賈靜 吳建 金媛

肺癌已經成為中國癌癥死亡的主要原因。其中，80%以上肺癌病例為非小細胞肺癌，與小細胞肺癌比較，非小細胞肺癌細胞的生長和分裂速度更快，對鄰近組織的侵襲和遠端轉移更早[1]。此外，超過50%非小細胞肺癌患者在確診時已處于腫瘤晚期，其5年生存率低于15%[2-3]。然而，非小細胞肺癌發(fā)病機制并不完全清楚。因此，探究非小細胞肺癌發(fā)生、轉移的分子機制，尋找可靠診斷和治療靶點是當前亟待解決的重大問題。近年轉錄組和非編碼RNA表達譜研究表明，長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lnRNA)以多種方式調控原癌基因或抑癌基因表達，參與包括非小細胞肺癌在內的多種癌癥的腫瘤生長、侵襲、轉移和耐藥過程[4]。不協調同源基因5B反義RNA1(uncoordinated gene 5B antisense RNA1，UNC5B-AS1)在結腸癌和甲狀腺癌細胞和臨床樣本中表達上調，下調其表達可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲[5-6]。生物信息學分析顯示，miR-300是UNC5B-AS1的潛在靶基因，miR-300已被證實在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌基因作用[7]。然而，UNC5B-AS1在非小細胞肺癌中的表達、生物學功能以及UNC5B-AS1能否靶向miR-300參與肺癌進展仍有待證明。本研究以miR-300為切入點，探討UNC5B-AS1在非小細胞肺癌中的生物學功能和其分子機制，以期為非小細胞肺癌分子治療提供新的靶點。

資料與方法

一、實驗材料

A549細胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)培養(yǎng)液、胎牛血清、Lipofectamine 2000購于美國Invitogen公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購于大連TAKARA生物技術有限公司；UNC5B-AS1小干擾RNA(si-UNC5B-AS1)、無序列陰性對照(si-NC)、miR-300模擬物(miR-300mimics)、mimics陰性對照(miR-NC)、miR-30抑制物(anti-miR-300)、抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、PCR引物、UNC5B-AS1野生型(WT-UNC5B-AS1)或突變型(MUT-UNC5B-AS1)熒光素酶報告基因載體由上海吉瑪制藥公司提供；Transwell小室購于美國corning公司；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑、放射免疫沉淀測定(Radioimmunoprecipitation assay，RIPA)緩沖液、聚偏二氟乙烯膜購于上海碧云天生物公司；兔源細胞周期素D1(CyclinD1)、p21、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、山羊抗兔IgG為美國Abcam公司。

二、組織來源

本研究選取2015年1月至2017年6月于我院進行手術的30例非小細胞肺癌患者(病理類型為鱗癌12例，腺癌10例，腺鱗癌8例；病理分期為T1期15例、T2期9例、T3期6例，N0期13例，N1期10例，N2期7例，均為M0期)，其中男性22例，女性8例，年齡38歲至72歲之間。所有患者術前未接受放療、化療和其他抗腫瘤治療，術中收集腫瘤組織和癌旁組織。本研究得到了醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有患者在術前簽署知情同意書。

三、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測A549細胞中UNC5B-AS1和miR-300的表達

采用Trizol試劑從癌組織、癌旁組織中分離總RNA。利用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，引物序列如下：UNC5B-AS1上游5′-GATCCTGCCTCAGGGAAA-3′,下游5′-GCTCAAGAGGTTGGGACT-3′；GAPDH上游5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′,下游5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；miR-300上游5′-TATACAAGGGCAGACTC-TCTCT-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′利用SYBR Premix Ex Taq在ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀上進行實時PCR分析。采用2-ΔΔCt法計算UNC5B-AS1和miR-300的相對表達水平。

四、細胞培養(yǎng)

細胞復蘇后，采用含10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分數5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細胞，按照1 ∶2比例每兩天換液一次，當細胞融合至80%時進行傳代，去對數期細胞用于實驗。

五、細胞轉染和實驗分組

將對數期A549細胞按2×105cells/接種于6孔板，當細胞融合度達到60%時進行瞬時轉染。利用Lipofectamine 2000將si-NC、si-UNC5B-AS1、miR-NC、miR-300 mimics、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-NC、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-300分別轉染A549細胞，依次命名為si-NC組、si-UNC5B-AS1組、miR-NC組、miR-300組、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-NC組、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-300組。轉染48 h時，收集細胞檢測轉染效果合格后進行后續(xù)實驗。

六、 MTT法檢測A549細胞增殖活力

將各組A549細胞按照5×105cells/孔，100 μL/孔接種到96孔板，每組設置3個復孔，培養(yǎng)24、48、72 h后按照20 μL/孔加入質量濃度為5 g/L的MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，按照150 μL/孔加入DMSO試劑，振蕩10 min使其充分溶解結晶，酶標儀于490 nm處檢測各孔的吸光度值。

七、 Transwell實驗檢測A549細胞遷移和侵襲能力

侵襲實驗：轉染48 h，收集各組A549細胞，消化后用無血清DMEM培養(yǎng)液制備單細胞懸液。取100 μL細胞懸液加入到包被基質膠的Transwell上室；取500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作為化學引誘劑加入24孔板下室。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去Transwell上室未遷移細胞，磷酸鹽緩沖液沖洗后，用甲醇、結晶紫溶液分別對下室膜進行固定和染色。隨機選取3個視野，進行細胞計數，其均值即為侵襲細胞數。采用未包被基質膠的Transwell小室進行遷移實驗，其他步驟同侵襲實驗。

八、Western blot檢測A549細胞CyclinD1、P21、MMP-2和MMP-9蛋白表達

采用RIPA緩沖液提取各組A549細胞總蛋白，BCA法測定其濃度。取30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將分離的細胞蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%的脫脂牛奶溶液封閉膜后，加入稀釋的一抗溶液(MMP-2和MMP-9為1 ∶500，CyclinD1和P21為1 ∶1 000，GAPDH為1 ∶2 000)室溫條件孵育膜1 h，洗膜后，加入稀釋的二抗溶液(1 ∶2 000)室溫條件孵育膜1 h。洗膜后，加入化學發(fā)光試劑顯影。采用目的蛋白與內參蛋白GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

九、統(tǒng)計學分析

結 果

一、lncRNA UNC5B-AS1和miR-300在肺癌組織中的表達

肺癌組織中UNC5B-AS1的表達水平較癌旁組織顯著升高，miR-300的表達較癌旁組織顯著降低(P<0.05)(見表1)。

表1 lncRNA UNC5B-AS1和miR-300在肺癌組織中的表達

二、抑制lncRNA UNC5B-AS1表達對A549細胞增殖的影響

與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細胞UNC5B-AS1的表達顯著降低，提示A549細胞中UNC5B-AS1的表達受到抑制。與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細胞活力、CyclinD1蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)(見表2、圖1)。

表2 抑制lncRNA UNC5B-AS1表達對A549細胞增殖的影響

圖1 增殖相關蛋白表達

三、 抑制lncRNA UNC5B-AS1表達對A549細胞遷移侵襲的影響

與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細胞遷移和侵襲細胞數、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)(見表3、圖2)。

表3 抑制lncRNA UNC5B-AS1表達對A549細胞遷移侵襲的影響

圖2 遷移侵襲相關蛋白表達

四、 miR-300過表達對A549細胞增殖、遷移侵襲的影響

與miR-NC組比較，miR-300組A549細胞miR-300的表達水平顯著升高，提示已成功上調A549細胞miR-300表達。與miR-NC組比較，miR-300組A549細胞在48、72 h細胞活力、遷移和侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)(見表4、圖3)。

表4 miR-300過表達對A549細胞增殖、遷移侵襲的影響

圖3 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

五、 lncRNA UNC5B-AS1靶向調控miR-300的表達(LncBase Predicted v.2)

采用生物信息分析工具LncBase Predicted v.2在線分析顯示，UNC5B-AS1與miR-300之間存在部分連續(xù)互補的核苷酸序列(見圖4)。雙熒光素酶報告實驗顯示，上調miR-300表達可降低WT-UNC5B-AS1熒光素酶報告載體的熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT-UNC5B-AS1活性無顯著影響(見表5)。與pcDNA組比較，pcDNA-UNC5B-AS1組A549細胞miR-300的表達水平顯著降低；與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細胞miR-300的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表6)。

圖4 lncRNA UNC5B-AS1的序列中含有與miR-300互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 lncRNA UNC5B-AS1調控miR-300的表達

六、抑制miR-300表達逆轉了抑制lncRNA UNC5B-AS1表達對A549細胞增殖、遷移侵襲的作用

與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細胞miR-300的表達水平顯著升高，細胞活力、遷移和侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高；與si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC組比較，si-UNC5B-AS1+anti-miR-300組A549細胞miR-300的表達水平顯著降低，細胞活力、遷移和侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著升高，p21蛋白表達顯著降低(P<0.05)(見表7、圖5)。

表7 抑制miR-300表達逆轉了抑制lncRNA UNC5B-AS1表達對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的作用

圖5 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

討 論

近年來，非小細胞肺癌發(fā)病率和死亡率呈升高趨勢，已成為威脅人們健康的公共衛(wèi)生問題[8]。lncRNA是多種生物學過程的關鍵調控因子，大量證據表明，lncRNA的異常表達在腫瘤進展中起著重要作用[4]。因此，探索與非小細胞肺癌增殖、轉移相關的lncRNA，將為臨床非小細胞肺癌治療提供新的靶點。

研究顯示UNC5B-AS1在甲狀腺乳頭狀癌中表達上調，并參與決定組織學腫瘤類型，通過檢測UNC5B-AS1和RP11-547D24.1表達還可區(qū)分PTC不同分期甲狀腺乳頭狀癌患者[9]。通過對癌癥基因組圖譜數據的基因表達譜交互分析，發(fā)現UNC5B-AS1在卵巢癌組織樣本、細胞中也呈高表達，其通過組蛋白甲基化轉移酶2(Histone methyltransferase 2，EZH2)調控N-myc下游調控基因2(NDRG2)上的組蛋白H3在賴氨酸27(H3K27me)甲基化，促進卵巢癌進展，UNC5B-AS1功能缺失將阻礙卵巢癌細胞增殖，促進卵巢癌細胞凋亡[10]。本研究通過RT-qPCR檢測UNC5B-AS1在肺癌組織中表達發(fā)現，肺癌組織中UNC5B-AS1的表達較癌旁組織顯著升高，提示UNC5B-AS1可能參與肺癌惡性進展。于是本研究通過功能缺失實驗檢測證實UNC5B-AS1的生物學功能，結果顯示抑制UNC5B-AS1表達可降低A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與前人報道UNC5B-AS1的致癌作用相一致[5-6]。Cyclin D1和P21是調節(jié)細胞周期進展和細胞增殖的關鍵蛋白，Cyclin D1上調、P21下調促進腫瘤惡性進展[11]。MMP-2和MMP-9可降解細胞外基質，促進腫瘤細胞浸潤周圍組織、擴散轉移[12]。本研究顯示抑制UNC5B-AS1表達后，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著降低，P21蛋白表達增加，與功能分析實驗結果相符。提示，抑制UNC5B-AS1通過下調Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達，上調P21表達進而抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲。

lncRNA通過與特定的miRNA結合降低其表達水平，減輕其對靶基因的抑制作用是其參與調控腫瘤進展的重要機制[13-14]。已有研究發(fā)現，lncRNA Gm15290通過與腫瘤抑制因子miR-615-5p直接相互作用，促進肺癌細胞的增殖和侵襲[15]。lncRNAMAGI2反義RNA3(MAGI2-AS3)通過靶向miR-374a/b-5p抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[16]。本研究中miR-300被選定為UNC5B-AS1的潛在靶基因。探究miR-300在肺癌中作用發(fā)現，肺癌組織中miR-300表達下調，過表達miR-300可降低A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與前人研究結論一致[7]。此外，miR-300在口腔鱗狀細胞癌、肝癌也表達下調，過表達miR-300抑制癌細胞的增殖和轉移[17-18]。進一步分析UNC5B-AS1和miR-300之間關系發(fā)現，miR-300是UNC5B-AS1的靶基因，且上調UNC5B-AS1可抑制miR-300表達，下調UNC5B-AS1則促進miR-300表達。此外，恢復實驗顯示，抑制miR-300表達可逆轉抑制UNC5B-AS1對A549細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。提示UNC5B-AS1直接通過靶向抑制抑癌基因因子miR-300表達，來促進A549細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，UNC5B-AS1在非小細胞肺癌中發(fā)揮癌基因作用。抑制UNC5B-AS1通過上調miR-300可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲。因此，UNC5B-AS1有望成為非小細胞肺癌分子治療的新靶點。