莫瑾 王哲 周慧平 朱宏建 朱水芳 廖曉蘭

摘要 ：對(duì)水稻中多種病原細(xì)菌的檢測(cè)，使用常規(guī)方法往往耗時(shí)耗力，而多重PCR可以更加高效地進(jìn)行多種細(xì)菌的檢測(cè)。根據(jù)水稻細(xì)菌性谷枯病菌gyrB基因，水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌PfsI/R quorum sensing 位點(diǎn)以及水稻細(xì)菌性條斑病菌和水稻白葉枯病菌含鐵細(xì)胞接受因子基因設(shè)計(jì)引物，建立4種水稻病菌的多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)方法進(jìn)行特異性和靈敏度測(cè)試，并對(duì)采自不同地區(qū)的水稻樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，多重PCR方法能同步地快速檢測(cè)出水稻細(xì)菌性谷枯病菌、水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌或水稻白葉枯病菌，檢測(cè)靈敏度達(dá)到103 cfu/mL的菌液濃度，利用該方法對(duì)我國(guó)不同地區(qū)的58份水稻種子進(jìn)行檢測(cè)，其中17個(gè)樣本檢測(cè)出水稻細(xì)菌性條斑病菌或水稻白葉枯病菌，未檢測(cè)到水稻細(xì)菌性谷枯病菌和水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌。

關(guān)鍵詞 ：多重PCR; 水稻病原細(xì)菌; 檢測(cè)

中圖分類號(hào)：

S 435.111

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020205

A multiplex PCR method for rapid detection of four rice pathogenic bacteria

MO Jin1，2， WANG Zhe2， ZHOU Huiping2， ZHU Hongjian1， ZHU Shuifang1， LIAO Xiaolan1*

（1. College of Plant Protection，Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China;

2. Technology Center of Changsha Customs， Changsha 410004， China）

Abstract

Multiplex PCR is an efficient and simple method to detect a variety of pathogenic bacteria in rice at the same time. A multiplex PCR detection method was established for four rice pathogenic bacteria， and the primers were designed based on the gyrB gene of Burkholderia glumae，the PfsI/R quorum sensing locus of Pseudomonas fuscovaginae and the iron-containingcell-receiving factor genes of Xanthomonas oryzae pv. oryzae and X. oryzae pv. oryzicola. The specificity and sensitivity of the multiplex PCR method were validated， and rice samples from different regions were tested using this method. The results showed that the multiplex PCR method can fast and accurately detect four rice pathogenic bacteria. The detectability of this method reached 103 cfu/mL in the bacterial solution. Among 58 rice samples from different regions， neither B.glumae nor P.fuscovaginae was detected，while X.oryzae pv. oryzae or X.oryzae pv. oryzicola were positive in 17 samples.

Key words

multiplex PCR; rice pathogenic bacteria; detection

水稻細(xì)菌性谷枯?。ú≡築urkholderia glumae）[12]、水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐?。ú≡篜seudomonas fuscovaginae）[34]、水稻白葉枯病（病原菌：Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和水稻細(xì)菌性條斑?。ú≡篨.oryzae pv. oryzicola）[56]等水稻細(xì)菌性病害，對(duì)水稻危害嚴(yán)重，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。其中水稻細(xì)菌性谷枯病、水稻細(xì)菌性條斑病和水稻白葉枯病屬于我國(guó)進(jìn)境檢疫性病害，水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病是馬來(lái)西亞等稻種進(jìn)口國(guó)的進(jìn)境檢疫性病害。

目前有多種關(guān)于這4種病原菌檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。Takeuchi等[1]建立了B.glumae的檢測(cè)方法;羅金燕等[7]研究了B.glumae的生理生化特點(diǎn)、Biolog、RAPD-PCR和致病性測(cè)定等鑒定方法;Sayler等[8]和Fang等[9]建立了B.glumae的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定法;朱金國(guó)、莫瑾等制定了PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、生理生化鑒定等方法檢測(cè)B.glumae、X. oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1011];劉雅婷等設(shè)計(jì)了X.oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的多重PCR檢測(cè)體系并申請(qǐng)了專利[12];田茜等建立了X.oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的數(shù)字PCR檢測(cè)方法[13]。徐福壽等采用生理生化鑒定、Biolog生化鑒定和脂肪酸鑒定等方法對(duì)P. fuscovaginae進(jìn)行了鑒定研究[13]。傳統(tǒng)生化方法往往費(fèi)時(shí)且對(duì)菌種純度、操作等要求比較高，熒光定量PCR、數(shù)字PCR對(duì)于檢測(cè)設(shè)備條件要求高，成本高。且相關(guān)研究所使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株及病理材料數(shù)量有限，有必要進(jìn)行檢測(cè)特異性及準(zhǔn)確性方面的驗(yàn)證。

本研究采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中B.glumae、X. oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的特異性檢測(cè)引物[1011]，并根據(jù)水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病PfsI/R quorum sensing 位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以期建立快速、靈敏且特異性高的多重PCR方法對(duì)水稻中B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola進(jìn)行同步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌：水稻細(xì)菌性谷枯病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌和水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌菌株，購(gòu)自英國(guó)國(guó)家植物病原菌種保存中心（NCPPB）;其他對(duì)照菌株分別來(lái)源于水稻種子中自然分離和購(gòu)自美國(guó)國(guó)家菌種保藏中心（ATCC）、中國(guó)國(guó)家菌種保藏中心（CGMCC）和NCPPB。具體菌株來(lái)源及編號(hào)見(jiàn)表1。

試劑：PCR反應(yīng)液MasterMix（2×），DNA Marker，為北京天根試劑公司產(chǎn)品。

儀器：PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems），凝膠成像儀（Bio-RAD）。

1.2 DNA提取

制備菌懸液：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上新鮮菌落（生長(zhǎng)24～48 h）至PS液體培養(yǎng)基[10]，振蕩培養(yǎng)16 h±2 h（培養(yǎng)條件：28℃±1℃、180 r/min）后取1 mL菌液，8 000 r/min離心5 min，棄上清，用1.5 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液將沉淀重懸，重復(fù)離心、洗滌3次，用1 mL PBS重懸菌體，96℃滅活5 min，-20℃保存?zhèn)溆?。多重PCR檢測(cè)將振蕩培養(yǎng)的菌液各取500 μL混合后，再按以上操作離心收集菌體。采用10倍稀釋法進(jìn)行菌液濃度測(cè)定。按照薩姆布魯克等[15]的方法提取細(xì)菌DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

gryB基因因其分辨率高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌近源種的鑒定[16]，針對(duì)B.glumae的gryB基因（GenBank AB207074）設(shè)計(jì)特異性引物，BG-F3：5′-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3′;BG-R3：5′-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3′，PCR產(chǎn)物大小為317 bp。 參考Mattiuzzo等的研究[4]，利用水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌保守的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)中PfsI/R系統(tǒng)的編碼基因PfsI/R quorum sensing（GenBankFN598970.1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌的上下游引物，PfsI/R-F： 5′-AGTGAATGGGAGTGCCAGGAC-3′;PfsI/R-R： 5′-TGTAGCGAAATAACCCGAGCC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為494 bp。比對(duì)GenBank 水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的含鐵細(xì)胞接受因子基因（putative siderophore receptor gene， GenBank AF3257323）的保守序列，設(shè)計(jì)引物F1：5′-GAATATCAGCATCGGCAACAG-3′;R1：5′-TACCGGAGCTGCGCGTT-3′，兩種病菌預(yù)期擴(kuò)增片段大小均為152 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

PCR擴(kuò)增體系：2×PCR Mix 25 μL、10 μmol/L引物（工作濃度10 pmol/μL）F1、R1各1.0 μL，BG-F3、BG-R3各0.75 μL，PfsI/R-F、PfsI/R-R各05 μL，DNA模板（1～10 ng/μL）2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：96℃ 5 min;96℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃ 5 min。

電泳檢測(cè)：PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為120 V，紫外凝膠成像儀進(jìn)行電泳觀察。由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。

1.5 特異性和靈敏度檢測(cè)

單一目標(biāo)菌多重PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)：PCR擴(kuò)增參試的單一菌株，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

多目標(biāo)菌多重PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)：提取A1、B11、C7、F1按體積等比兩兩混合的菌液DNA，提取等比混合的A1、B11、F1，A8、C7、F2以及A1、B11、C7、F1等3組組合的菌液DNA，采用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增提取的DNA，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

多重PCR靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)：將濃度為106cfu/mL的A1、B11、F1以及A8、C7、F2目標(biāo)菌菌液等比例混合，采用10倍稀釋法將目標(biāo)菌液制備至濃度均為106、105、104、103、102 cfu/mL和10 cfu/mL，提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.6 應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測(cè)水稻種子

對(duì)來(lái)自安徽、四川、湖南、海南和廣西等地的58個(gè)水稻種子樣品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。用滅菌蒸餾水沖洗水稻種子3次后，取10 g加入90 mL 0.001%吐溫磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），將種子充分破碎后，立即取1.5 mL液體至離心管內(nèi)，8 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用滅菌蒸餾水重懸后重復(fù)離心3次，得到的沉淀進(jìn)行DNA提取及多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件見(jiàn)1.4，其中擴(kuò)增體系中DNA模板（1～10 ng/μL）加入體積為5 μL。分別以A1、B11、C5和F1菌液浸泡經(jīng)無(wú)菌水沖洗表面后的水稻種子，晾干后作為陽(yáng)性帶菌材料進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR單一目標(biāo)菌特異性檢測(cè)

對(duì)單個(gè)參試菌株提取的DNA，使用BG-F3和BG-R3、PfsI/R-F和PfsI/R-R、F1和R1 3對(duì)引物的混合反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，多重PCR反應(yīng)能同時(shí)特異性地?cái)U(kuò)增出B.glumae、P.fuscovaginae、X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola，混合反應(yīng)體系擴(kuò)增B.glumae得到PCR產(chǎn)物片段為317 bp，擴(kuò)增P.fuscovaginae得到PCR產(chǎn)物片段為494 bp，擴(kuò)增X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola得到PCR產(chǎn)物片段為152 bp，片段大小均與預(yù)期一致，同時(shí)對(duì)菌株CK1～CK16提取的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，均未擴(kuò)增出目的條帶（圖1）。在GenBank中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，證明得到的PCR產(chǎn)物與設(shè)計(jì)的目標(biāo)菌片段大小一致，其中PfsI/R-F和PfsI/R-R、BG-F3和BG-R3擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與GenBank中的P.fuscovaginae、B. glumae序列同源性大于99%，F(xiàn)1和R1擴(kuò)增的產(chǎn)物與X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola序列同源性大于97%。

2.2 多重PCR多目標(biāo)菌檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，多重PCR反應(yīng)體系同步擴(kuò)增B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola，均能擴(kuò)增出與目的片段大小一致的條帶（圖2），而采用多重PCR擴(kuò)增其他參試菌株時(shí)，均未出現(xiàn)目標(biāo)條帶。說(shuō)明同時(shí)應(yīng)用3對(duì)引物進(jìn)行目標(biāo)菌的多重PCR檢測(cè)，引物間無(wú)相互干擾，檢測(cè)特異性強(qiáng)，可采用該方法對(duì)B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 多重PCR靈敏度檢測(cè)

提取不同濃度的混合菌液的DNA后，采用多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR靈敏度檢測(cè)。結(jié)果顯示，菌液濃度為103 cfu/mL時(shí)，能有效地檢測(cè)出4種細(xì)菌（圖3），檢測(cè)靈敏度可達(dá)到103 cfu/mL菌液濃度。

2.4 多重PCR技術(shù)在水稻種子檢測(cè)中的應(yīng)用

對(duì)采自不同地區(qū)的58份水稻種子樣本進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，其中陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果正常，安徽的8個(gè)種子樣品、四川的12個(gè)種子樣品、湖南稻區(qū)的20個(gè)種子樣品、廣西的10個(gè)種子樣品和海南的8個(gè)種子樣品均未檢測(cè)出水稻細(xì)菌性谷枯病菌或水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌，有17個(gè)樣本檢測(cè)出水稻白葉枯病菌或水稻細(xì)菌性條斑病菌。

3 討論

水稻細(xì)菌性谷枯病、水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病以及水稻白葉枯病和水稻細(xì)菌性條斑病，4種病害均可通過(guò)種子傳播，宿主廣泛，具有較強(qiáng)的侵染性，導(dǎo)致水稻減產(chǎn)嚴(yán)重，其中水稻細(xì)菌性谷枯病、水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病在我國(guó)尚無(wú)大面積病害發(fā)生的報(bào)道。同時(shí)，進(jìn)口國(guó)對(duì)于我國(guó)出口的雜交稻種不斷提出新的檢疫要求，影響我國(guó)稻種的順利出口。因此，無(wú)論是在水稻種植的各個(gè)環(huán)節(jié)還是在稻種的調(diào)運(yùn)過(guò)程中，及時(shí)開(kāi)展水稻病害的快速檢測(cè)，為防止病害的大面積傳播、跨境傳播、有害生物的入境以及稻種的順利出口都提供了必要的技術(shù)保障。再者，為方便進(jìn)出口貿(mào)易，降低倉(cāng)儲(chǔ)成本和保障商品品質(zhì)，目前海關(guān)等部門大力推行“快檢快放”“快速通關(guān)”等一系列政策，提高通關(guān)效率，由此對(duì)檢疫速度提出了更高的要求，也是目前口岸檢疫部門的迫切需求。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于幾種病害的檢測(cè)技術(shù)主要以常規(guī)生理生化檢測(cè)和分子檢測(cè)為主。其中傳統(tǒng)的生理生化檢測(cè)方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，部分植物病原菌受其生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)的影響，其生理生化特征不穩(wěn)定，因此，傳統(tǒng)生化檢測(cè)不能完全適用于快速檢測(cè)鑒定。相對(duì)于單一檢測(cè)某種目標(biāo)菌的PCR檢測(cè)方法，多重PCR檢測(cè)能在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)菌，李云飛等利用多重PCR診斷水稻白葉枯病和細(xì)菌性條斑病的復(fù)合發(fā)生[5]，Maeda等建立了多重PCR檢測(cè)B.plantarii、B.glumae 和 B.gladioli的方法[17]，相關(guān)方法的建立極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的快速鑒別。多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立在及時(shí)預(yù)防病害的傳播、防止外來(lái)有害生物的入侵、提高通關(guān)效率、保障我國(guó)雜交稻種的順利出口等各方面提供了快速有效的解決方法。

本研究建立的三重PCR于同一反應(yīng)體系中同步檢測(cè)B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola 4種水稻病菌，3對(duì)檢測(cè)引物相互間無(wú)干擾，在反應(yīng)條件一致的情況下，能夠特異性地同步擴(kuò)增出各菌株目標(biāo)基因，達(dá)到對(duì)目標(biāo)菌快速、低成本檢測(cè)鑒定的目的。其中X.oryzae pv. oryzae和X. oryzae pv. oryzicola同為稻黃單胞菌屬，均屬于我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物，本多重PCR方法中用1對(duì)引物同時(shí)檢測(cè)2種有害病原菌，減少了多重PCR中引物的相互干擾，對(duì)于快速篩選健康植物材料和保障“快速驗(yàn)放”提供了技術(shù)支持。通過(guò)對(duì)我國(guó)不同地區(qū)的水稻種子的檢測(cè)結(jié)果表明，B.glumae和P.fuscovaginae在國(guó)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有攜帶發(fā)生。因此，加強(qiáng)對(duì)入境物種攜帶B.glumae和P.fuscovaginae的控制和檢疫，嚴(yán)防輸入是有效防止相關(guān)病害在我國(guó)發(fā)生和傳播的關(guān)鍵。

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（責(zé)任編輯：田 喆）