董晨 魏永贊 王弋 鄭雪文 李偉才

摘?要：?木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）是一類重要的糖苷水解酶，在促進(jìn)植物細(xì)胞壁延展以及響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用。為研究荔枝XTH家族基因在不同花穗處理方式下的表達(dá)情況，該文以‘妃子笑荔枝為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)‘妃子笑花穗進(jìn)行疏花和噴施烯效唑處理;基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出29個(gè)LcXTH家族成員，利用熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對(duì)LcXTH基因家族成員在不同處理后花穗的表達(dá)進(jìn)行研究，分析XTH家族基因?qū)Σ煌ㄋ胩幚矸绞降捻憫?yīng)情況。結(jié)果表明：LcXTH家族基因成員表達(dá)在對(duì)照、疏花處理和烯效唑處理后花穗不同發(fā)育階段表達(dá)規(guī)律不同，且不同基因存在表達(dá)量的差異。其中LcXTH 亞家族Ⅲ、LcXTH 亞家族Ⅳ（LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23）成員及LcXTH20表達(dá)量較高，推測(cè)在花穗發(fā)育中起關(guān)鍵作用?！有ㄋ胧杌ㄌ幚?4 d后LcXTH家族大部分成員表達(dá)上調(diào)，推測(cè)疏花對(duì)LcXTH的表達(dá)起到正調(diào)控作用;‘妃子笑花穗噴施烯效唑后LcXTH家族成員的表達(dá)下調(diào)，推測(cè)烯效唑處理對(duì)LcXTH的表達(dá)起到負(fù)調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 荔枝， 不同處理， XTH基因家族， RT-qPCR， 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：?Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

文章編號(hào)：?1000-3142（2021）04-0514-08

Abstract：?Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase （XTH） is an important class of glycoside hydrolase that plays an important role in promoting plant cell wall elongation and responding to stress. In order to study the expression of the XTH family genes in different inflorescence treatments，?29 LcXTH family members were identified with ‘Feizixiao litchi as the experimental material， based on the pre-transcriptome database.?The inflorescences of litchi were treated with flower thinning and uniconazole treatment， respectively.?Expressions of LcXTH gene family members in different inflorescences were studied by real-time PCR （RT-qPCR）， and the response of LcXTH family genes to different inflorescence?treatments were analyzed. The results showed that the expressions of LcXTH family members were different in the different flower developmental stages?after control， flower thinning treatment and uniconazole treatment， and there are differences in the expression levels of different genes. Among them， members of LcXTH subfamily Ⅲ， LcXTH subfamily Ⅳ （LcXTH2， LcXTH3， LcXTH4， LcXTH5， LcXTH6， LcXTH7， LcXTH9， LcXTH10， LcXTH11， LcXTH12， LcXTH13， LcXTH22 and LcXTH23） and LcXTH20 had higher expression levels， presumably it plays a key role in flower development. LcXTH expression was up-regulated at the 14 d after flower thinning， and we speculated flower thinning had a positive regulation effect on LcXTH. Uniconazole treatment inhibited the expression of LcXTH and negatively regulated LcXTH.

Key words： litchi， different treatments， XTH gene family， RT-qPCR， gene expression

荔枝是原產(chǎn)于中國(guó)重要的熱帶亞熱帶水果，目前荔枝產(chǎn)業(yè)已成為中國(guó)南方熱作區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，在農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及熱區(qū)果農(nóng)收入水平的提高方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。‘妃子笑荔枝花穗具有花穗長(zhǎng)、花量大等特點(diǎn)，生產(chǎn)上需要對(duì)荔枝的花穗進(jìn)行調(diào)控處理提高坐果，調(diào)控措施通過機(jī)械疏花或是化學(xué)調(diào)控。荔枝花穗的生長(zhǎng)和發(fā)育涉及細(xì)胞壁松動(dòng)和用于修飾細(xì)胞的細(xì)胞壁中的各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育期間細(xì)胞壁的重塑。眾所周知，纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞壁重塑方面起主導(dǎo)作用，其中木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）是細(xì)胞壁重構(gòu)過程的關(guān)鍵酶。木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶/水解酶（XTHs）在促進(jìn)植物細(xì)胞壁延展以及響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶/水解酶由多基因家族編碼的一大類蛋白質(zhì)，屬于糖基水解酶家族16，具有轉(zhuǎn)糖基酶（XET）和水解酶（XEH）雙重作用（Nishitani & Tominaga，1992）。大多數(shù)XTH酶具有保守的DEIDFEFLG基序，被認(rèn)為是木葡聚糖內(nèi)切水解酶（XEH）活性和木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶（XET）活性的催化位點(diǎn)（Campbell & Braam，1998）。XTH基因家族的另一個(gè)結(jié)構(gòu)特征是該基因的第一個(gè)外顯子的最前端序列編碼并將XTH蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的信號(hào)肽（Yokoyama et al.，2004）。在植物體中XTH多以基因家族的形式存在，目前隨著多個(gè)物種的基因組測(cè)序完成，越來越多的植物，如擬南芥（Berardini et al.， 2004）、水稻（Yokoyama et al.，2004）、小麥（Liu et al.，2007）、草莓（Opazo et al.，2010）、谷子（元香梅等，2017）、番茄（Saladié et al.，2006）、苧麻（陳悰，2017）、毛果楊（Geislerlee et al.，2006）等的XTH基因家族得以鑒定。董晨等（2019）基于轉(zhuǎn)錄組對(duì)荔枝XTH基因家族29個(gè)成員進(jìn)行了鑒定及生物信息學(xué)分析，通過對(duì)XTH基因家族29個(gè)成員聚類分成4個(gè)亞家族，本研究在前期研究工作基礎(chǔ)上，通過對(duì)‘妃子笑荔枝花穗進(jìn)行短截疏花和噴施烯效唑處理，利用RT-qPCR技術(shù)初步探索兩種處理方式下花穗發(fā)育過程中LcXTH基因家族不同亞家族的表達(dá)變化規(guī)律，為深入了解XTH基因的功能及花穗發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 供試材料

本研究中供試材料‘妃子笑荔枝取自廣東省湛江市湖秀新村南亞熱帶作物研究所荔枝栽培示范園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理?‘妃子笑試驗(yàn)樹隨機(jī)選擇，選擇標(biāo)準(zhǔn)為樹齡相同、長(zhǎng)勢(shì)相近，選取9株為試驗(yàn)樹，在試驗(yàn)樹花穗抽生長(zhǎng)度約18 cm時(shí)，進(jìn)行以下3個(gè)處理：（1）對(duì)照（CK），不做任何處理;（2）疏花（FT）處理，將長(zhǎng)花穗短截至15 cm;（3）烯效唑（Un）處理，采用濃度為50 μg·mL-1烯效唑（品牌為四川國(guó)光，有效成分含量為5%）噴施花穗，噴至花穗滴水;完全隨機(jī)區(qū)組排列，單株小區(qū)，3次重復(fù)。處理后定期觀察，分別取對(duì)照及兩種處理后不同時(shí)間點(diǎn)（0、7、14、28、42 d）的整個(gè)花穗，液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱備用，用于RNA的提取。

1.2.2 荔枝XTH基因家族表達(dá)分析?采用華越洋生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒提取花穗總RNA。取提取后樣品1 μL檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，樣品符合要求后，利用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa ）將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增荔枝肌動(dòng)蛋白基因（GenBank登錄號(hào)HQ615689）作為L(zhǎng)cActin內(nèi)參（Zhong et al.，2011），根據(jù)轉(zhuǎn)錄組（GenBank accession SRP092890）中注釋的LcXTH的核苷酸序列（Wei et al.，2017），利用在線軟件Primer3plus設(shè)計(jì)熒光定量引物（引物序列見表 1），通過BLAST分析引物的特異性，委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成引物序列。RT-qPCR分析采用SYBR Premix Ex TaqTM （ TaKaRa） 試劑盒，Roche 480 Ⅱ定量PCR系統(tǒng)（瑞士），采用384孔板，RT-qPCR反應(yīng)體系為 10 μL， 其中 cDNA 1 μL（相當(dāng)于25 ng總RNA），2 μL 基因特異性引物，5 μL 2×SYBR Premix ExTaq，用去RNA酶的 ddH2O 補(bǔ)足 10 μL。反應(yīng)條件： 94 ℃ 預(yù)變性 2 min; 94 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行 3 次重復(fù)。 采用2-ΔΔCT 法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

2?結(jié)果與分析

2.1 LcXTH基因家族亞家族I表達(dá)情況分析

LcXTH基因家族亞家族I共有3個(gè)基因成員，分別為L(zhǎng)cXTH18、LcXTH20和LcXTH27。3個(gè)基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)情況見圖1。LcXTH亞家族I基因在不同處理花穗不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異;不同處理中LcXTH20的表達(dá)量最強(qiáng)，且均在28 d達(dá)到峰值;不同處理中LcXTH18和LcXTH27在28 d的表達(dá)量為對(duì)照>疏花>烯效唑，表明疏花處理和烯效唑處理抑制LcXTH18和LcXTH27的表達(dá)，其中烯效唑抑制效果明顯。LcXTH27在不同處理42 d表達(dá)量烯效唑處理較對(duì)照和疏花處理差異顯著。

2.2 LcXTH基因家族亞家族Ⅱ表達(dá)情況分析

LcXTH基因家族亞家族Ⅱ共有4個(gè)基因成員，分別為L(zhǎng)cXTH17、LcXTH19、LcXTH26和LcXTH28。4個(gè)基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)情況見圖2。LcXTH亞家族Ⅱ成員在不同處理下花穗不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量較低。LcXTH17的表達(dá)在對(duì)照中表達(dá)趨勢(shì)先下調(diào)，隨后在14 d表達(dá)上調(diào)，28、42 d逐漸下調(diào);疏花、烯效唑處理表達(dá)趨勢(shì)與對(duì)照一致，但不同處理間存在表達(dá)量的差異，烯效唑處理相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照和疏花處理略低。LcXTH19的表達(dá)趨勢(shì)在對(duì)照和疏花處理中為逐漸下調(diào)，烯效唑處理LcXTH19的表達(dá)趨勢(shì)為先下調(diào)，14 d表達(dá)上調(diào)后又逐漸下調(diào)。LcXTH26的表達(dá)在不同處理前期表達(dá)沒有明顯變化，在14 d疏花處理中表達(dá)明顯升高，隨后在28、42 d表達(dá)逐漸降低。而對(duì)照和烯效唑處理LcXTH26的表達(dá)下降的不明顯。LcXTH28在不同處理中表達(dá)趨勢(shì)為逐漸下調(diào)。

2.3 LcXTH基因家族亞家族Ⅲ表達(dá)情況分析

LcXTH基因家族亞家族Ⅲ共有3個(gè)基因，分別為L(zhǎng)cXTH8、LcXTH25和LcXTH29。3個(gè)基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)情況見圖3。LcXTH亞家族Ⅲ成員在不同處理花穗不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但在表達(dá)量存在差異。LcXTH8和LcXTH25在對(duì)照和疏花處理14 d表達(dá)量均達(dá)到峰值，烯效唑處理LcXTH8和LcXTH25表達(dá)高峰延遲，且表達(dá)量較對(duì)照和疏花處理要低。LcXTH29在疏花處理中的表達(dá)趨勢(shì)與LcXTH8和LcXTH25一致。LcXTH29在相對(duì)表達(dá)量逐漸上調(diào)，在28 d表達(dá)量最高，隨后表達(dá)急劇下調(diào)，而在烯效唑處理中LcXTH29表達(dá)同樣在28 d達(dá)到最高，但在其他時(shí)期的表達(dá)變化不明顯。

2.4 LcXTH基因家族亞家族Ⅳ表達(dá)情況分析

LcXTH基因家族亞家族Ⅳ共有19個(gè)基因，占基因家族總數(shù)的65%，分別為L(zhǎng)cXTH1、LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH14、LcXTH15、LcXTH16、LcXTH21、LcXTH22、LcXTH23和LcXTH24。19個(gè)基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)情況見圖4和圖5。LcXTH亞家族Ⅳ成員在不同處理花穗不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但在表達(dá)量存在差異。其中LcXTH1、LcXTH14、LcXTH15和LcXTH21表達(dá)量較低，表達(dá)趨勢(shì)一致;而LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23表達(dá)量較高，表達(dá)趨勢(shì)大致一致，但在14 d上述LcXTH在不同處理中表達(dá)差異比較大，其中疏花處理表達(dá)量最高，對(duì)照次之，烯效唑處理表達(dá)量最低。在烯效唑處理中LcXTH表達(dá)量低于對(duì)照和疏花且表達(dá)高峰相對(duì)延遲，在42 d表達(dá)量達(dá)到峰值。LcXTH16的相對(duì)表達(dá)量在不同處理7～42 d間表達(dá)較0 d表達(dá)上調(diào)，而LcXTH24表達(dá)量在不同處理間均在7 d時(shí)達(dá)到峰值，推測(cè)其在7 d發(fā)揮主要作用。

3?討論與結(jié)論

‘妃子笑素有愛花不惜子之說，究其原因是因大量營(yíng)養(yǎng)消耗而導(dǎo)致坐果少甚至有花無果的問題，嚴(yán)重影響了荔枝的產(chǎn)量，限制產(chǎn)業(yè)發(fā)展。在荔枝生產(chǎn)上，常用的是機(jī)械短截疏花和化學(xué)調(diào)控技術(shù)。在花穗生長(zhǎng)期對(duì)長(zhǎng)的荔枝花穗進(jìn)行短截，可明顯地減少花量，增加雌花比例，提高花質(zhì)和坐果率。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的烯效唑處理‘妃子笑荔枝可使花穗的發(fā)育暫緩生長(zhǎng)，花穗短壯，盛花期延遲，花量大大減少，省去‘妃子笑疏花繁重緊張的工作，提高坐果率（李偉才等，2011）。

木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶基因（XTH）在促進(jìn)植物細(xì)胞壁重塑以及響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。Lu et al.（2006）分別從荔枝抗裂和不抗裂兩個(gè)品種中分離鑒定了3個(gè)XET基因LcXET1、LcXET2和LcXET3，其中LcXET在降低荔枝果實(shí)開裂中有著重要作用。本研究通過對(duì)‘妃子笑荔枝不同處理花穗發(fā)育過程中LcXTH基因家族的表達(dá)情況進(jìn)行分析，4個(gè)不同亞家族中對(duì)照和疏花處理LcXTH基因家族在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)規(guī)律大概一致，而烯效唑處理LcXTH基因家族表達(dá)規(guī)律與對(duì)照和疏花處理則存在較大差異;Liu et al.（2007）研究報(bào)道GA誘導(dǎo)XTH的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞壁的重塑，而烯效唑作為GA合成的抑制劑，抑制了花穗的伸長(zhǎng)，導(dǎo)致花穗生長(zhǎng)速率降低，從而導(dǎo)致LcXTH的表達(dá)受抑制，表達(dá)量低于對(duì)照和疏花處理，剛好與前人研究結(jié)果相吻合。轉(zhuǎn)錄層面LcXTH基因家族的不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式的多樣性，說明花穗發(fā)育不同時(shí)期LcXTH活性存在變化，而LcXTH活性與花穗的生長(zhǎng)速率呈正相關(guān)。LcXTH基因家族成員在不同的發(fā)育時(shí)期表達(dá)特點(diǎn)，體現(xiàn)出LcXTH在荔枝花穗發(fā)育過程中細(xì)胞壁重構(gòu)方面發(fā)揮重要作用。花穗發(fā)育不同時(shí)期LcXTH基因家族表達(dá)存在差異，推測(cè)LcXTH基因家族不同成員間分別在不同的花穗發(fā)育時(shí)期發(fā)揮功能。其中LcXTH 亞家族Ⅲ、LcXTH 亞家族Ⅳ（LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23）成員及LcXTH20表達(dá)量較高，推測(cè)其在花穗發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

參考文獻(xiàn)：

BERARDINI TZ， MUNDODI S， REISER L， et al.， 004. Functional annotation of the Arabidopsis genome using controlled vocabularies[J]. Plant Physiol， 135（2）：745.

CAMPBELL P， BRAAM J， 1998. Co-?and/or post-translational modifications are critical for TCH4 XET activity[J]. Plant J， 15（4）：553-561.

CHEN C， 2017. Cloning and expression profiling of XTH family genes in ramie[J]. Wuhan： Huazhong Agricultural University： 27-30.[陳悰， 2017. 苧麻XTH家族基因克隆及表達(dá)分析[J]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)： 27-30.]

DONG C，WEI YZ， WANG Y， et al.， 2019. Transcriptome-wide identification and analysis of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase （XTH） family gene in Litchi chinensis Sonn.[J]. Mol Plant Breed， 17（12）： 3865-3873.[董晨， 魏永贊， 王弋， 等， 2019. 基于轉(zhuǎn)錄組的荔枝XTH家族基因的鑒定及分析[J]. 分子植物育種， 17（12）： 3865-3873]

GEISLERLEE J， GEISLER M， COUTINHO PM， et al.，2006. Poplar carbohydrate-active enzymes gene identification and expression analyses[J]. Plant Physiol， 140（3）： 946-962.

LI WC， WEI YZ， XIE JH， et al.， 2011. The invention relates to a regulation method of ‘Feizixiao litchi inflorescences[P]. Guangdong： CN102132666A， 2011-07-27.[李偉才， 魏永贊， 謝江輝， 等， 2011. 一種‘妃子笑荔枝的花穗調(diào)控方法[P]. 廣東：CN102132666A， 2011-07-27.]

LIU YB， LU SM， ZHANG JF， et al.， 2007. A xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase involves in growth of primary root and alters the deposition of cellulose in Arabidopsis[J]. Planta， 226（6）：1547-1560.

LIU Y， LIU DC， ZHANG HY， et al.， 2007. The α-?and β-expansin and xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase gene families of wheat： Molecular cloning， gene expression， and EST data mining[J]. Genomics， 90（4）：516.

LU W， WANG Y， JIANG Y， et al.， 2006. Differential expression of litchi XET genes in relation to fruit growth[J]. Plant Physiol Biochem， 44（44）：707-713.

NISHITANI K， TOMINAGA R， 1992. Endo-xyloglucan transferase， a novel class of glycosyltransferase that catalyzes transfer of a segment of xyloglucan molecule to another xyloglucan molecule[J]. J Biol Chem， 267（29）： 21058-21064.

OPAZO MC， FIGUEROA CR， HENRIQUEZ J， et al.， 2010. Characterization of two divergent cDNAs encoding xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase （XTH） expressed in Fragaria chiloensis fruit[J]. Plant Sci Int J Exp Plant Biol， 179（5）：479.

SALADIM， ROSE JK， COSGROVE DJ， et al.， 2006. Characterization of a new xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase （XTH） from ripening tomato fruit and implications for the diverse modes of enzymic action[J]. Plant J Cell Mol Biol， 47（2）：282-295.

WEI YZ， DONG C， ZHANG HN， et al.， 2017. Transcriptional changes in litchi （Litchi chinensis Sonn.） inflorescences treated with uniconazole[J]. PLoS ONE， 12（4）：e176053.

YOKOYAMA R， ROSE JKC， NISHITANI K， 2004. A Surprising diversity and abundance of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases in rice[J]. Classif Exp Anal[J]. Plant Physiol， 134（3）：1088.

YUAN XM， HE L， ZHANG KY， et al.， 2017. Analysis of XTH genes that related to drought stress in foxtail millet[J]. J Shanxi Agric Univ （Nat Sci Ed）， 37（1）： 1-6.[元香梅， 禾璐， 張凱燁，等， 2017. 谷子XTH基因家族與抗旱相關(guān)基因的分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 37（1）： 1-6].

ZHONG HY， CHEN JW， LI CQ， et al.， 2011. Selection of reliable reference genes for expression studies by reverse transcription quantitative real-time PCR in litchi under different experimental conditions[J]. Pant Cell Rep， 30（4）：641-653.

（責(zé)任編輯?李?莉）