陳 燕 吳英姿 羅紹駒 胡 浩 莫灼錨 張詩軍△

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科 (廣東 廣州，510630) 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科

隨著社會壓力的增加和生活節(jié)奏的加快，越來越多的人表現(xiàn)出脾虛相關(guān)癥狀，而研究發(fā)現(xiàn)脾虛導(dǎo)致的內(nèi)環(huán)境變化可能為腫瘤生長提供有利的土壤，正如《衛(wèi)生寶鑒》所云“凡人脾胃虛弱，飲食不節(jié)或生冷過度，不能克化，致積聚結(jié)塊”[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，脾虛內(nèi)環(huán)境中有機陰離子轉(zhuǎn)運肽(Oatp)2b1的分布及功能發(fā)生改變，此變化是脾虛濕濁轉(zhuǎn)運障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，且與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2-4]。腫瘤干細胞(CSCs)干性的表達被認為是腫瘤發(fā)病、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，研究發(fā)現(xiàn)機體受到內(nèi)環(huán)境影響產(chǎn)生不同的腫瘤微環(huán)境，可能引發(fā)CSCs相關(guān)信號通路和表面分子標(biāo)志物發(fā)生改變，其“干性”也可能隨之發(fā)生變化[5,6]，但脾虛內(nèi)環(huán)境變化對肝癌CSCs干性的影響鮮有報道。本研究將觀察脾虛內(nèi)環(huán)境變化對CSCs干性及其相關(guān)信號通路PTEN/AKT的影響，進一步探討脾虛內(nèi)環(huán)境與肝癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞 SPF級C57BL/6小鼠60只(體重18～22 g，5～6周齡，雄性)以及Hepa1-6小鼠肝癌細胞株，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號[SYXK(粵)2013-0002]。所有小鼠飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF環(huán)境。本實驗嚴(yán)格遵守實驗動物福利和倫理原則，并通過廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心實驗動物倫理委員會倫理審查(No.13201711-20)。

1.2 試劑和儀器 利血平購于Sigma公司。DMEM、Trypsin-EDTA、血清購于Gibco公司。Transwell板和Matrigel膠購于Corning公司。CCK8試劑盒購于北京金式金生物科技有限公司。主要使用儀器如下：超凈工作臺(蘇靜集團，SW-CJ-2FD)，生物安全柜(蘇靜集團，BHC-1300IIA/B3)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，3111)，低溫冷凍離心機(Thermo，ST16R)，臺式低速離心機(湖南滬康，TDZ5-WS)，顯微鏡(OLYMPUS，BX61)，顯微境成像系統(tǒng)(OLYMPUS，DP72)，研究級倒置顯微鏡(mshOt，MF51)，臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀，TGL-16)，熒光PCR儀(Bio-Rad，CFX96)。

1.3 動物分組及脾虛模型建立 所有小鼠在廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)1周后隨機分為A組(空白組)、B組(脾虛組)、C組(肝癌組)、D組(脾虛肝癌組)，每組15只。B組和D組小鼠給予0.1 mg/kg利血平皮下注射，A組和C組小鼠則皮下注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d，根據(jù)脾虛積分表評分，脾虛模型成模率100%[7]。

1.4 磁珠分離法分選CD133+Hepa1-6細胞 將培養(yǎng)好的2×107個Hepa1-6小鼠肝癌細胞加入300 μl磷酸緩沖液(PBS+0.5% BSA+2mmol/L EDTA)，加入100 μl FCR Block緩沖液，再加入100 μl CD133磁珠，輕輕混勻后在冰上孵化30 min，用磷酸緩沖液洗一遍。將柱子放在分離架上，用磷酸緩沖液濕潤后，再加入樣品，然后用磷酸緩沖液洗柱子3次；再將柱子放入15 ml離心管，加入1 ml磷酸緩沖液，快速推入，離心后收集CD133+Hepa1-6細胞培養(yǎng)備用[8]。

1.5 脾虛肝癌模型建立 參照前期研究建立脾虛肝癌小鼠模型[9]。將C組和D組小鼠麻醉，碘伏消毒，沿左肋緣下方開腹，切口控制1 cm左右，暴露肝臟左葉；以無菌微量進樣器抽取分選好的小鼠肝癌細胞CD133+Hepa1-6細胞，調(diào)整細胞密度為5×107個/ml，緩慢注射入肝臟，20 μl/只，無菌棉簽壓迫30 s，關(guān)閉腹腔縫合。SPF環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)28 d后，麻醉動物后頸椎脫臼處死，取肝組織和癌組織用于后續(xù)實驗。

1.6 肝癌組織CD133+細胞培養(yǎng) 將C組和D組新鮮的肝癌組織用1× Hank′s液洗滌后剪碎，加入4 ml 0.5% dispase酶4℃消化過夜，離心棄上清后再加入0.25%胰蛋白酶37℃消化15 min，離心過篩網(wǎng)，收集沉淀，用10% DMEM培養(yǎng)3 d傳代繼續(xù)培養(yǎng)。參照1.4方法分選CD133+肝癌細胞并培養(yǎng)。

1.7 CD133+肝癌細胞體外增殖實驗 CD133+肝癌細胞按1×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)24 h后進行CCK8檢測，每孔加入10 μl CCK8試劑，37℃、5% CO2條件孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光值OD。

1.8 CD133+肝癌細胞侵襲和遷移實驗 將Matrigel膠平鋪于小室24孔板上，室溫下孵育1 h，待膠凝固后出現(xiàn)白色層使用。Transwell板中的下室加入10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。將生長為對數(shù)期的CD133+肝癌細胞胰酶消化后，無血清培養(yǎng)液清洗、重懸后，調(diào)為5×105個/ml濃度，在上室內(nèi)進行接種，每孔中加入200 μl 細胞稀釋液(1×105個細胞)，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)16 h后，顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)進入下室的細胞數(shù)量。

1.9 肝臟和肝癌組織CD133、PTEN、AKT及Oatp2b1 mRNA水平檢測 采用熒光定量Real Time PCR方法檢測，基因庫查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計引物，引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，98℃ 5 min，10℃。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，然后95℃ 5 s、62℃ 30 s、72℃ 1 min，40循環(huán)，然后95℃ 15 s，55℃ 1 min，95℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重和腫瘤體積觀察 D組和C組由于腫瘤的生長而體重較A、B組增大。與C組相比，D組小鼠的體重和腫瘤體積明顯增大(P<0.01)。見圖1。

圖1 腫瘤體積和小鼠體重比較 (與C組比較，*P<0.01)

2.2 CD133+肝癌細胞體外增殖能力觀察 癌組織分離出CD133+細胞進行體外增殖，3 d后D組CD133+肝癌細胞OD值明顯高于C組，說明脾虛肝癌組小鼠癌組織分選出的CD133+肝癌細胞增殖更快(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖2 兩組CD133+肝癌細胞體外增殖能力比較(與C組比較，*P<0.05，**P<0.01)

2.3 CD133+肝癌細胞遷移和侵襲能力觀察 遷移和侵襲實驗中，小室內(nèi)D組小鼠CD133+肝癌細胞數(shù)明顯高于C組，即脾虛肝癌組CD133+肝癌細胞遷移和侵襲能力明顯強于肝癌組(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組CD133+肝癌細胞遷移和侵襲能力比較(與C組比較，*P<0.05)

2.4 各組肝臟和癌組織中Oatp2b1、CD133、PTEN和AKT mRNA表達情況 與A組相比，Oatp2b1 mRNA在B組、C組和D組肝組織以及D組癌組織中表達升高(P<0.01)；與C組相比，D組肝組織中Oatp2b1 mRNA表達明顯降低，而癌組織中則表達明顯升高(P<0.01)。見圖4。在癌組織中，與C組相比，D組CD133 mRNA表達明顯升高(P<0.01)，PTEN mRNA表達降低(P<0.05)，而AKT mRNA的表達也明顯升高(P<0.01)，見圖5。

圖4 Oatp2b1 mRNA在各組肝組織和癌組織中的比較(與A組比較，*P<0.01；與C組比較，#P<0.01)

圖5 CD133、PTEN和AKT mRNA在癌組織中的比較(與C組比較，*P<0.05，**P<0.01)

3 討論

肝癌的死亡率位居全球腫瘤第3位，目前通過早發(fā)現(xiàn)早治療，肝癌患者生存期顯著延長，但腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者死亡的重要原因，目前研究證實肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移后5年死亡率高達70%以上，迫切需要更加完善的理論認識和治療手段[10]。研究表明機體內(nèi)環(huán)境變化與癌基因、抑癌基因、黏附因子、免疫調(diào)節(jié)等因素密切相關(guān)，除了受遺傳影響，大部分腫瘤是機體內(nèi)外環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，機體內(nèi)環(huán)境發(fā)生有利于腫瘤細胞生長的變化在腫瘤發(fā)病機制中起著極其重要的作用[11]。著名中醫(yī)腫瘤專家于爾辛提出“肝癌的本是脾虛”的學(xué)術(shù)觀點，并證實以脾為主辨證治療，可以改善荷瘤機體整體狀況，形成不利于肝癌生長的內(nèi)環(huán)境，通過改善“患癌的土壤”而預(yù)防轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)脾虛小鼠Oatp2b1表達發(fā)生變化，且脾虛內(nèi)環(huán)境促進小鼠肝癌的生長，但其具體機制尚不明確。

本研究采用利血平皮下注射法構(gòu)建脾虛小鼠模型，小鼠出現(xiàn)精神疲倦、形體消瘦、食欲下降、大便稀溏等癥狀，說明脾虛模型建模成功[7]。在脾虛基礎(chǔ)上，建立小鼠原位移植肝癌模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾虛肝癌小鼠腫瘤體積明顯大于非脾虛肝癌小鼠，脾虛肝癌小鼠的體重也隨著腫瘤的增大而明顯增加，神疲、食欲下降等癥狀也較肝癌組明顯。由此可見脾虛內(nèi)環(huán)境有利于小鼠肝癌生長和發(fā)展。

Oatp2b1是人和動物體內(nèi)重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，在有機陰離子的轉(zhuǎn)運中起著重要作用，介導(dǎo)內(nèi)、外源物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，對保持機體和細胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡起重要作用，Oatp2b1功能失調(diào)，將引起“濕濁”的吸收、分布和排泄障礙而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[3]。我們前期研究Oatp2b1可能是脾虛濕濁內(nèi)環(huán)境下肝癌發(fā)生和發(fā)展的“因濕致瘀”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其在各組織中的表達異常導(dǎo)致濕邪不能正常外排瘀阻于肝，從而促進肝癌發(fā)生和發(fā)展[2, 4]。在本研究中，脾虛狀態(tài)下濕濁轉(zhuǎn)運障礙，機體發(fā)生代償反應(yīng)，故脾虛小鼠肝組織Oatp2b1 mRNA的表達高于空白組。在肝癌造模成功后，脾虛肝癌組肝組織Oatp2b1 mRNA表達低于非脾虛肝癌小鼠肝組織，提示脾虛內(nèi)環(huán)境下肝組織Oatp2b1功能下調(diào)，機體內(nèi)濕濁等毒素排泄障礙。我們還觀察到肝癌組癌組織Oatp2b1 mRNA表達低于肝組織；而脾虛肝癌組癌組織中，Oatp2b1 mRNA表達則高于肝組織，且明顯高于非脾虛肝癌小鼠癌組織。此結(jié)果表明脾虛內(nèi)環(huán)境中，癌組織Oatp2b1 mRNA表達發(fā)生代償性反應(yīng)而升高，在非脾虛肝癌小鼠體內(nèi)則沒有出現(xiàn)該現(xiàn)象。以上結(jié)果提示機體脾虛內(nèi)環(huán)境中Oatp2b1發(fā)生了變化，這種變化可能是導(dǎo)致脾虛有利于肝癌發(fā)生的重要原因。

越來越多的研究證實，肝癌CSCs自我更新、分化和增殖是肝癌發(fā)生和惡化的根源[13]。CSCs隱藏在腫瘤中，不易被識別和清除，是通過細胞表面標(biāo)志物的表達來識別的，而CD133是肝癌CSCs的生物標(biāo)志物之一[14]。腫瘤微環(huán)境是CSCs生長的“土壤”，微環(huán)境是受機體內(nèi)環(huán)境影響的，機體受到內(nèi)環(huán)境影響產(chǎn)生不同的腫瘤微環(huán)境，引發(fā)CSCs相關(guān)信號通路和表面分子標(biāo)志物改變，導(dǎo)致CSCs與非CSCs之間存在動態(tài)的相互轉(zhuǎn)換，機體內(nèi)環(huán)境改變可能導(dǎo)致CSCs的增加[15]。靖林林等[16]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制和能量代謝障礙在病機上以脾虛為主，腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞進行了重新編程，是癌毒轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，并賦予CSCs分化潛能和干性，CSCs是至虛之處的毒根深藏。本研究結(jié)果顯示，脾虛肝癌組癌組織CD133+肝癌細胞體外增殖、遷移和侵襲能力明顯高于肝癌組，提示脾虛內(nèi)環(huán)境變化促進了肝癌CSCs干性能力的發(fā)揮。

研究證實CD133+肝癌細胞具有高度致瘤性，在肝癌的生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，被認為是難以從根源上清除肝癌細胞的重要原因[17]。我們對癌組織中的CD133 mRNA進行了檢測，結(jié)果顯示脾虛肝癌小鼠癌組織CD133 mRNA表達明顯高于非脾虛肝癌小鼠，提示脾虛內(nèi)環(huán)境有利于CD133+肝癌細胞生長。

磷酸酶及第10號染色體缺失的張力蛋白同源區(qū)(PTEN)是機體內(nèi)一個重要的抑癌基因，在干細胞的自我更新、基因組的穩(wěn)定性方面起著重要作用，PTEN的異常表達與腫瘤侵襲和不良預(yù)后密切相關(guān)。AKT通路負責(zé)由磷脂酰肌醇-3羥基激酶始動的生物信息的傳導(dǎo)，其活化可促進腫瘤細胞生長、增殖和血管生成，促進侵襲和轉(zhuǎn)移。PTEN通過下調(diào)磷脂酰肌醇依賴性激酶AKT的活化來實現(xiàn)其抑癌作用，PTEN/AKT信號通路失衡在維持CSCs的干性方面發(fā)揮重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，與肝癌組相比，脾虛肝癌組小鼠癌組織PTEN mRNA表達降低，而AKT mRNA表達則明顯升高，提示脾虛內(nèi)環(huán)境中抑癌基因PTEN表達被下調(diào)，PTEN/AKT信號通路失衡，導(dǎo)致AKT活化，此現(xiàn)象可能是脾虛內(nèi)環(huán)境中CD133+肝癌細胞生長及其干性能力增強的原因之一。

綜上所述，本研究提示脾虛內(nèi)環(huán)境有利于肝癌發(fā)生和發(fā)展，可能與脾虛濕濁轉(zhuǎn)運障礙的內(nèi)環(huán)境中PTEN/AKT信號通路失衡促進肝癌細胞干性能力發(fā)揮有關(guān)，脾虛內(nèi)環(huán)境可能是肝癌干細胞生長的有利土壤。但仍需進一步探討其他肝癌干細胞標(biāo)志物的表達情況，而脾虛內(nèi)環(huán)境變化Oatp2b1表達異常是否參與調(diào)控PTEN/AKT信號通路仍需進一步研究。