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白具有典型的O-甲基轉(zhuǎn)移酶特征，PcOMT在196～219位氨基酸處有跨膜結(jié)構(gòu)域。用I-TASSER（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)建模，預(yù)測PcOMT蛋白的空間結(jié)構(gòu)如圖3-B，該蛋白50.13%的α-螺旋結(jié)構(gòu)，11.86%的片層結(jié)構(gòu)，38.01%的無規(guī)則卷曲和β折疊。C-score為0.65，模型預(yù)測結(jié)果較為可靠。α-螺旋構(gòu)成了空間結(jié)構(gòu)的主體，這與其他植物中的氧-甲基轉(zhuǎn)移酶一致。序列分析發(fā)現(xiàn)，PcOMT蛋白有5個保守的結(jié)構(gòu)域（I-V）（圖4），其中結(jié)構(gòu)域I（VDVGGGTG）和IV（GKVLII）是S-腺苷-甲硫氨酸（SAM）的結(jié)合位點[16-17]。

圖4 PcOMT蛋白與其他植物O-甲基轉(zhuǎn)移酶的序列對比和保守結(jié)構(gòu)域（I-V）Fig.4 Sequence alignment and conserved domain（I-V）of PcOMT protein and other plant O-methyltransferases

2.3 蛋白序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用Clustal X軟件對PcOMT和其他植物（Jr：胡桃；Qs：高山櫟；Pa：甜櫻桃；Vv：釀酒葡萄；Ha：向日葵）來源的OMTs進(jìn)行同源序列比對，使用Mega 7.1軟件進(jìn)行Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以分析PcOMT蛋白的親緣關(guān)系。

BLAST結(jié)果顯示，PcOMT與其他同源蛋白的序列相似性較低，同源性最高的為山葡萄（Vitis amurensis），達(dá)53.02%，與其他物種的同源性更低。

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，PcOMT蛋白與野甘草（Scoparia dulcis）、釀酒葡萄（Vitis vinifera）、煙草（Nicotiana attenuata）、云杉（Quercus lobata）和向日葵（Helianthus annuus）等植物的同源蛋白相似性較高，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、月季（Rosa Chinensis）和糙葉山黃麻（Parasponia andersonii）等同源蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析PcOMT蛋白的進(jìn)化關(guān)系Fig.5 The phylogenetic tree of PcOMT and other homologous protein

2.4 PcOMT蛋白在煙草和擬南芥中表達(dá)的亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建的融合表達(dá)基因PcOMT-eGFP轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過花序侵染法侵染擬南芥，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因擬南芥。利用瞬時轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染煙草。結(jié)果顯示，PcOMT蛋白得到正確表達(dá)，其在擬南芥和煙草中的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，PcOMT定位在細(xì)胞質(zhì)中。

2.5 PcOMT基因的表達(dá)模式分析

分別提取生長8周的虎杖根、莖和葉的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實時熒光定量PCR分析PcOMT基因在不同組織的表達(dá)水平。結(jié)果顯示PcOMT的表達(dá)水平呈現(xiàn)組織特異性。以葉片中PcOMT基因的表達(dá)水平為對照，在莖中的表達(dá)水平最高，是葉片中的2.94倍，根中次之，是葉片的2.77倍，葉片中表達(dá)水平最低。這與其他植物中的甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)模式一致，PcOMT參與了根、莖中木質(zhì)素的合成，以增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度[18]。

同時，采用UV-B、MeJa和ABA等非生物因素進(jìn)行脅迫，檢測PcOMT基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PcOMT基因在受到UV-B和ABA脅迫時，在收到脅迫2 h時PcOMT的表達(dá)水平達(dá)到最大，8 h表達(dá)水平下降，16 h后表達(dá)水平降到最低。而在受到MeJa脅迫時，PcOMT的表達(dá)水平在2 h和8 h與對照組沒有明顯提高，但在脅迫16 h后，PcOMT的表達(dá)明顯受到抑制。

3 討論

次生代謝產(chǎn)物在植物適應(yīng)環(huán)境過程中發(fā)揮重要作用，也是中藥活性成分的重要來源[19]。次生代謝物的合成途徑復(fù)雜多變，需經(jīng)過多種化學(xué)修飾才能完成?；⒄仁俏覈鴤鹘y(tǒng)的藥用植物，在臨床上有非常廣泛的應(yīng)用。虎杖中的次生代謝產(chǎn)物，包括苯丙烷類、二苯乙烯、黃酮類、生物堿類等化合物，具有藥理作用，對人類健康有益，這些化合物是虎杖的主要活性成分[20]，其合成過程大都需要甲基化修飾。植物中甲基化修飾主要依賴于SAM的O-甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基轉(zhuǎn)移至目標(biāo)化合物的氧原子上，形成甲基化產(chǎn)物，甲基化修飾能夠增加這些次生代謝產(chǎn)物的脂親和性和穩(wěn)定性，影響植物的生長發(fā)育，同時參與植物抵抗各種非生物脅迫[21-22]。

圖6 PcOMT蛋白在煙草和擬南芥中的亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of PcOMT protein in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis thaliana

圖7 PcOMT基因在虎杖不同組織和環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式Fig.7 Expression profiles of PcOMT gene in different tissues and under different environmental stress

由于虎杖基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，至今尚未有精確的基因組信息公布，給其功能基因的研究帶來很大障礙。目前研究的基因主要集中在與苯丙烷代謝途徑相關(guān)的酶（STS、CHS、PAL、C4H和4CL） 和MYB和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子的基因[1]。研究利用虎杖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計引物克隆得到PcOMT基因全長，并將其連接至PBI121真核表達(dá)載體。生物信息學(xué)分析表明PcOMT蛋白具有氧甲基轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域。BLAST和序列分析發(fā)現(xiàn)氧—甲基轉(zhuǎn)移酶在不同植物中序列差異性較大，不同植物來源的氧—甲基轉(zhuǎn)移酶功能上保守，但在序列上并不保守。擬南芥和煙草的轉(zhuǎn)化實驗表明，PcOMT基因得到正確表達(dá)，亞細(xì)胞定位顯示，該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。組織表達(dá)模式證實，該基因是組成型表達(dá)，在莖和根中表達(dá)水平較高，葉片中最低，這與其他植物來源的甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)模式相似，在受到非生物脅迫時表達(dá)水平總體上都有上升趨勢，在脅迫2 h達(dá)到最高，后逐漸下降，顯示甲基轉(zhuǎn)移酶在植物受到非生物脅迫時發(fā)揮了重要作用。虎杖O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達(dá)，為深入研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，也為利用合成生物學(xué)方法生產(chǎn)中藥活性成分提供基因資源。