謝 飛 王洪斌 張瀚文 郭偉紅 劉鵬年△

1.河北一洲腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科 (河北 涿州, 072750) 2.河北省涿州市醫(yī)院檢驗(yàn)科

肝細(xì)胞癌(HCC)是指起源于肝細(xì)胞的一種常見惡性腫瘤[1]。在我國(guó)惡性腫瘤中，HCC的發(fā)病率位于第3位，病毒性肝炎是其主要的發(fā)病原因[2]。HCC的早期癥狀不明顯，一旦出現(xiàn)癥狀，大多數(shù)已屬晚期。HCC主要致死原因是腫瘤進(jìn)展后出現(xiàn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等，而腫瘤間質(zhì)中存在著炎癥和免疫的微環(huán)境，這種微環(huán)境會(huì)為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)、增殖和浸潤(rùn)等腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供可能[3]。白細(xì)胞介素34(IL-34)是一種新型的細(xì)胞因子，其促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化和增殖的原因在于IL-34與巨噬和單核細(xì)胞表面所存在的集落刺激因子受體(CSF-1R)結(jié)合[4，5]。本研究旨在探討IL-34在HCC中的差異表達(dá)，并分析其臨床意義，以期為臨床診斷治療HCC提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取2017年8月至2019年12月住院的HCC患者54例，肝良性腫瘤患者21例，其中HCC患者均經(jīng)過(guò)肝切除后送病理檢查后確診。HCC患者中男性38例，女性16例；年齡34～69歲，平均(51.22±12.35)歲；肝良性腫瘤患者中男性14例，女性7例；年齡32～71歲，平均(52.73±14.79)歲。

1.2 標(biāo)本收集 術(shù)前抽取空腹患者全血樣本6 ml，4℃下4 000 r/min離心10 min，收集血清，置于-80℃冰箱備用。術(shù)后采集患者手術(shù)切除的HCC組織、相應(yīng)癌旁組織(采自癌旁1 cm外)以及良性腫瘤組織標(biāo)本。將組織樣本快速存于液氮中，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 Trizol逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司；Anti-IL-34兔抗人多克隆抗體和IL-34的ELISA試劑盒均由美國(guó)Abcam公司提供；PCR引物購(gòu)自北京擎科公司；實(shí)時(shí)PCR儀和生化檢測(cè)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.4 ELISA檢測(cè)血清中IL-34表達(dá)水平 將-80℃冰箱中保存的血清室溫下自然解凍，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書的步驟，使用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-34的水平。

1.5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)IL-34 mRNA的表達(dá)水平 IL-34引物序列：反向5′-GCAGAAAACCCGTGACAGT-3′，正向5′-GGAATGAGCCTTTGGAGAT-3′。GAPDH引物序列：正向5′-TGTGTCCGTC-GTGGATCTGA-3′，反向5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。按照試劑盒說(shuō)明書，用Trizol提取樣品RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR檢測(cè)，即向各管中加入含染料2×Ex TaqMix 12.5 μl，再加入10 μmol/L引物混合物0.75 l(即對(duì)應(yīng)的cDNA各1 μl)，向管中補(bǔ)加雙蒸餾水，使總體積為25 μl，預(yù)留一管用作陰性對(duì)照(不加模板)?；靹蚝笾糜赑CR儀中95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 15 s，65℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。測(cè)定PCR產(chǎn)物的濃度和純度，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照2-△△Ct方法來(lái)分析，△△Ct=△Ct(IL-34)-△Ct(GAPDH)。

1.6 Western Blot檢測(cè)IL-34蛋白的表達(dá)水平 將-80℃冰箱中保存的組織樣本室溫下自然解凍后加入細(xì)胞裂解液制備成勻漿液，高速離心后取上清液和緩沖液混勻后待用；配制分離膠和積層膠，蛋白上樣后，電泳將蛋白轉(zhuǎn)置于硝酸纖維素膜上；加入Anti-IL-34兔抗人多克隆抗體進(jìn)行孵育，孵育完成后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。表達(dá)水平使用組織蛋白表達(dá)量與內(nèi)參(β-actin)表達(dá)量的比值來(lái)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 HCC和良性腫瘤患者外周血清中IL-34的水平比較 檢測(cè)結(jié)果顯示HCC和良性腫瘤患者外周血清中IL-34的水平分別為(6.84±0.53)和(3.64±0.42)pg/ml，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34 mRNA的表達(dá)水平比較 見表1。

表1 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34 mRNA的表達(dá)水平比較

2.3 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34蛋白的表達(dá)水平比較 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-34蛋白在HCC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，良性腫瘤組織中IL-34基本不表達(dá)，見圖1。

圖1 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34蛋白的表達(dá)水平 1：HCC組織；2：癌旁組織；3：良性腫瘤組織

3 討論

IL-34是一種新型的細(xì)胞因子，存在于人體中的大多數(shù)器官組織中[6,7]。IL-34可結(jié)合CSF-1R，從而被認(rèn)為是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的有效激活劑。IL-34和CSF-1有許多共同的功能特性，兩者通過(guò)共同的受體介導(dǎo)單核吞噬細(xì)胞的生物學(xué)行為[8,9]。IL-34引起的巨噬細(xì)胞異?；罨c許多疾病有關(guān)，參與了眾多的炎癥過(guò)程，如Chemel等[10]報(bào)道滑膜IL-34表達(dá)水平與滑膜炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；IL-34在慢性丙型肝炎患者中表達(dá)明顯升高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)IL-34可以促進(jìn)和激活相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，從而導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生發(fā)展[11]。

本研究結(jié)果表明HCC患者血清細(xì)胞因子IL-34水平明顯升高，提示IL-34參與HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程并起了一定作用。通過(guò)Western Blot檢測(cè)HCC患者HCC組織和癌旁組織，以及良性腫瘤患者肝組織中IL-34蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明HCC患者HCC組織中IL-34的蛋白相對(duì)表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁組織及良性腫瘤組織(P<0.05)，證實(shí)了IL-34在蛋白水平參與了HCC的病理過(guò)程。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)HCC組織和癌旁組織，以及良性腫瘤組織中IL-34 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明HCC組織中IL-34的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁組織及良性腫瘤組織(P<0.01)，證實(shí)了IL-34在基因水平也參與了HCC的病理過(guò)程。AKT和ERK1/2信號(hào)通路及IL-1β、IL-6 和TNF-γ等重要的細(xì)胞因子參與HCC相關(guān)病理過(guò)程，被認(rèn)為是HCC治療的新靶點(diǎn)[12-14]。而IL-34與這些信號(hào)通路的關(guān)系密切，Zhou等[15]研究發(fā)現(xiàn)在成纖維細(xì)胞中，IL-34通過(guò)激活下游信號(hào)，例如MAPK、PI3K-Akt、JAK和NF-κB，上調(diào)IL-6、IL-8的表達(dá)。研究結(jié)果提示IL-34可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中是一個(gè)重要的角色，但是IL-34在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的探索。