董晨 魏永贊 王弋 鄭雪文 李偉才

摘?要：?木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）是一類重要的糖苷水解酶，在促進植物細胞壁延展以及響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用。為研究荔枝XTH家族基因在不同花穗處理方式下的表達情況，該文以‘妃子笑荔枝為實驗材料，對‘妃子笑花穗進行疏花和噴施烯效唑處理;基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定出29個LcXTH家族成員，利用熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對LcXTH基因家族成員在不同處理后花穗的表達進行研究，分析XTH家族基因?qū)Σ煌ㄋ胩幚矸绞降捻憫?yīng)情況。結(jié)果表明：LcXTH家族基因成員表達在對照、疏花處理和烯效唑處理后花穗不同發(fā)育階段表達規(guī)律不同，且不同基因存在表達量的差異。其中LcXTH 亞家族Ⅲ、LcXTH 亞家族Ⅳ（LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23）成員及LcXTH20表達量較高，推測在花穗發(fā)育中起關(guān)鍵作用?！有ㄋ胧杌ㄌ幚?4 d后LcXTH家族大部分成員表達上調(diào)，推測疏花對LcXTH的表達起到正調(diào)控作用;‘妃子笑花穗噴施烯效唑后LcXTH家族成員的表達下調(diào)，推測烯效唑處理對LcXTH的表達起到負調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 荔枝， 不同處理， XTH基因家族， RT-qPCR， 基因表達

中圖分類號：?Q943

文獻標(biāo)識碼：?A

文章編號：?1000-3142（2021）04-0514-08

Abstract：?Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase （XTH） is an important class of glycoside hydrolase that plays an important role in promoting plant cell wall elongation and responding to stress. In order to study the expression of the XTH family genes in different inflorescence treatments，?29 LcXTH family members were identified with ‘Feizixiao litchi as the experimental material， based on the pre-transcriptome database.?The inflorescences of litchi were treated with flower thinning and uniconazole treatment， respectively.?Expressions of LcXTH gene family members in different inflorescences were studied by real-time PCR （RT-qPCR）， and the response of LcXTH family genes to different inflorescence?treatments were analyzed. The results showed that the expressions of LcXTH family members were different in the different flower developmental stages?after control， flower thinning treatment and uniconazole treatment， and there are differences in the expression levels of different genes. Among them， members of LcXTH subfamily Ⅲ， LcXTH subfamily Ⅳ （LcXTH2， LcXTH3， LcXTH4， LcXTH5， LcXTH6， LcXTH7， LcXTH9， LcXTH10， LcXTH11， LcXTH12， LcXTH13， LcXTH22 and LcXTH23） and LcXTH20 had higher expression levels， presumably it plays a key role in flower development. LcXTH expression was up-regulated at the 14 d after flower thinning， and we speculated flower thinning had a positive regulation effect on LcXTH. Uniconazole treatment inhibited the expression of LcXTH and negatively regulated LcXTH.

Key words： litchi， different treatments， XTH gene family， RT-qPCR， gene expression

荔枝是原產(chǎn)于中國重要的熱帶亞熱帶水果，目前荔枝產(chǎn)業(yè)已成為中國南方熱作區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，在農(nóng)村經(jīng)濟的發(fā)展及熱區(qū)果農(nóng)收入水平的提高方面發(fā)揮著舉足輕重的作用?！有笾ㄋ刖哂谢ㄋ腴L、花量大等特點，生產(chǎn)上需要對荔枝的花穗進行調(diào)控處理提高坐果，調(diào)控措施通過機械疏花或是化學(xué)調(diào)控。荔枝花穗的生長和發(fā)育涉及細胞壁松動和用于修飾細胞的細胞壁中的各種蛋白質(zhì)在細胞生長和發(fā)育期間細胞壁的重塑。眾所周知，纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò)在細胞壁重塑方面起主導(dǎo)作用，其中木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）是細胞壁重構(gòu)過程的關(guān)鍵酶。木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶/水解酶（XTHs）在促進植物細胞壁延展以及響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶/水解酶由多基因家族編碼的一大類蛋白質(zhì)，屬于糖基水解酶家族16，具有轉(zhuǎn)糖基酶（XET）和水解酶（XEH）雙重作用（Nishitani & Tominaga，1992）。大多數(shù)XTH酶具有保守的DEIDFEFLG基序，被認為是木葡聚糖內(nèi)切水解酶（XEH）活性和木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶（XET）活性的催化位點（Campbell & Braam，1998）。XTH基因家族的另一個結(jié)構(gòu)特征是該基因的第一個外顯子的最前端序列編碼并將XTH蛋白轉(zhuǎn)運到細胞膜或細胞壁的信號肽（Yokoyama et al.，2004）。在植物體中XTH多以基因家族的形式存在，目前隨著多個物種的基因組測序完成，越來越多的植物，如擬南芥（Berardini et al.， 2004）、水稻（Yokoyama et al.，2004）、小麥（Liu et al.，2007）、草莓（Opazo et al.，2010）、谷子（元香梅等，2017）、番茄（Saladié et al.，2006）、苧麻（陳悰，2017）、毛果楊（Geislerlee et al.，2006）等的XTH基因家族得以鑒定。董晨等（2019）基于轉(zhuǎn)錄組對荔枝XTH基因家族29個成員進行了鑒定及生物信息學(xué)分析，通過對XTH基因家族29個成員聚類分成4個亞家族，本研究在前期研究工作基礎(chǔ)上，通過對‘妃子笑荔枝花穗進行短截疏花和噴施烯效唑處理，利用RT-qPCR技術(shù)初步探索兩種處理方式下花穗發(fā)育過程中LcXTH基因家族不同亞家族的表達變化規(guī)律，為深入了解XTH基因的功能及花穗發(fā)育過程中的調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 供試材料

本研究中供試材料‘妃子笑荔枝取自廣東省湛江市湖秀新村南亞熱帶作物研究所荔枝栽培示范園。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理?‘妃子笑試驗樹隨機選擇，選擇標(biāo)準(zhǔn)為樹齡相同、長勢相近，選取9株為試驗樹，在試驗樹花穗抽生長度約18 cm時，進行以下3個處理：（1）對照（CK），不做任何處理;（2）疏花（FT）處理，將長花穗短截至15 cm;（3）烯效唑（Un）處理，采用濃度為50 μg·mL-1烯效唑（品牌為四川國光，有效成分含量為5%）噴施花穗，噴至花穗滴水;完全隨機區(qū)組排列，單株小區(qū)，3次重復(fù)。處理后定期觀察，分別取對照及兩種處理后不同時間點（0、7、14、28、42 d）的整個花穗，液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱備用，用于RNA的提取。

1.2.2 荔枝XTH基因家族表達分析?采用華越洋生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒提取花穗總RNA。取提取后樣品1 μL檢測RNA質(zhì)量和濃度，樣品符合要求后，利用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa ）將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增荔枝肌動蛋白基因（GenBank登錄號HQ615689）作為LcActin內(nèi)參（Zhong et al.，2011），根據(jù)轉(zhuǎn)錄組（GenBank accession SRP092890）中注釋的LcXTH的核苷酸序列（Wei et al.，2017），利用在線軟件Primer3plus設(shè)計熒光定量引物（引物序列見表 1），通過BLAST分析引物的特異性，委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成引物序列。RT-qPCR分析采用SYBR Premix Ex TaqTM （ TaKaRa） 試劑盒，Roche 480 Ⅱ定量PCR系統(tǒng)（瑞士），采用384孔板，RT-qPCR反應(yīng)體系為 10 μL， 其中 cDNA 1 μL（相當(dāng)于25 ng總RNA），2 μL 基因特異性引物，5 μL 2×SYBR Premix ExTaq，用去RNA酶的 ddH2O 補足 10 μL。反應(yīng)條件： 94 ℃ 預(yù)變性 2 min; 94 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共40個循環(huán)。每個樣品進行 3 次重復(fù)。 采用2-ΔΔCT 法計算目標(biāo)基因相對表達量。

2?結(jié)果與分析

2.1 LcXTH基因家族亞家族I表達情況分析

LcXTH基因家族亞家族I共有3個基因成員，分別為LcXTH18、LcXTH20和LcXTH27。3個基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時期表達情況見圖1。LcXTH亞家族I基因在不同處理花穗不同發(fā)育階段均有表達，但表達量存在差異;不同處理中LcXTH20的表達量最強，且均在28 d達到峰值;不同處理中LcXTH18和LcXTH27在28 d的表達量為對照>疏花>烯效唑，表明疏花處理和烯效唑處理抑制LcXTH18和LcXTH27的表達，其中烯效唑抑制效果明顯。LcXTH27在不同處理42 d表達量烯效唑處理較對照和疏花處理差異顯著。

2.2 LcXTH基因家族亞家族Ⅱ表達情況分析

LcXTH基因家族亞家族Ⅱ共有4個基因成員，分別為LcXTH17、LcXTH19、LcXTH26和LcXTH28。4個基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時期表達情況見圖2。LcXTH亞家族Ⅱ成員在不同處理下花穗不同發(fā)育階段均有表達，但相對表達量較低。LcXTH17的表達在對照中表達趨勢先下調(diào)，隨后在14 d表達上調(diào)，28、42 d逐漸下調(diào);疏花、烯效唑處理表達趨勢與對照一致，但不同處理間存在表達量的差異，烯效唑處理相對表達量較對照和疏花處理略低。LcXTH19的表達趨勢在對照和疏花處理中為逐漸下調(diào)，烯效唑處理LcXTH19的表達趨勢為先下調(diào)，14 d表達上調(diào)后又逐漸下調(diào)。LcXTH26的表達在不同處理前期表達沒有明顯變化，在14 d疏花處理中表達明顯升高，隨后在28、42 d表達逐漸降低。而對照和烯效唑處理LcXTH26的表達下降的不明顯。LcXTH28在不同處理中表達趨勢為逐漸下調(diào)。

2.3 LcXTH基因家族亞家族Ⅲ表達情況分析

LcXTH基因家族亞家族Ⅲ共有3個基因，分別為LcXTH8、LcXTH25和LcXTH29。3個基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時期表達情況見圖3。LcXTH亞家族Ⅲ成員在不同處理花穗不同發(fā)育階段均有表達，但在表達量存在差異。LcXTH8和LcXTH25在對照和疏花處理14 d表達量均達到峰值，烯效唑處理LcXTH8和LcXTH25表達高峰延遲，且表達量較對照和疏花處理要低。LcXTH29在疏花處理中的表達趨勢與LcXTH8和LcXTH25一致。LcXTH29在相對表達量逐漸上調(diào)，在28 d表達量最高，隨后表達急劇下調(diào)，而在烯效唑處理中LcXTH29表達同樣在28 d達到最高，但在其他時期的表達變化不明顯。

2.4 LcXTH基因家族亞家族Ⅳ表達情況分析

LcXTH基因家族亞家族Ⅳ共有19個基因，占基因家族總數(shù)的65%，分別為LcXTH1、LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH14、LcXTH15、LcXTH16、LcXTH21、LcXTH22、LcXTH23和LcXTH24。19個基因在不同處理花穗發(fā)育的不同時期表達情況見圖4和圖5。LcXTH亞家族Ⅳ成員在不同處理花穗不同發(fā)育階段均有表達，但在表達量存在差異。其中LcXTH1、LcXTH14、LcXTH15和LcXTH21表達量較低，表達趨勢一致;而LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23表達量較高，表達趨勢大致一致，但在14 d上述LcXTH在不同處理中表達差異比較大，其中疏花處理表達量最高，對照次之，烯效唑處理表達量最低。在烯效唑處理中LcXTH表達量低于對照和疏花且表達高峰相對延遲，在42 d表達量達到峰值。LcXTH16的相對表達量在不同處理7～42 d間表達較0 d表達上調(diào)，而LcXTH24表達量在不同處理間均在7 d時達到峰值，推測其在7 d發(fā)揮主要作用。

3?討論與結(jié)論

‘妃子笑素有愛花不惜子之說，究其原因是因大量營養(yǎng)消耗而導(dǎo)致坐果少甚至有花無果的問題，嚴重影響了荔枝的產(chǎn)量，限制產(chǎn)業(yè)發(fā)展。在荔枝生產(chǎn)上，常用的是機械短截疏花和化學(xué)調(diào)控技術(shù)。在花穗生長期對長的荔枝花穗進行短截，可明顯地減少花量，增加雌花比例，提高花質(zhì)和坐果率。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的烯效唑處理‘妃子笑荔枝可使花穗的發(fā)育暫緩生長，花穗短壯，盛花期延遲，花量大大減少，省去‘妃子笑疏花繁重緊張的工作，提高坐果率（李偉才等，2011）。

木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶基因（XTH）在促進植物細胞壁重塑以及響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。Lu et al.（2006）分別從荔枝抗裂和不抗裂兩個品種中分離鑒定了3個XET基因LcXET1、LcXET2和LcXET3，其中LcXET在降低荔枝果實開裂中有著重要作用。本研究通過對‘妃子笑荔枝不同處理花穗發(fā)育過程中LcXTH基因家族的表達情況進行分析，4個不同亞家族中對照和疏花處理LcXTH基因家族在不同發(fā)育時期表達規(guī)律大概一致，而烯效唑處理LcXTH基因家族表達規(guī)律與對照和疏花處理則存在較大差異;Liu et al.（2007）研究報道GA誘導(dǎo)XTH的表達，調(diào)控細胞壁的重塑，而烯效唑作為GA合成的抑制劑，抑制了花穗的伸長，導(dǎo)致花穗生長速率降低，從而導(dǎo)致LcXTH的表達受抑制，表達量低于對照和疏花處理，剛好與前人研究結(jié)果相吻合。轉(zhuǎn)錄層面LcXTH基因家族的不同發(fā)育時期的表達模式的多樣性，說明花穗發(fā)育不同時期LcXTH活性存在變化，而LcXTH活性與花穗的生長速率呈正相關(guān)。LcXTH基因家族成員在不同的發(fā)育時期表達特點，體現(xiàn)出LcXTH在荔枝花穗發(fā)育過程中細胞壁重構(gòu)方面發(fā)揮重要作用?；ㄋ氚l(fā)育不同時期LcXTH基因家族表達存在差異，推測LcXTH基因家族不同成員間分別在不同的花穗發(fā)育時期發(fā)揮功能。其中LcXTH 亞家族Ⅲ、LcXTH 亞家族Ⅳ（LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23）成員及LcXTH20表達量較高，推測其在花穗發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

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（責(zé)任編輯?李?莉）