肖建飛 韓嵐嵐 趙奎軍 郝子茹 朱琳 師正浩 高麗瞳 陳娟

摘要 ：為了篩選合適的介質(zhì)以提高昆蟲病原線蟲抵抗紫外脅迫的能力，本文研究了儲存于木質(zhì)素磺酸鈣、預(yù)膠化淀粉、蛭石、黑炭和無菌蒸餾水（CK）中的海濱斯氏線蟲Steinernema litorale在距18 W紫外燈30 cm處照射30、60、90 min和120 min的存活率、對大蠟螟Galleria mellonella末齡幼蟲致死率和水平運動能力的差異。紫外脅迫后，不同介質(zhì)中儲存的海濱斯氏線蟲的平均存活率從大到小依次為預(yù)膠化淀粉（69.39%）、木質(zhì)素磺酸鈣（51.75%）、蛭石（48.06%）、無菌蒸餾水（47.17%）、黑炭（16.92%）。儲存于木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲經(jīng)紫外脅迫30 min后處理

大蠟螟幼蟲，其72 h的校正致死率在93.33%～96.67%;紫外脅迫60 min后，儲存于預(yù)膠化淀粉、蛭石、木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟幼蟲的校正致死率在83.33%～90.00%;紫外脅迫90 min后，儲存于蛭石中海濱斯氏線蟲對大蠟螟幼蟲的校正致死率在90.00%～96.67%;紫外脅迫120 min后，5種介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟幼蟲的校正致死率在60.00%～76.67%，無顯著差異（P>0.05）。紫外脅迫4個處理中，儲存于木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲24 h后92.33%～96.67%的個體運動到3.6 cm圓孔中。研究結(jié)果表明，與測定的其他介質(zhì)相比，木質(zhì)素磺酸鈣能顯著提高海濱斯氏線蟲抗紫外脅迫的能力。因此，推薦使用木質(zhì)素磺酸鈣儲存海濱斯氏線蟲，以增強(qiáng)其對紫外線的耐受能力。

關(guān)鍵詞 ：紫外脅迫; 不同介質(zhì); 海濱斯氏線蟲; 生活力; 生物防治

中圖分類號：

S 476.15

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020033

Effects of different media on the resistance of Steinernema litorale to

ultraviolet radiation

XIAO Jianfei， HAN Lanlan*， ZHAO Kuijun*， HAO Ziru， ZHU Lin， SHI Zhenghao， GAO Litong， CHEN Juan

（College of Agriculture， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

Abstract

In order to screen appropriate media to enhance the resistance of entomopathogenic nematodes to UV radiation，the Steinernema litorale stored in calcium lignosulfonate， pregelatinized starch， vermiculite， black carbon， and sterile distilled water （CK）， were exposed to 18 W UV lamp at 30 cm for 30， 60， 90 and 120 minutes. The survival rates of S.litorale after UV irradiation， the mortalities of the last instar larvae of Galleria mellonella treated by survival S.litorale for 72 hours and the transverse diffusion ability of survival S.litorale were investigated. The results showed that after UV irradiation， the average survival rates of S.litorale was 69.39%， 51.75%， 48.06%， 47.17% and 16.92% for media of pregelatinized starch， calcium lignosulfonate， vermiculite， sterile distilled water and black carbon， respectively. The corrected mortalities of G.mellonella was 93.33%-96.67% when treated for 72 hours by S.litorale stored in calcium lignosulfonate and survived 30 min UV irradiation. The corrected mortality of G.mellonella treated by S.litorale for 72 hours were 83.33%-90.00% when S.litorale stored in calcium lignosulfonate， pregelatinized starch and vermiculite and exposed to UV radiation for 60 min， and the corrected mortalities of G.mellonella larvae were 90.00%-96.67% when Slitorale stored in vermiculite and exposed to UV radiation for 90 min. The corrected mortality of G.mellonella treated with S.litorale stored in five media and exposed to UV radiation for 120 min were 60.00%-76.67%， and showed no significant difference （P>0.05）. There was 92.33%-96.67% individuals that stored in calcium lignosulfonate could move 3.6 cm to reach the circular hole in 24 hours in all treatments. The results showed that calcium lignosulfonate had the best protection for S.litorale in resistance to UV radiation. Therefore， the calcium lignosulfonate was recommended to store the S.litorale.

Key words

ultraviolet stress; different media; Steinernema litorale; life activity; biological control

昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematodes）是一種廣泛分布在土壤中，通過寄生昆蟲而進(jìn)行生殖繁衍的致病性線蟲[1]。對昆蟲病原線蟲國內(nèi)地理分布調(diào)查發(fā)現(xiàn)，斯氏線蟲科和異小桿線蟲科的線蟲大約有200多種[2]。線蟲在寄生過程中，通過釋放體內(nèi)的共生菌殺死寄主昆蟲，并獲取營養(yǎng)，是重要的生防資源。昆蟲病原線蟲作為最具潛力的生物殺蟲劑之一，具有很高的應(yīng)用價值和市場需求。海濱斯氏線蟲Steinernema litorale是由Yoshida誘集和鑒定的昆蟲病原線蟲，該線蟲在低溫條件下具有較高侵染力和長時間的耐干燥特性，且低溫馴化可以提高其適應(yīng)低溫能力，延長貯存時間[36]。這些優(yōu)良特性表明海濱斯氏線蟲在實際應(yīng)用方面值得深入研究。

研究表明，不同介質(zhì)對線蟲的生命活動產(chǎn)生不同影響。其中蛭石、沙土、海綿和珍珠巖4種介質(zhì)對嗜菌異小桿線蟲Heterorhabditis bacteriophora冷凍存儲存活率有影響，-4℃儲存5 d，含水量50%的蛭石中嗜菌異小桿線蟲回收率高達(dá)87.4%優(yōu)于其他介質(zhì)[7];另外，在15、25℃和35℃下，用蛭石和凝膠儲存蕪菁夜蛾斯氏線蟲Steinernema feltiae的效果明顯優(yōu)于泥炭和硅藻土[8]。研究發(fā)現(xiàn)，S.feltiae與海藻酸鈣混合制成的線蟲顆粒，可延長該線蟲在室溫下的保存時間和保持穩(wěn)定的侵染力[9]。

昆蟲病原線蟲對草地貪夜蛾、菜青蟲、小菜蛾等葉面害蟲有很好的防治效果[1012]，與其他生物殺蟲劑相比較，昆蟲病原線蟲易受到各種非生物脅迫（高溫、低濕、紫外輻射等）[1316]和生物因素（微生物和自身生命活動等）的影響，其中紫外線是造成昆蟲病原線蟲對葉面害蟲的田間防治效果差的主要因素之一[1718]。研究發(fā)現(xiàn)，長時間的紫外線照射能夠殺死秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans，并且導(dǎo)致該線蟲在發(fā)育過程中出現(xiàn)畸形，并對該線蟲的DNA造成損傷，導(dǎo)致生殖毒性效應(yīng)[1920]。另外，經(jīng)20 W和40 W紫外燈照射后，斯氏屬和異小桿屬的4種昆蟲病原線蟲的9個品系的存活率和侵染力均有不同程度的變化，部分品系線蟲引起寄主提前死亡[16]。因此，探究如何減少紫外輻射對昆蟲病原線蟲造成的損傷是線蟲進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)。選擇合適的抗紫外線介質(zhì)可以使昆蟲病原線蟲保持良好的生命活力，提高其對害蟲的防治效果。

本文以海濱斯氏線蟲為研究對象，探究5種介質(zhì)對海濱斯氏線蟲抗紫外脅迫的影響，旨在為昆蟲病原線蟲抗紫外研究和葉面施用等提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲、昆蟲和介質(zhì)

供試線蟲：海濱斯氏線蟲是由本實驗室從哈爾濱原生態(tài)榆樹林根際土壤中分離、鑒定，并保存于4℃冰箱中。

供試?yán)ハx：大蠟螟Galleria mellonella L.末齡幼蟲購于天津玉米蟲養(yǎng)殖場。

供試介質(zhì)：黑炭、蛭石、木質(zhì)素磺酸鈣、預(yù)膠化淀粉和無菌蒸餾水，其中無菌蒸餾水為對照，黑炭和蛭石不溶于水，木質(zhì)素磺酸鈣溶于水，預(yù)膠化淀粉與水混合后，在靜置狀態(tài)下少部分溶于水，均勻攪拌后，短時間內(nèi)與水形成渾濁溶液。

1.2 紫外脅迫對不同介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲存活率的影響

準(zhǔn)備12個224 mL的透氣玻璃組織培養(yǎng)瓶，每瓶加入5 g木質(zhì)素磺酸鈣和18 mL無菌蒸餾水，然后加入2 mL侵染期線蟲（濃度為5 000 IJS/mL）。紫外脅迫參考錢秀娟[21]的方法，在18 W紫外燈30 cm處脅迫（以下簡稱：紫外脅迫）處理30、60、90 min和120 min，每個處理重復(fù)3次。將上述處理的線蟲在室溫下靜置30 min，然后采用過篩蔗糖梯度離心法[2224]分離回收線蟲，在解剖鏡下觀察存活狀況，用昆蟲針刺激線蟲，蟲體擺動視為存活，記錄存活數(shù)，計算存活率。蛭石、黑炭、預(yù)膠化淀粉和無菌蒸餾水（CK）也按照上述方法處理。線蟲保存方法為淺水層保存法。

線蟲存活率=線蟲存活數(shù)/總線蟲數(shù)×100%。

1.3 紫外脅迫對不同介質(zhì)中海濱斯氏線蟲殺蟲活性的影響

將上述處理后的存活線蟲配制成濃度為250 IJS/mL的線蟲懸浮液。在9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中鋪雙層中性濾紙，放入大蠟螟末齡幼蟲10頭/皿。然后取2 mL線蟲懸浮液，均勻噴灑在濾紙上，放入25℃無光恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次，處理24、48、72 h和96 h時觀察大蠟螟末齡幼蟲的死亡情況，記錄死亡數(shù)，計算校正致死率，以無菌蒸餾水為對照。

校正致死率=（x-y）/（1- y）×100%，其中x為處理組的死亡率，y為無菌蒸餾水對照組的死亡率。

1.4 紫外脅迫對不同介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲水平運動能力的分析

將上述處理后的存活線蟲，配制成濃度為1 000 IJS/mL的線蟲懸浮液。其水平運動能力的測定參考楊秀芬[25]和Wright[26]的方法。將1%瓊脂倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻后，在培養(yǎng)基中心用打孔器打1個半徑為0.5 cm的圓孔，然后在孔中加入1 mL磷酸緩沖液（PBS）提取的健康大蠟螟末齡幼蟲體液，將直徑為1 cm的圓形濾紙片放于距圓孔距離3.6 cm（濾紙片圓心距圓孔邊緣的距離）處，吸取100 μL線蟲液加在濾紙片中心上，然后放入25℃的無光恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每組重復(fù)3次，處理12 h和24 h時，觀察并記錄運動到圓孔中的線蟲數(shù)，計算百分比。

具有運動能力的線蟲百分比=圓孔中的線蟲數(shù)/總線蟲數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)處理，用SPSS 23進(jìn)行One-way ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外脅迫對不同介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲存活率的影響

紫外脅迫30、60、90 min和120 min后，不同介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲的平均存活率依次為預(yù)膠化淀粉（69.39%）、木質(zhì)素磺酸鈣（51.75%）、蛭石（48.06%）、無菌蒸餾水（47.17%）和黑炭（16.92%）。紫外脅迫30 min后，儲存于無菌蒸餾水（CK）、木質(zhì)素磺酸鈣和預(yù)膠化淀粉中的線蟲存活率分別為85.67%、81.55%和80.88%，三者之間無顯著差異（P>0.05），儲存于蛭石中的線蟲存活率為58.89%，與前三者相比較，差異顯著（P<0.05）。紫外脅迫60、90 min和120 min后，儲存于預(yù)膠化淀粉中的線蟲的存活率分別為75.00%、62.78%和58.89%，均顯著高于無菌蒸餾水（CK）中的線蟲存活率（P<0.05）。另外，紫外脅迫各處理時間下，儲存于黑炭中的線蟲存活率均顯著低于儲存于無菌蒸餾水（CK）中的線蟲存活率（P<0.05）。結(jié)果表明，預(yù)膠化淀粉可提高海濱斯氏線蟲在紫外脅迫下的存活率，優(yōu)于其他介質(zhì)。

2.2 紫外脅迫對不同介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲殺蟲活性的影響

如圖2a～d所示，紫外脅迫后，儲存于木質(zhì)素磺酸鈣和蛭石中的海濱斯氏線蟲在24 h時就表現(xiàn)出對大蠟螟末齡幼蟲的致病力，其侵染速率比其他介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟侵染速率快。且與儲存于木質(zhì)素磺酸鈣和無菌蒸餾水（CK）中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟的致死率相一致（P>0.05）。其次，儲存于黑炭中的海濱斯氏線蟲在48 h時對大蠟螟的致死時間相較于儲存于無菌蒸餾水（CK）和木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟的致死時間有所延長。另外，紫外脅迫30、60 min和90 min后，侵染72 h后，儲存于無菌蒸餾水（CK）和木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟的致死率均在80%以上，顯著高于儲存于預(yù)膠化淀粉中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟的致死率（P<0.05）。紫外脅迫120 min后，侵染48 h時，儲存于預(yù)膠化淀粉和黑炭中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟的致死率分別為56.67%和26.67%，差異顯著（P<005）。侵染72 h后，5種介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲對大蠟螟的致死率無顯著差異（P>0.05）。

2.3 紫外脅迫對不同介質(zhì)中海濱斯氏線蟲水平運動能力的影響

由圖3a～d所示，紫外脅迫30、60、90 min和120 min后，儲存于木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲有92.33%～96.67%的個體在24 h時可運動至圓孔處，顯著高于其他介質(zhì)中的海濱斯氏線蟲（P<0.05），儲存于蛭石和黑炭中的海濱斯氏線蟲水平運動能力差異不顯著（P>0.05）。紫外脅迫30和60 min后，儲存于無菌蒸餾水（CK）中的海濱斯氏線蟲在24 h時能運動到圓孔的個體所占比例分別為67.67%和59.67%，顯著高于儲存于預(yù)膠化淀粉、黑炭和蛭石中的海濱斯氏線蟲（P<0.05）。紫外脅迫90 min后，儲存于預(yù)膠化淀粉、黑炭、蛭石和無菌蒸餾水（CK）中的海濱斯氏線蟲運動能力無顯著差異（P>0.05）。紫外脅迫120 min后，儲存于預(yù)膠化淀粉中的海濱斯氏線蟲在24 h時能運動到圓孔的個體所占比例為62.67%，顯著高于儲存于無菌蒸餾水（CK）、黑炭和蛭石中的海濱斯氏線蟲（P<0.05）。上述結(jié)果表明，紫外脅迫下，木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲的水平運動能力增強(qiáng)，有利于保持海濱斯氏線蟲對寄主昆蟲的搜索能力。

3 討論

本研究中所選用的黑炭、蛭石、木質(zhì)素磺酸鈣和預(yù)膠化淀粉4種介質(zhì)在昆蟲病原線蟲研究或土壤改良等方面均有不同程度的應(yīng)用，木質(zhì)素磺酸鈣具有良好的分散性，預(yù)膠化淀粉具有良好的流動性、黏合性和崩解性，這些特性使它們在昆蟲病原線蟲顆粒劑研發(fā)中得到很好的應(yīng)用，而且，木質(zhì)素對紫外線有一定的吸收作用[2735]。蛭石和黑炭均具有良好的透氣性，蛭石良好的透氣性使其在昆蟲病原線蟲活體繁殖方面得到了應(yīng)用[36]。因此，這4種介質(zhì)均有可能成為昆蟲病原線蟲較理想的載體，但是這些介質(zhì)能否提高海濱斯氏線蟲抗紫外脅迫的能力尚不明確?；谶@些原因，我們開展了以上的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，從線蟲存活率、殺蟲活性和水平運動能力3方面分析，雖然儲存于預(yù)膠化淀粉中的海濱斯氏線蟲存活率較高，但是在殺蟲活性和水平運動能力方面，明顯低于儲存于木質(zhì)素磺酸鈣中的海濱斯氏線蟲。綜合考慮，木質(zhì)素磺酸鈣應(yīng)是海濱斯氏線蟲抵抗紫外脅迫介質(zhì)的第一選擇。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，無菌蒸餾水（CK）中的海濱斯氏線蟲隨著紫外脅迫時間的延長，其存活率和對大蠟螟的致死率均有不同程度的下降。這與Gaugler研究的Neoaplectana carpocapsae經(jīng)紫外線照射不同時間后線蟲存活率和致病力下降的結(jié)果一致[18]。紫外脅迫30 min后，海濱斯氏線蟲存活率在80%以上，這個結(jié)果與Heterorhabditis brevicaudis和Sfeltiae不同品系經(jīng)紫外照射30 min后線蟲存活率在80%以上的結(jié)果一致[16]。這說明海濱斯氏線蟲對紫外脅迫同樣具有一定的耐受能力。同時，紫外脅迫120 min比脅迫90 min時線蟲的水平運動能力稍強(qiáng)。這可能是由于隨著紫外脅迫壓力的增大，線蟲抵抗這種脅迫的相關(guān)代謝活動加強(qiáng)，促使其短時間內(nèi)運動能力增強(qiáng)，這與相關(guān)研究推測的紫外脅迫會對昆蟲病原線蟲的遷移能力產(chǎn)生影響的結(jié)論相互印證[13，16，21，37]。另外，當(dāng)紫外脅迫達(dá)到一定程度后，線蟲體內(nèi)的部分相關(guān)基因會選擇沉默或被激活，從而會激發(fā)并加強(qiáng)了線蟲抗氧化能力及能量代謝，以便盡可能地降低體內(nèi)活化氧等物質(zhì)引起的傷害[13，21，38]。紫外脅迫引起海濱斯氏線蟲體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生怎樣的變化，尚有待于進(jìn)一步的研究。

綜上，木質(zhì)素磺酸鈣是昆蟲病原線蟲較理想的抗紫外介質(zhì)，其在抗紫外的同時能較好地保持其對害蟲的侵染力，對環(huán)境友好，是極具開發(fā)潛力的介質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）