馬文娣 田逸英 焦志遠(yuǎn) 周濤 范在豐

摘要 ：植物病原的快速檢測對于植物病害防控具有重要意義。 重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年建立的等溫核酸擴增技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、適用于現(xiàn)場快速檢測等特點，已在多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本文對重組酶聚合酶擴增技術(shù)的原理、特性、檢測方法及其在植物病原體檢測領(lǐng)域的應(yīng)用進展加以綜述。

關(guān)鍵詞 ：重組酶聚合酶擴增; 植物病原; 檢測

中圖分類號：

S 474

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020038

Recombinase polymerase amplification and its applications in

quick detection of plant pathogens

MA Wendi， TIAN Yiying， JIAO Zhiyuan， ZHOU Tao， FAN Zaifeng*

（Department of Plant Pathology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract

The rapid diagnosis of plant pathogens is essential for efficient prevention and control of plant diseases. Recombinase polymerase amplification （RPA） is an isothermal nucleic acid amplification technology developed in recent years， which has been widely applied in many fields. It is suitable for on-site rapid detection with high sensitivity and strong specificity. In this paper， we review the principles， characteristics， detection methods of RPA and its applications in the detection of plant pathogens.

Key words

recombinase polymerase amplification; plant pathogen; detection

病原物的準(zhǔn)確檢測和鑒定是植物病害防控策略中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。20世紀(jì)80年代以來，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，核酸檢測技術(shù)憑借其快速、靈敏、特異性強的特點被廣泛應(yīng)用于病原物檢測與鑒定領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)PCR對精密溫控設(shè)備的依賴性較高，需要PCR熱循環(huán)儀完成預(yù)變性、變性、退火及延伸等步驟，且反應(yīng)耗時長，難以滿足經(jīng)濟、高效的檢測需求。

近年來，等溫擴增技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，與傳統(tǒng)PCR相比，其無需熱循環(huán)等步驟，反應(yīng)溫度單一，擴增反應(yīng)更為迅速;如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)[1]，可以在較低的恒定溫度下完成核酸的快速擴增，具有檢測周期短、操作便捷、對精密溫控設(shè)備的依賴程度低等顯著優(yōu)勢。

2006年，Piepenburg等建立了由多種酶和蛋白質(zhì)參與的重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)[2]。RPA技術(shù)擴增速度快，特異性強，靈敏度高，對環(huán)境條件要求較低，將擴增體系與其他檢測技術(shù)結(jié)合，可以不再依賴精密的儀器設(shè)備，適用于病原物快速檢測及病害診斷，因此受到了廣泛關(guān)注。

1 RPA技術(shù)概述

1.1 反應(yīng)原理

RPA技術(shù)是仿照T4噬菌體DNA的復(fù)制機制，在體外實現(xiàn)目的基因片段的恒溫擴增[2]。RPA擴增主要依賴于3種組分：來自T4噬菌體的重組酶uvsX及其裝載輔助因子uvsY[3]、單鏈DNA結(jié)合蛋白（gp32）以及來自枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的鏈置換DNA聚合酶Ι大片段即Bsu DNA聚合酶。在25～43℃區(qū)間內(nèi)的任一恒定溫度條件下，持續(xù)5～20 min即可完成核酸擴增反應(yīng)[48]。

在ATP的作用下，能結(jié)合單鏈核苷酸的重組酶uvsX與寡核苷酸引物結(jié)合，形成蛋白寡核苷酸復(fù)合體。復(fù)合體通過雙向掃描雙鏈DNA，定位到與引物序列同源的靶序列;一旦定位到目標(biāo)位點，重組酶可直接打開靶序列雙鏈DNA，并完成引物與同源序列的鏈置換反應(yīng)形成D-loop結(jié)構(gòu)[9]。單鏈結(jié)合蛋白與被引物置換的母鏈結(jié)合穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，防止置換的單鏈被替換，使模板雙鏈呈打開狀態(tài)。與此同時，蛋白寡核苷酸復(fù)合體主動水解反應(yīng)體系中的ATP，使復(fù)合物構(gòu)象改變，重組酶uvsX與引物解離，引物3′端暴露后迅速被鏈置換Bsu DNA聚合酶識別，啟動鏈的延伸，形成新的互補鏈。新合成的單鏈與原始互補鏈配對，最終形成一個完整的擴增子。新合成的擴增子作為模板，不斷循環(huán)重復(fù)擴增過程，實現(xiàn)核酸的指數(shù)級擴增。同時，體系中的輔助因子uvsY能夠促進uvsX與引物單鏈DNA的緊密結(jié)合，進而加快擴增反應(yīng)[2]。若在反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶首先進行反轉(zhuǎn)錄就可以檢測樣品中的RNA分子[7]。

1.2 引物設(shè)計

RPA引物的設(shè)計是重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)的核心。引物設(shè)計應(yīng)基于特異性強的靶標(biāo)序列[10]。RPA擴增的片段長度理論上可以達到1.5 kb， 但當(dāng)目的基因片段長度在100～200 bp時，可以提高擴增的靈敏度和特異性，達到最佳擴增效果[2]。RPA引物最佳長度為30～35 nt。引物過長易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，過短會降低擴增反應(yīng)的重組率，影響擴增反應(yīng)速率。單個引物應(yīng)避免出現(xiàn)連續(xù)重復(fù)序列、回文序列及發(fā)卡結(jié)構(gòu)。設(shè)計引物時，應(yīng)避免引物之間互補形成二聚體。

1.3 RPA擴增產(chǎn)物檢測方法

1.3.1 凝膠電泳檢測

通常采用瓊脂糖凝膠電泳對RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系的擴增產(chǎn)物進行檢測。RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系相較于傳統(tǒng)PCR體系，添加了多種酶和蛋白質(zhì)，為了避免反應(yīng)體系中引物、酶等組分干擾凝膠電泳，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，擴增產(chǎn)物需用酚氯仿純化后再進行瓊脂糖凝膠電泳[11]。經(jīng)溴化乙錠染色后，紫外燈下（紫外線波長365 nm）進行檢測。

1.3.2 實時熒光定量檢測

實時熒光定量RPA（real-time RPA）是在RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系中加入核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ，即exo）和特異性熒光標(biāo)記的exo探針。exo探針包含一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，

分別結(jié)合在極為接近的胸腺嘧啶上（僅相隔1～5個核苷酸），兩熒光基團中間位置設(shè)計有一個四氫呋喃（THF）殘基。

在探針3′末端需要添加一個合適的阻隔基團，以阻斷鏈的延伸。當(dāng)該結(jié)構(gòu)保持完整時，體系內(nèi)的熒光強度很低。當(dāng)探針與目的序列結(jié)合時，THF位點被核酸外切酶Ⅲ識別并剪切，熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，擴增產(chǎn)物與熒光信號同步積累，可以通過檢測熒光信號強度實時監(jiān)測目的基因片段的擴增情況[2]。

1.3.3 側(cè)流層析試紙條檢測

側(cè)流層析試紙條RPA（lateral flow dipstick-RPA，LFD-RPA）方法原理[1]是帶有生物素修飾引物的核酸擴增產(chǎn)物可以和帶羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的特異探針雜交，使擴增產(chǎn)物同時攜帶FAM和生物素雙標(biāo)記。該技術(shù)在RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，加入核酸內(nèi)切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，即 nfo）、nfo探針和3′端帶有生物素標(biāo)記的反向引物。nfo探針5′端帶有一個FAM熒光基團，3′端帶有一個阻隔基團，在中間位置帶有一個THF位點。僅當(dāng)探針結(jié)合時，THF位點才能被核酸內(nèi)切酶Ⅳ裂解，產(chǎn)生的3′端羥基是聚合酶結(jié)合的位點，啟動鏈的延伸，使5′端FAM標(biāo)記和3′端生物素標(biāo)記能夠整合到擴增產(chǎn)物中。

側(cè)流層析試紙條的前端有一條質(zhì)控線，包被有固定抗體，質(zhì)控線下端有一條檢測線，包被有生物素配體。為避免反應(yīng)底物對試紙條上的抗體檢測形成干擾，通常將稀釋后的反應(yīng)液滴加到試紙條上，檢測線上的生物素配體可以結(jié)合帶有生物素標(biāo)記的擴增產(chǎn)物并顯色，擴增產(chǎn)物中的FAM標(biāo)記可以與質(zhì)控線包被的固定抗體結(jié)合呈現(xiàn)顏色，以確保試紙條的有效性。

2 RPA技術(shù)在植物病原檢測方面的應(yīng)用

RPA作為一種新型核酸等溫擴增技術(shù)，自建立以來憑借高靈敏度、高特異性，操作簡單等優(yōu)勢已經(jīng)逐步應(yīng)用于生命科學(xué)、食品安全、生物安全等領(lǐng)域。近年來，RPA技術(shù)已應(yīng)用于植物病原物的快速檢測與鑒定。

2.1 RPA在菌物檢測方面的應(yīng)用

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，70%～80%的植物病害是由病原真菌侵染所導(dǎo)致的[12]。病原真菌侵害不僅會造成作物產(chǎn)量下降與品質(zhì)降低，甚至?xí)a(chǎn)生多種不同類型的真菌毒素和代謝物質(zhì)，嚴(yán)重威脅食品安全與人畜的生命健康。卵菌包括多種疫霉、霜霉和腐霉，可侵染多種農(nóng)作物造成毀滅性的病害。因此，應(yīng)加強對植物真菌和卵菌病害的早期診斷與病原物檢測技術(shù)研究與應(yīng)用。

油菜莖基潰瘍病是油菜上發(fā)生最為嚴(yán)重的真菌病害之一，其致病菌包括致病力較強，能夠產(chǎn)生西洛菌素PL（sirodesmin PL）的油菜莖基潰瘍病菌Leptosphaeria maculans以及致病力較弱、不產(chǎn)生毒素的油菜黑脛病菌L.biglobosa。Lei等[13]選擇ITS區(qū)域作為重組酶聚合酶擴增的靶標(biāo)序列，篩選針對這兩種病原菌的特異性RPA引物和探針，利用便攜式實時熒光檢測儀實現(xiàn)了對甘藍(lán)型油菜莖基潰瘍病的兩種病原菌的快速檢測。本實驗室已建立了禾谷鐮孢Fusarium graminearum及藤倉鐮孢F.fujikuroi的RPA檢測體系（待發(fā)表）。

疫霉屬的植物病原菌可危害多種農(nóng)作物和森林植物。Miles等[14]選擇疫霉屬卵菌線粒體基因組中高度保守的trnM-trnP-trnM區(qū)域，建立了疫霉屬基因組特異性分析的RPA方法;

根據(jù)其線粒體基因組atp9-nad9區(qū)域中具有的種間序列多態(tài)性

建立疫霉菌種間特異性分析的RPA方法。辣椒疫霉Phytophthora capsici是一種重要的病原菌，可侵染多種作物。Yu等[15]基于側(cè)流層析試紙條RPA法，依據(jù)Ypt1基因序列設(shè)計了特異性引物和探針，測定出最佳試驗條件為40℃，20 min，其檢出限為10 pg。Ammour等[16]針對馬鈴薯晚疫病菌的核糖體DNA ITS2 區(qū)域設(shè)計RPA引物和exo探針，建立了實時熒光定量RPA檢測體系。該反應(yīng)體系在39℃反應(yīng)30 min，每30 s檢測一次熒光強度，RPA檢測最低限可以達到50 fg/μL，同時該體系也可以檢測近緣種。

2.2 RPA在細(xì)菌檢測方面的應(yīng)用

近年來，針對細(xì)菌性病害建立的RPA檢測體系也有報道，在特異性和靈敏性方面均達到了較好的檢測效果。

柑橘黃龍病Huanglongbing是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，影響著全世界的柑橘產(chǎn)業(yè)，并在全球造成數(shù)百萬的柑橘類植物死亡。Ghosh等[17]針對柑橘黃龍病病原菌Candidatus Liberibacter asiaticus保守的16S rRNA基因設(shè)計特異性引物對和探針，以純化的DNA和植物粗提取物為模板優(yōu)化擴增溫度和反應(yīng)時間，并結(jié)合側(cè)流層析試紙條檢測方法建立了簡便快速、靈敏的RPA檢測體系。

細(xì)菌性斑點病是在番茄上廣泛發(fā)生的重要病害。Strayer-Scherer等[18]選擇引起番茄細(xì)菌性斑點病的3種不同病原細(xì)菌Xanthomonas euvesicatoria、X.gardneri和X.perforans的特異基因hrcN建立了較為完善的實時熒光RPA檢測體系，可以實現(xiàn)對一種或多種植物病原細(xì)菌的有效鑒定與快速檢測。Wambua等[19]基于水稻植原體Candidatus Phytoplasma oryzae的imp基因，建立了適用于現(xiàn)場檢測的實時熒光檢測體系和側(cè)流層析試紙條檢測體系，實現(xiàn)對該病原體的特異性檢測。

2.3 RPA在植物病毒檢測方面的應(yīng)用

植物病毒種類繁多，分布廣泛，危害嚴(yán)重[20]。因此，建立快速、高效的病毒檢測體系對于防控病毒病的發(fā)生與流行具有重要意義。

黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）與玉米褪綠斑駁病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）均為重要的檢疫性病毒。Jiao等[2122]基于CGMMV外殼蛋白（coat protein，CP）和MCMV CP基因的保守序列設(shè)計RPA的特異性引物，建立了反轉(zhuǎn)錄RPA（reverse transcription-RPA，RT-RPA）檢測體系，38℃條件下等溫反應(yīng)30 min左右即可實現(xiàn)最佳擴增效果，比傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）檢測的靈敏度約高10倍，該方法已應(yīng)用于檢測田間采集的樣品。

Kim等[23]基于蘋果莖溝病毒Apple stem grooving virus（ASGV） CP基因高度保守的區(qū)域設(shè)計特異性引物，擴增反應(yīng)1～30 min，擴增產(chǎn)物量無顯著差異，說明反應(yīng)1 min后，反應(yīng)中的脫氧核苷三磷酸（dNTPs）或其他酶活性成分已消耗殆盡。該檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，反應(yīng)時間非?？臁abujee等[24]優(yōu)化了RPA技術(shù)，可準(zhǔn)確檢測馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）的PVYO和PVYN株系。Babu等[25]基于熒光定量RT-RPA檢測方法，依據(jù)玫瑰叢簇病毒Rose rosette virus（RRV） 核蛋白N基因設(shè)計引物和探針建立的檢測體系具有高度特異性和靈敏性，最小檢測限度為1 fg/μL。此外，還建立了從不同的RRV侵染組織中快速提取病毒RNA的方法，與熒光定量RT-RPA方法結(jié)合可以用于玫瑰叢簇病毒的現(xiàn)場快速檢測。

Jiao等[26]基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)建立了多種蘋果病毒與類病毒（蘋果壞死花葉病毒Apple necrotic mosaic virus， 蘋果莖痘病毒Apple stem pitting virus， 蘋果莖溝病毒Apple stem grooving virus， 蘋果褪綠葉斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus和蘋果銹果類病毒Apple scar skin viroid）的多重核酸檢測體系，該體系采用RT-RPA技術(shù)直接從粗提取物中檢測目標(biāo)病毒，通過寡聚核苷酸結(jié)合的納米金顆粒，可肉眼區(qū)分出陽性結(jié)果，且該結(jié)果與傳統(tǒng)PCR檢測結(jié)果完全一致，特異性強。這種基于CRISPR/Cas12a的方法用時短，從采集樣品開始至多需要1 h即可完成檢測，不需要將樣品送到專門的實驗室即可實現(xiàn)多種病原物的現(xiàn)場檢測，便于及時采取防控措施。

Srivastava等[27]基于黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）外殼蛋白基因保守區(qū)域，設(shè)計用于熒光定量RT-RPA檢測的特異性引物對和探針，分別使用紫外線探照器和熒光計直接觀察擴增反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，驗證出便攜式檢測的熒光定量RT-RPA方法的靈敏度僅略低于RT-RPA，但均高于常規(guī)RT-PCR的靈敏度。水稻黑條矮縮病毒Rice black-streaked dwarf virus（RBSDV）主要侵染水稻、玉米和小麥，可導(dǎo)致水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。Zhao等[28]針對RBSDV病毒的P10外殼蛋白基因，利用RPA擴增結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測、實時熒光檢測、側(cè)流層析試紙條等多種擴增產(chǎn)物檢測方法，建立了簡便迅速、高效的水稻黑條矮縮病毒檢測體系。本實驗室已建立了南方水稻黑條矮縮病毒Southern rice black-streaked dwarf virus（SRBSDV）的RPA檢測體系（待發(fā)表）。

3 總結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展成熟，等溫核酸擴增作為PCR的重要分支，因其對加熱條件的要求較低，核酸復(fù)制速度快，操作簡便等技術(shù)特點而得到廣泛應(yīng)用[29]。相比環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）[1]，滾環(huán)擴增（rolling-circle amplification）[30]，信號介導(dǎo)的RNA擴增技術(shù)（signal-mediated amplification of RNA technology）[31]，多重鏈置換擴增（multiple displacement amplification）[32]，RPA技術(shù)是相對較新的等溫擴增技術(shù)，憑借其更為簡單的引物設(shè)計、簡潔的擴增方案、反應(yīng)速度更快，靈敏度高和特異性強的獨特優(yōu)勢，不僅在植物病害檢測領(lǐng)域得到了普遍應(yīng)用，在生命科學(xué)的其他領(lǐng)域也表現(xiàn)出巨大的潛力[7， 3340]，成為近年來廣受關(guān)注且發(fā)展最快的方法之一。

RPA技術(shù)目前還存在一些不足之處。例如，所需引物和探針較長（不適用于短序列擴增），缺少專門用于RPA引物和探針設(shè)計的軟件或網(wǎng)站，以及檢測成本較高等。然而，憑借其恒定溫度、擴增用時短及操作便捷等優(yōu)勢，RPA技術(shù)在生物安全和醫(yī)學(xué)臨床等領(lǐng)域的現(xiàn)場檢測方面仍具有明顯的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。

隨著RPA技術(shù)的不斷完善，其應(yīng)用范圍將會逐步擴大。首先，RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系中的基本成分重組酶聚合酶是恒溫擴增反應(yīng)的關(guān)鍵酶，通過對該組分的進一步探究，找到價格較低的替代品，可以降低RPA檢測成本。其次，通過對基礎(chǔ)反應(yīng)體系進行優(yōu)化，進一步拓寬反應(yīng)的溫度范圍，使RPA擺脫加熱設(shè)備的限制，實現(xiàn)在自然溫度下的快速檢測。此外，將RPA方法與簡易的核酸提取方法、可視化產(chǎn)物檢測方法相結(jié)合，有望實現(xiàn)樣品處理、快速擴增及可視化產(chǎn)物觀測一體化的實時現(xiàn)場檢測。通過結(jié)合生物傳感器、芯片技術(shù)等技術(shù)手段，可以實現(xiàn)對常見病原的多重檢測，顯著提高檢測效率，滿足實際應(yīng)用需求。另外，通過研發(fā)便攜式、智能化的RPA快速檢測裝置，將為在野外或基礎(chǔ)設(shè)施薄弱的地區(qū)實現(xiàn)一體化現(xiàn)場檢測提供便利。因此，RPA可作為PCR的輔助手段應(yīng)用于生物學(xué)各領(lǐng)域的核酸分子檢測。隨著RPA技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，在未來將逐步實現(xiàn)操作簡捷、反應(yīng)迅速的一體化實時現(xiàn)場檢測，為生物安全、植物保護等領(lǐng)域提供有力的技術(shù)工具。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）