徐海燕 孔玉紅 徐喜媛 楊敬平

作者單位：014010 內(nèi)蒙古 包頭，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)研究所

肺動脈高壓(PH)是一組臨床特征為肺循環(huán)壓力的異常升高，最終導(dǎo)致右心室衰竭和死亡的疾病[1]。根據(jù)病理生理機制、臨床表現(xiàn)、血液動力學(xué)特征及治療方法，PH在臨床上分類，分為五類[1]。低氧啟動的低氧性肺血管收縮及肺血管重塑，致低氧性肺動脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的形成[2]，為PH分類的第3類[1]。當(dāng)?shù)脱鯐r肺血管平滑肌受各種調(diào)節(jié)因素調(diào)控，發(fā)生肺血管重塑時，表明HPH形成[1-2]。近年來，HIF缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-α, HIF-1α)通過調(diào)節(jié)血管生成、紅細胞生成、炎癥和增殖的數(shù)百種基因，在HPH發(fā)病中起關(guān)鍵作用[3]。在HPH發(fā)病中低氧造成的微酸環(huán)境與質(zhì)子感知受體TDAG8相互作用，發(fā)揮重要作用并逐漸引起研究者關(guān)注[4]。本文探討HIF-1α及TDAG8在HPH發(fā)病中的作用，進一步了解HPH發(fā)病新進展。

HPH發(fā)病中肺血管收縮及肺血管重塑的研究

HPH的主要改變?yōu)榈脱跻鸬姆窝苁湛s及肺血管重塑[3]，低氧性肺血管收縮的研究較為深入。急性低氧觸發(fā)廣泛的肺血管收縮，可導(dǎo)致急性右心室后負荷增加[5]。慢性低氧最初發(fā)生肺動脈收縮，從最初的幾個小時就可以啟動缺氧性肺血管重塑的網(wǎng)絡(luò)化病理生理學(xué)改變；隨著低氧時間延長，發(fā)生肺動脈重塑的病理改變，成為HPH的標(biāo)志并決定了HPH的嚴(yán)重程度[5]。病理改變主要為平滑肌細胞增殖和肥大，膠原蛋白和彈性蛋白等細胞外基質(zhì)蛋白沉積增加，外膜或循環(huán)細胞的募集等[5]。

HPH肺血管重塑中，肺動脈內(nèi)皮細胞(pulmonary artery endothelial cells, PAEC)與肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)之間相互作用，導(dǎo)致病變發(fā)生及進展[6]。PAEC具有屏障和分泌作用，急性缺氧時整個肺血管床發(fā)生血管收縮，其中，無肌肉末端小動脈、毛細血管和小靜脈等微血管區(qū)域的PAEC收縮 ，根據(jù)泊肅葉定律，將導(dǎo)致血管阻力增加了34%[7-8]。低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮源信號發(fā)生TRPC6的移位，同時激活PLC和RhoK觸發(fā)PASMC收縮。這種傳導(dǎo)以肌內(nèi)皮連接的形式存在，該連接允許去極化或超極化在相鄰的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞之間擴散，并促進蛋白質(zhì)信號在內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞之間傳導(dǎo)[7-8]。使用磁共振成像發(fā)現(xiàn)低氧時PAEC作為相鄰層流變化和非層流血流變化的傳感器，導(dǎo)致剪切應(yīng)力的變化引起PAEC從基因表達的改變到引起一系列內(nèi)皮功能的改變，如ROS引起RhoA / ROCK的激活、內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)合成異常、釋放血管活性介質(zhì)及多種生長因子，激活HIF-1α表達，均影響平滑肌的生長，導(dǎo)致血管重塑[7-8]。HPH患者的PAEC對生長因子有高度增生作用，并表現(xiàn)出很高的糖酵解率，形成局部微酸環(huán)境，調(diào)節(jié)質(zhì)子感知受體的表達，并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[8]。研究表明，PAEC暴露于高水平的剪切應(yīng)力下，三周會導(dǎo)致高度增殖的表型的發(fā)展，并減少細胞凋亡,并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[8-9]。其中，HIF-1α為近年來在HPH發(fā)病中研究的熱點，在肺血管重塑中起關(guān)鍵作用。

HIF-1α在HPH發(fā)病中的研究進展

大量研究證明，HIF-1α可以通過調(diào)控PASMC細胞內(nèi)離子、離子通道及pH值平衡，調(diào)節(jié)血管生長因子和Warburg效應(yīng)(Warburg effect)及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)影響平滑肌增殖。

急性缺氧導(dǎo)致PASMC細胞內(nèi)鈣離子增加，導(dǎo)致血管收縮，常氧后可恢復(fù)正常。慢性缺氧時鈣離子通道因細胞內(nèi)鈣離子存儲的耗竭而激活，鈣離子內(nèi)流增加，PASMC中基線鈣離子升高，在恢復(fù)常氧后也不能回復(fù)[10]。研究表明[10-11]，PASMC膜中K+通道的開放會增加K+流出，從而引起膜超極化。這關(guān)閉了電壓依賴性Ca2+通道，減少了Ca2+的進入并導(dǎo)致血管舒張。相反，抑制K+通道會導(dǎo)致膜去極化，Ca2+進入，細胞收縮和血管收縮。細胞外酸中毒和低氧下調(diào)或抑制KCNK3基因(編碼外向K+通道)導(dǎo)致PASMC去極化,Ca2+進入產(chǎn)生肺動脈血管收縮并通過激活Ca2+敏感通路使PASMC增殖。小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞KCNK3基因敲低，可使增殖率增加25%，藥理抑制或基因干擾KCNK3可以通過HIF1-α和ERK1/2、AKT和SRC的磷酸化，激活促進PASMC增殖和抗凋亡[11-12]。研究表明：缺氧小鼠的PASMC中，與鈣離子相關(guān)的瞬時受體電位TRPC1和TRPC6 蛋白表達均增加[3]；ET-1表達增高可以增加TRPC1 / TRPC6表達，并抑制了電壓依賴型鉀通道Kv 1.5和Kv 2.1 mRNA和蛋白表達[13]，進行HIF-1α+/-處理后，小鼠在慢性缺氧時PASMC內(nèi)基線鈣離子及TRPC1/TRPC6表達并沒有增加[3, 13-14]。研究發(fā)現(xiàn)：Na(+)/ H(+)交換物(NHE)在慢性低氧小鼠PASMC中的表達和活性增加，并導(dǎo)致PASMC中的pH增加，有助于PASMC肥大和增生信號傳導(dǎo)途徑的激活，這一過程可以被HIF-1α調(diào)節(jié)[15]。

HIF-1α激活編碼血管生成生長因子的轉(zhuǎn)錄，HIF-1α直接與編碼VEGF，基質(zhì)細胞衍生因子(stromal-derived factor 1，SDF-1)，血管生成素2(Angiopoietin 2，ANGPT2)和干細胞因子(Stem cell factor, SCF)的基因的啟動子中的結(jié)合反應(yīng)原件結(jié)合[16-17]。血管生成生長因子(以VEGF為主)依賴性于HIF-1α刺激內(nèi)皮細胞為主的多種血管細胞，這些細胞均有同源受體(VEGFR1或VEGFR2)表達,促血管生成[16]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)，其關(guān)鍵的調(diào)節(jié)途徑之一是表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)途徑。它可以通過VEGF及NDRG3/Raf-ERK途徑促進血管重塑[16-17]；調(diào)節(jié)EGFR信號通路的VEGF表達的主要下游通路是PI3K-AKT，RAS-MAPK和JAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這三個轉(zhuǎn)錄因子與VEGF-A mRNA的啟動子結(jié)合，然后促進VEGF-A mRNA的表達并增加VEGF-A的分泌[17]。調(diào)節(jié)該下游信號傳導(dǎo)途徑的重要因子是HIF-1α、STAT及轉(zhuǎn)錄因子第二成分1(SP1)[16-17]。

HPH的PAEC也會發(fā)生從氧化代謝到糖酵解的HIF-1α依賴性重編程。HIF-1α還可通過Warburg效應(yīng)，促進PASMCS增殖。低氧條件下導(dǎo)致HIF-1α的積累，抑制了丙酮酸進入線粒體完成氧化磷酸化，大部分通過細胞質(zhì)中乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為乳酸。研究表明[18]，PDGF可通過PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增強Warburg效應(yīng)促進PASMC增殖，參與肺動脈高壓的形成。乳酸可通過低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化，促進VEGF的表達，產(chǎn)生增殖作用[18]。

炎癥也參與了HPH的發(fā)病，低氧及HIF-1α均可參與先天免疫及獲得性免疫的調(diào)節(jié)。T細胞受體/ CD3抗原復(fù)合物可激活HIF-1α表達。細胞葡萄糖代謝和脂肪代謝在T細胞分化為輔助性T細胞17 (helper T cells17，Th17)/調(diào)節(jié)性T細胞的過程中起著重要作用，HIF-1α調(diào)節(jié)Th17細胞/調(diào)節(jié)性T細胞之間的平衡[19]。輔助性T細胞17和維持/調(diào)節(jié)性T細胞失衡可通過ROCK信號通路影響STAT3/STAT5磷酸化,導(dǎo)致PASMCS的增殖[19]。在慢性低氧時，大鼠血清IL-6的增加，并通過JAK2 / STAT3途徑的激活誘導(dǎo)MMP-9的上調(diào)；STAT3抑制劑可下調(diào)MMP-9表達，并減弱缺氧誘導(dǎo)的微血管變化，表明IL-6/JAK2/STAT3/MMP-9途徑參與低氧微血管增殖調(diào)節(jié)及肺血管重建[20]。NF-κB的活性受NF-κB(IκB)激酶(IKK)抑制劑(主要是IKKβ)的調(diào)節(jié)，以響應(yīng)感染性或炎性刺激。在缺氧條件下，NF-κB有助于增加HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄,HIF-1α介導(dǎo)了缺氧條件下的中性粒細胞的NF-κB激活和促進NF-κB調(diào)節(jié)的細胞因子TLR4的表達。低氧情況下，缺氧誘導(dǎo)因子HIFα和HIF-β亞基移位至細胞核，以異二聚體的形式與缺氧反應(yīng)啟動子元件(HRE)結(jié)合，誘導(dǎo)多基因的轉(zhuǎn)錄，包括NF-κB和TLRs的表達[21]。在MDSC(髓樣來源的抑制細胞)中，低氧條件下，HIF-1α與PD-L1(程序性死亡配體)近端啟動子中的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，直接靶向，使細胞產(chǎn)生IL-6、IL-10[22]。許多研究證實，丙酮酸激酶在糖酵解中具有關(guān)鍵作用，在LPS活化的巨噬細胞中可通過HIF-1α調(diào)節(jié)IL-1β表達[23]。研究表明：低氧時PAEC上調(diào)IL-33及其受體ST2表達，以ST2依賴性方式激活HIF-1α/ VEGF軸，引發(fā)血管平滑肌細胞重塑[24]。

HIF-1a可通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行自身調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)[25]，已知HIF-1a受生長因子、細胞因子和細胞分裂素的調(diào)節(jié)，低氧條件下，可通過MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、cAMP/PKA、NF-kB等通路可誘導(dǎo)HIF-1a的活化。研究證實HIF-1α的表達依賴于表皮生長因子。表皮生長因子與表皮生長因子受體，激活PI3K/aKT信號通路，誘導(dǎo)HIF1α的穩(wěn)定表達。在低氧環(huán)境下，EGFR/Akt/mTOR通路是已知的HIF1a的正向調(diào)節(jié)因子。有研究表明,FAT1是跨膜蛋白,定位在人類染色體4q34-35上，缺氧條件下FAT1在HIF-1a表達中的上游起調(diào)控作用[17, 25]。

質(zhì)子感知受體TDAG8的作用及在HPH發(fā)病中的研究進展

G蛋白偶聯(lián)受體家族(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)是一類膜蛋白受體的總稱，包括OGR1、GPR4、G2A和TDAG8等質(zhì)子感知受體，這類受體在正常組織細胞包括心、腦、肺、腎等臟器及人的各種腫瘤細胞中廣泛分布，被細胞外酸化激活，促進離子穩(wěn)態(tài)和對穩(wěn)態(tài)干擾(如酸堿平衡)的適應(yīng)性反應(yīng)，其中的GPR4和TDAG8對質(zhì)子感知最強[4]。膜蛋白受體上，大多數(shù)蛋白質(zhì)的可電離殘基在pH 5～7.4之間恒定帶電，對生理pH值變化不敏感，GPCR包含可電離的殘基傳感器(pH傳感器)，包括天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸五個氨基酸可以檢測質(zhì)子，這些殘基可響應(yīng)生理pH的變化而不充電，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞外質(zhì)子信號，以激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，并引發(fā)適當(dāng)?shù)募毎麘?yīng)答[26]。TDAG8的pH傳感器以酸性三聯(lián)體的出現(xiàn)，并且GPR4和GPR68都可以通過受體胞外域上、組氨酸殘基調(diào)節(jié)三聯(lián)體，誘導(dǎo)構(gòu)象變化，激活G蛋白和下游信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及平滑肌增殖[26]。細胞可以通過多種分子傳感器來感知細胞外酸化，如酸敏感離子通道(ASIC)，瞬時受體電位和質(zhì)子感知受體(TDAG8及OGR1)激活多個G蛋白信號通路和下游信號傳導(dǎo)，引起肺血管收縮及肺血管重塑[4,26]。TDAG8在酸性環(huán)境中敏感度最高，且在受體內(nèi)廣泛分布，參與介導(dǎo)多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是目前值得關(guān)注的明星受體[4]。酸中毒對質(zhì)子感應(yīng)GPCR的激活可轉(zhuǎn)導(dǎo)多個下游G蛋白信號通路，四個GPCR中的每一個都與一個或多個G蛋白偶聯(lián)：GPR4(Gs，Gi/o，Gq /11和G12/13)，GPR65(Gs)，GPR68(Gs和Gq /11)和GPR132(Gs和G12/13)[4,26-27]。研究表明，TDAG8主要分布在增殖細胞核抗原(PCNA)陽性的血管平滑肌細胞中，TDAG8基因沉默可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，在過表達TDAG8的血管平滑肌細胞中，cAMP水平升高且促進其增殖，表明TDAG8通過cAMP / PKA信號通路影響血管的重塑[28]

缺氧和炎癥在以多種方式相互影響，炎癥可由缺氧引起的，缺氧通過調(diào)節(jié)HIF-1α加重炎癥，通過Warburg效應(yīng)使葡萄糖代謝為乳酸產(chǎn)生局部組織微酸環(huán)境，酸性環(huán)境不僅是炎癥的結(jié)果，還誘導(dǎo)病理差異轉(zhuǎn)錄程序相關(guān)基因產(chǎn)生促炎細胞因子表達，進一步調(diào)節(jié)生長因子、影響凋亡，導(dǎo)致肺血管平滑肌增殖[18,29]。Vallière研究團隊發(fā)現(xiàn)，缺氧通過HIF-1α的穩(wěn)態(tài)來改變厭氧葡萄糖組織代謝中pH的表達，正向調(diào)節(jié)GPCR的表達，證實了HIF-1α對GPCR的表達有調(diào)節(jié)作用[30],且可通過Warburg效應(yīng)促進PASMCS增殖[18]。TDAG8在巨噬細胞、中性粒細胞以及T細胞和B細胞分布廣泛，可調(diào)節(jié)巨噬細胞中胞外酸化誘導(dǎo)的炎性細胞因子、中性粒細胞中超氧陰離子的產(chǎn)生和嗜酸性粒細胞的存活反應(yīng)[28-29]，TDAG8與Gs結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)，磷酸化的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合(pCREB)蛋白水平上調(diào)，通過PI3K-AKT信號通路及NF-KB信號通路調(diào)節(jié)炎癥細胞的凋亡，并通過前述的炎癥機制參與HPH發(fā)病過程[19-22，29,31-32]。研究表明，TDAG8通過趨化因子的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)炎癥水平影響肺血管重塑，例如影響C-C基序趨化因子22配體(CCL22)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-25的表達[33]。研究表明，TDAG8在HPH大鼠肺組織、肺血管和外周血明顯組增加，且校正分析結(jié)果進一步提示TDAG8在肺組織、肺血管和外周血中具有高表達一致性。該研究表明，HPH模型大鼠TDAG8通過不同途徑調(diào)節(jié)CCL22、TNF-α、IL-25表達[33]。CCL22參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程，與趨化因子受體CCR4結(jié)合，激活T淋巴細胞等，TNF-α與促炎細胞因子的產(chǎn)生有關(guān)，IL-25通過Th2淋巴細胞誘導(dǎo)NF-κB、IL-5、IL-8等炎癥因子細胞導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，參與了HPH的發(fā)生[33]。表明TDAG8通過缺氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在HPH發(fā)病中起重要作用。PAEC攝取的乳酸可激活上調(diào)IL-8依賴性的PASMC增殖，并且乳酸使HIF-1α上調(diào)，促進VEGF相關(guān)PASMC增殖[34]。實驗表明：低氧導(dǎo)致的酸性環(huán)境中，TDAG8顯著促進了HIF-1a的表達,HIF-1通過羧酸轉(zhuǎn)運體( monocarboxylate transporters，MCTs)，將乳酸轉(zhuǎn)運出細胞，造成細胞外的酸性微環(huán)境，從而誘導(dǎo)酸性環(huán)境敏感質(zhì)子感知受體TDAG8表達激活，由此形成HIF-1α及TDAG8的正反饋通路，共同在HPH發(fā)病中起作用[34-35]。上述研究表明TDAG8在低氧及酸性環(huán)境中對HPH發(fā)病起重要作用，HIF-1α與TDAG8相互調(diào)節(jié)在HPH發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。

目前，有關(guān)HIF與TDAG8相互作用調(diào)節(jié)HPH的研究較少，但由于低氧導(dǎo)致的微酸環(huán)境中，TDAG8可以調(diào)節(jié)多種肺血管變化，必然與HPH主要的調(diào)節(jié)因素HIF產(chǎn)生相互作用，對于HIF-TDAG8相互影響的探討將有助于開拓HPH發(fā)病機制研究新思路。