趙鵬宇 燕平梅 趙曉東 白雪

摘要 ：本研究旨在科學評價威百畝熏蒸對土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響，為環(huán)境友好型消毒劑的選擇提供理論線索。本研究以實驗室威百畝熏蒸的土壤為材料，通過高通量測序技術(shù)，研究威百畝熏蒸對土壤細菌群落的影響及熏蒸后土壤微生物群落重建及功能修復的機制。結(jié)果表明：高通量測序總共測得1 062 241個高質(zhì)量序列，共比對出5 882個細菌分類單元（OTUs）。熏蒸處理后不同階段土壤細菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上較為類似，但是在種水平差異顯著。威百畝熏蒸處理對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能造成很大影響，使得細菌群落α多樣性、群落構(gòu)建的驅(qū)動因素、共發(fā)生網(wǎng)絡關(guān)系以及碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝等代謝活性在熏蒸處理后的初、中期階段表現(xiàn)出上升或者下降的趨勢，并在處理后的中后期迅速恢復并趨于平穩(wěn)。以上結(jié)果表明，威百畝處理對細菌群落造成強烈的“生態(tài)擾動”，導致細菌群落表現(xiàn)出“抑制激活恢復”的階段性特征。微生物群落的穩(wěn)定性與群落的抵抗力和恢復力密切相關(guān)。本研究為科學評價威百畝土壤消毒對土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響提供理論支撐，為環(huán)境友好型消毒劑的選擇提供線索。

關(guān)鍵詞 ：土壤消毒; 威百畝; 土壤微生物群落; 功能重建

中圖分類號：

Q 939.96

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020461

Reconstruction and functional recovery of soil microbial community

after fumigation of metam-sodium

ZHAO Pengyu*， YAN Pingmei， ZHAO Xiaodong， BAI Xue

（Department of Biology， Taiyuan Normal University， Jinzhong 030619， China）

Abstract

The purpose of this study is to scientifically evaluate the impact of metam-sodium fumigation on the soil micro-ecosystem and provide theoretical clues for the selection of environment-friendly disinfectants. The influence of metam-sodium fumigation on soil bacterial community and the mechanism of reconstruction and functional restoration of soil microbial community after fumigation were studied in the laboratory through high-throughput sequencing technology using metam-sodium fumigated soil as the material. A total of 1 062 241 high-quality sequences were obtained by high-throughput sequencing，among which a total of 5 882 bacterial taxa （OTUs） were identified. The soil bacterial community structures were similar at the phylum level at different stages after fumigation treatment，but show significant difference at the species level. Metam-sodium fumigation had a great impact on the structure and function of the microbial community， the alpha diversity of bacterial community， the driving factors of community construction， the co-occurring network relationship and the metabolic activity showed an increase or a downward trend at the initial and middle stages after metam-sodium fumigation， but quickly recovered and stabilized in the later period after the application of metam-sodium. The above results indicated that the application of metam-sodium caused a strong “ecological disturbance” to the bacterial community， resulting in phase characteristics of “inhibition-activation-recovery” in the bacterial community. The stability of microbial community was closely related to the resistance and resilience of the community. This study provides a theoretical support for the scientific evaluation of the impact of soil disinfection with metam-sodium on the soil micro-ecosystem and provides clues for the selection of environment-friendly disinfectants.

Key words

soil disinfection; metam-sodium; soil microbial community; functional reconstruction

土壤消毒可以有效控制作物連作條件下的土傳病害和地下害蟲，是保護農(nóng)田種植行之有效的生產(chǎn)技術(shù)。土壤熏蒸劑是利用其揮發(fā)時產(chǎn)生的氣體來毒殺有害生物的一類農(nóng)藥。然而，由于熏蒸劑作用效果的廣譜性，在施用過程中不可避免地會對土壤中非目標微生物的組成及功能活性造成影響，進而改變整個土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，尤其是養(yǎng)分轉(zhuǎn)化過程[1]。與其他二硫代氨基甲酸鹽農(nóng)藥一樣，威百畝通過干擾病原菌呼吸酶（如丙酮酸脫氫酶）來發(fā)揮其生物活性。異硫氰酸甲酯是威百畝的降解產(chǎn)物，也是熏蒸過程的關(guān)鍵生物活性物質(zhì)[25]。從施用效果上看，威百畝熏蒸對土傳病害、地下害蟲及雜草的防治效果能夠替代溴甲烷，但其是否是優(yōu)良的環(huán)境友好型熏蒸劑目前尚未見報道。

土壤熏蒸引起的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的破壞可以視為一種生態(tài)上的“擾動”。土壤熏蒸對土壤生態(tài)系統(tǒng)“擾動”的程度與多種因素有關(guān)，主要包括熏蒸劑種類、劑型與施用量[6]、本底微生物群落組成[7]、土壤施肥歷史、土壤理化因子[8]及其質(zhì)地[9]等，并且與施肥策略[10]也有很大的關(guān)系。一方面，威百畝處理造成的生態(tài)“擾動”對土壤微生物群落造成強烈的環(huán)境脅迫，是研究農(nóng)藥施用對土壤微生物群落影響的理想實驗模型;另一方面，這種特殊的“擾動”可以用于設計微宇宙試驗，研究“擾動”后土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的重建過程。因此，熏蒸可以作為一種研究手段來深入探討土壤生態(tài)系統(tǒng)的“擾動抗逆恢復平衡”過程，研究“擾動”對隨后的群落重建和功能恢復的影響機制。

本研究以實驗室威百畝熏蒸處理的土壤為試驗材料，通過高通量測序技術(shù)，探究威百畝熏蒸對土壤細菌群落的影響及 “擾動”后土壤微生物群落重建及功能恢復情況，以期科學評價威百畝土壤熏蒸對土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響，為環(huán)境友好型消毒劑的選擇提供理論線索;并為土壤生態(tài)系統(tǒng)的維穩(wěn)機制提供一定的理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供試土壤為山西省太原市小店區(qū)黃瓜大棚連作3年以上的土壤。土壤為沙壤土，其理化性質(zhì)為：堿解氮50.08 mg/kg，有機質(zhì)27.85 g/kg，全氮1.27 g/kg，速效鉀223 mg/kg，有效磷43.96 mg/kg，pH 6.98。

藥劑：42%威百畝水劑（AS），大連染料化工有限公司。

1.2 微宇宙的設置以及取樣設置

微宇宙試驗在一個含有300 g土的廣口瓶中進行。42%威百畝AS的劑量設置為70 mg/kg（參考文獻[11]，略有改動），共設置6個重復，以加入等量的蒸餾水為對照，對照設置3個重復。試驗時先用滅菌蒸餾水調(diào)整土壤濕度至田間最大持水量的60%，之后將藥劑均勻施加到土壤中，立即使用瓶塞和凡士林封閉瓶口，然后放置在25℃的黑暗條件中恒溫培養(yǎng)7 d。7 d后移除瓶塞，瓶口用透氣塑料膜再次封好，以避免空氣中的雜菌污染土壤。

移除瓶塞后在微生物的重建過程中定期加入滅菌水來彌補土壤中水分的損失。分別于移除瓶塞后3 d（本研究簡寫為F），15 d（S），40 d（T）從每個廣口瓶中取1 g土壤樣本，盡量保持土壤完整，避免破壞性取樣。部分用于分析土壤物理化學參數(shù);剩余部分儲存在-80℃冰箱中用于后續(xù)核酸的提取。

1.3 DNA提取、PCR擴增和測序

使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit（Omega，USA）提取土壤DNA。用酶標儀Infinite200 PRO（TECAN，Switzerland）測定DNA的純度和濃度。DNA的A260/A280在1.8～2.0時可用于下一步試驗。

擴增體系（25 μL）：5 U/μL Plantium Taq 0.5 μL，10×EasyTaq Buffer（Mg2+ Plus）5.0 μL，dNTPs 40 μL，50 μmol/L引物0.5 μL，DNA模板5.0 μL，加入無菌水至25 μL。PCR反應條件：95℃ 3 min;95℃ 30 s，62℃30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán);72℃ 5 min。

從每個土壤樣品中提取3個DNA樣品，將其PCR產(chǎn)物充分混勻后送上海美吉生物技術(shù)工程有限公司，通過Illumina Miseq測序平臺，對16S rDNA高變區(qū)V3-V4區(qū)進行測序。

1.4 群落構(gòu)建過程分析

為了觀察群落構(gòu)建過程的驅(qū)動因素，參考Stegen等[1214]提出一種基于系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)的分析方法（圖1）。

1.5 統(tǒng)計分析

采用單因素方差分析（ANOVA）評估威百畝熏蒸處理后不同階段細菌群落α多樣性、優(yōu)勢類群、群落構(gòu)建的驅(qū)動因素、共發(fā)生網(wǎng)絡關(guān)系以及功能預測的差異。利用非度量多維尺度分析（NMDS）對熏蒸處理后不同階段的細菌群落進行排序分析。共發(fā)生網(wǎng)絡分析是基于OTU豐度，利用斯皮爾曼等級相關(guān)矩陣（Spearman correlation matrix）評估變量之間的相關(guān)性，篩選出相關(guān)系數(shù)大于0.6且呈顯著相關(guān)的OTUs（否則，剔除）。然后采用false discovery rate（FDR<0.05）校正P值。網(wǎng)絡分析的參數(shù)運算使用R語言中igragh程序包，并且在Gepih軟件中可視化（https：∥gephi.org/）。物種的共存格局（co-occurrence pattern）是由嵌套程度和離散程度共同決定，因此使用WNODF指數(shù)來評估群落中物種的嵌套程度（degree of nestedness）;使用C值來判定群落的聚集/分離（aggregation/segregation）程度。使用PICRUSt2針對樣本中微生物群落的功能組成進行功能預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 威百畝熏蒸對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

高通量測序總共獲得1 062 241個高質(zhì)量序列，比對出5 882個細菌分類單元（OTUs）。測序的覆蓋度指數(shù)為99.19%～99.75%，這表明所比對的序列能夠涵蓋絕大部分土壤樣品中的細菌序列。

共有3 439個OTUs（58.46%）是在威百畝熏蒸處理后不同階段（CK、處理后3、15 d和 40 d）所共有的（圖2）。其中，14個（0.23%）、29個（0.49%）、63個（1.07%）和144個（2.44%）OTUs分別只在CK、處理后3、15 d和40 d中檢測出。并且，CK組的OTUs數(shù)相對最小，而處理后40 d（T階段）的OTUs相對最多。

本研究相對豐度大于0.01%的細菌門總共比對出13個（圖3）。威百畝熏蒸處理后不同階段，放線菌門Actinobacteria的相對豐度最高（平均相對豐度32.05%），其次是變形菌門Proteobacteria（2224%）和綠彎菌門Chloroflexi（15.80%）。其中，放線菌門在熏蒸處理后3 d的相對豐度最高（33.68%），在CK組的相對豐度最低（26.35%）;變形菌門在熏蒸處理后3 d的相對豐度最高（2398%），在15 d的相對豐度最低（21.97%）;綠彎菌門在熏蒸處理后40 d的相對豐度最高（1718%），在15 d的相對豐度最低（14.33%）。并且，如圖4所示，放線菌門和Bacteroidota菌群在處理后不同階段的相對豐度有顯著差異（P<0.05），而其他菌群的相對豐度在處理后不同階段無顯著差異（P>0.05）。

使用非度量多維尺度分析（NMDS）對熏蒸處理后不同階段的處理組與對照組細菌群落結(jié)構(gòu)（種水平）進行排序分析（圖5）。結(jié)果表明，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)在處理后相同階段內(nèi)相似程度高，而在不同階

段差異較大。組間差異顯著性分析（ADONIS， P<0.01）表明，微生物群落結(jié)構(gòu)在不同階段有顯著

差異。綜上，在熏蒸處理后不同階段，細菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上較為類似，但是在種水平上差異顯著。

2.2 熏蒸處理后不同階段的細菌群落多樣性及其多樣性維持機制

如圖6所示，威百畝熏蒸處理后，土壤微生物群落的多樣性受到很大影響。Sobs指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)在CK組分別為3 104、4 158和4 200，處理后3 d分別降低為2 678、3 780和3 840;處理后15 d分別升高為3 105、4 144和4 134，且處理后3 d和15 d存在顯著差異（P<0.05）;處理后40 d Sobs指數(shù)（3 246）、ACE指數(shù)（4 235）和Chao指數(shù)（4 228）和15 d時基本持平，兩者間無顯著差異（P>0.05）。另一方面，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，在CK、處理后3、15 d和40 d均沒有顯著差異（P>0.05）。綜上，土壤微生物多樣性（尤其是豐富度）在處理后不同階段呈現(xiàn)出先下降后上升再平穩(wěn)的階段性特征。

群落多樣性的維持機制就是群落構(gòu)建的驅(qū)動機制，即群落構(gòu)建機制。根據(jù)熏蒸處理后不同階段土壤細菌群落結(jié)構(gòu)betaNTI值的結(jié)果（圖7），參考Stegen等的群落構(gòu)建劃分方法[12]，推斷群落構(gòu)建過程在CK、處理后3 d和40 d更多地受到變量選擇的影響（heterogeneous selection），其betaNTI值（箱線圖中的中位數(shù)）大于2（圖7）。并且，在處理后15 d，betaNTI值為1.85，表明細菌群落在處理后15 d更多地受到隨機過程的驅(qū)動（|betaNTI|<2）。

2.3 熏蒸處理后不同階段土壤細菌群落共發(fā)生網(wǎng)絡分析

細菌群落共發(fā)生網(wǎng)絡分析（co-occurrence network）主要反映某一環(huán)境條件下微生物群落的共存格局，可以在一定程度上反映群落的種間關(guān)系。通過微生物群落共發(fā)生網(wǎng)絡分析，相比于熏蒸處理后各階段，CK組的邊數(shù)量（1 648）、節(jié)點數(shù)量（232）、聚集系數(shù)（0.51）、模塊數(shù)（6）和平均度（14.16）都是最小的;而在熏蒸處理后3 d，節(jié)點數(shù)量（282）、聚集系數(shù)（0.56）和模塊數(shù)（16）都是最大的;15 d和40 d的節(jié)點數(shù)量、聚集系數(shù)和模塊數(shù)處于兩者之間。這表明，細菌群落的共發(fā)生網(wǎng)絡關(guān)系也具有一定的階段性特征。

通常將除外圍節(jié)點（peripherals）外的其余3種類型的節(jié)點（connectors、module hubs和network hubs）歸為關(guān)鍵節(jié)點，而網(wǎng)絡關(guān)系中的關(guān)鍵節(jié)點是群落中起關(guān)鍵作用的核心物種[15]。本研究通過微生物共發(fā)生網(wǎng)絡的模塊內(nèi)連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi）來鑒定核心物種（圖9），結(jié)果表明，熏蒸處理后3 d的核心物種數(shù)量更多，而CK組的核心物種數(shù)量較少。這表明，群落的核心物種在熏蒸后呈現(xiàn)出先上升后下降的階段性特征。

為了揭示細菌群落的共存格局（co-occurrence patterns），本研究計算了群落中物種的嵌套指數(shù)WNODF值與C值（表1）。結(jié)果表明，處理后3 d的WNODF值最大（49.23），CK組的WNODF值最?。?8.42），這表明群落在處理后3 d的嵌套結(jié)構(gòu)更明顯。另一方面，由于處理后3 d的C值最高（043，P<0.01），表明細菌群落在處理后3 d具有更顯著的離散格局（segregated pattern）。綜上，細菌群落的共存格局在處理后也有一定的階段性特征。

2.4 熏蒸處理后不同階段的代謝活性分析

通過PICRUSt2對KEGG Pathway level 2進行單因素方差分析（表2），篩選出代謝活性前15的微生物群落代謝通路，其中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、膜運輸、核苷酸代謝、翻譯、脂質(zhì)代謝、復制和修復、信號轉(zhuǎn)導、異種生物的生物降解和代謝、降解等在3 d的活性都是最小的。但是，在15 d和40 d又會顯著升高，且和CK組的基本持平。進一步推斷可知，細菌群落的代謝活性在熏蒸處理后不同階段呈現(xiàn)出先下降再上升的階段性特征。

3 討論

當前我國針對農(nóng)田種植正大力倡導減肥減藥，土壤熏蒸技術(shù)是行之有效的解決手段。然而，土壤熏蒸在極大程度上殺死病原微生物的同時，也不可避免地會顯著改變土壤細菌[1617]、真菌[18]及線蟲[19]的群落組成，對土壤生態(tài)系統(tǒng)造成“擾動”。

威百畝作為溴甲烷的替代品之一，因其具有良好的土壤熏蒸效果而在農(nóng)業(yè)領域得到了廣泛應用[20]。威百畝熏蒸會對土壤的生物地球化學循環(huán)、土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生深遠影響[11]。本研究結(jié)果表明，威百畝熏蒸處理后不同階段的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上較為類似，但是在種水平上差異顯著。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，威百畝熏蒸后土壤中細菌群落和優(yōu)勢菌群發(fā)生了改變，但是在門水平上樣本之間差異卻不明顯。本研究中，土壤細菌群落的多樣性（尤其是豐富度）在熏蒸處理后3 d顯著降低，但是在熏蒸處理后15 d和40 d又顯著升高，表現(xiàn)出先下降后上升的階段性特征，這種變化趨勢與卜東欣等[22]的研究結(jié)果類似。這可能是因為威百畝對土壤細菌群落產(chǎn)生強烈的毒性效應，可殺死大部分的細菌類群。但是，少數(shù)耐藥性較強的菌群可存活下來。另外，威百畝打破了原來土壤微生物群落的平衡，使微生物群落形成一個短暫的“生態(tài)真空期”，為這些耐藥性強的細菌菌群提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，使其迅速增殖達到一定的平衡。這就解釋了本研究細菌群落在熏蒸處理后具有階段性特征的原因。土壤細菌群落對這種強烈的 “生態(tài)擾動”表現(xiàn)出“抑制激活恢復”的趨勢[22]。

本研究得出的群落構(gòu)建機制也從另一方面佐證了細菌群落在熏蒸處理后表現(xiàn)出的“抑制激活恢復”的階段性特征。施用威百畝而造成的“擾動”會導致土壤理化因子和質(zhì)地的劇烈變化，增加了環(huán)境異質(zhì)性，導致細菌群落的相異性增加，這就是變量選擇對群落的驅(qū)動作用[1214]。本研究結(jié)果也表明，在熏蒸處理后第3天群落的結(jié)構(gòu)、多樣性、共發(fā)生網(wǎng)絡關(guān)系以及功能屬性等變化都是最大的。而在熏蒸處理后第15天由于耐藥性菌群的大量增殖，隨機過程（擴散、漂變和多樣化）可能占據(jù)主動地位。而在熏蒸處理后40 d，細菌群落達到平穩(wěn)狀態(tài)，這時又會受到環(huán)境異質(zhì)性以及種內(nèi)排斥等的限制，變量選擇對群落的驅(qū)動作用增加。

本研究結(jié)果表明：熏蒸處理后3 d時節(jié)點數(shù)量、聚集系數(shù)和模塊數(shù)都是最大的。在微生物共發(fā)生網(wǎng)絡分析中，模塊化程度越高（modularity），網(wǎng)絡越密集，表明微生物群落越復雜[23]。這可能是因為細菌群落在熏蒸處理后3 d受到變量選擇的驅(qū)動作用，群落的相異性增加，因而此階段的群落共發(fā)生網(wǎng)絡關(guān)系也就越復雜。另外，菌群在熏蒸處理后第3天表現(xiàn)出更加顯著的嵌套結(jié)構(gòu)（WNDF值最大）和離散格局（C值最大，且P<0.01），這可能也是變量選擇驅(qū)動的結(jié)果。在隨后的15 d和40 d，群落的節(jié)點數(shù)量、聚集系數(shù)和模塊數(shù)略微降低，可能是變量選擇的驅(qū)動作用減小，群落的相似性增加的結(jié)果。但是，共發(fā)生網(wǎng)絡關(guān)系的變化趨勢并沒有微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性和功能活性變化那么明顯，可能是因為微生物群落中物種數(shù)極多，代際周期短，并且存在一定程度的功能冗余。

微生物群落的結(jié)構(gòu)組成可以在時間或者空間上展現(xiàn)出復雜的變化，例如，在不同的海水層[24]或者亞高山森林的海拔梯度上[25]，這些變化最終會影響其所執(zhí)行的群落功能[26]。本研究結(jié)果表明，威百畝熏蒸處理后微生物群落代謝活性呈現(xiàn)出先下降后上升的特征，也表現(xiàn)出“抑制激活恢復”的階段性特征。并且群落功能活性的變化趨勢也與群落結(jié)構(gòu)的變化大致相同。

本研究中微生物群落在熏蒸處理后表現(xiàn)出的階段性特征與微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。而微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性又與微生物群落的抵抗力（resistance）和恢復力（resilience）密切相關(guān)。抵抗力指微生物群落自身具備的抵抗自然或者環(huán)境因子脅迫并維持原來狀態(tài)不變的能力。土壤經(jīng)過威百畝熏蒸處理后，遭受強烈的“生態(tài)擾動”，微生物群落的抵抗力被打破，微生物菌群受到強烈的脅迫。脅迫帶來的選擇壓力可以促進初始群落迅速進化，而這種迅速進化是微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能對特定脅迫尤其是長期脅迫產(chǎn)生抵抗力和恢復力的重要機制[27]，帶來的直接效應就是群落中的土壤細菌群落豐富度、多樣性迅速減小。另一方面，恢復力是指系統(tǒng)受到自然或人為環(huán)境因子的脅迫后恢復至原有狀態(tài)的能力[28]。微生物群落較強的適應性能夠保證其在變化的環(huán)境中迅速恢復穩(wěn)定。有研究指出真菌群落和叢枝菌根真菌在不同的環(huán)境條件和農(nóng)業(yè)管理措施下，對水分限制都表現(xiàn)出顯著的抵抗力和恢復力[29]。

4 結(jié)論

本研究以實驗室威百畝熏蒸處理的土壤為材料，通過高通量測序技術(shù)，研究威百畝熏蒸處理對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，也探究了“擾動”后土壤微生物群落重建及功能恢復的機制。結(jié)果表明，在威百畝處理后，微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)、群落構(gòu)建機制、種間關(guān)系和功能都表現(xiàn)出“抑制激活恢復”的階段性特征。

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（責任編輯：楊明麗）