吳云輝，閻光宇，余 蕾，張怡評(píng)，楊 婷，晉文慧

(1.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海洋生物學(xué)院，福建 廈門 361100； 2.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005； 3.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005)

紅毛藻(Bangiafusco-purpurea)俗稱紅發(fā)菜、牛毛藻、牛毛海苔，屬紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Florideophyceae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紅毛菜屬(Bangiaatropurpurea)植物。紅毛藻主產(chǎn)于莆田湄洲、南日島一帶海域，顏色褐紅，細(xì)如毛發(fā)，含有豐富的鈣質(zhì)和各種維生素，年產(chǎn)量約為80～100 t(干重)。目前主要作為食品原料銷售，每噸紅毛藻的價(jià)格為(10～30)×104元，然而，關(guān)于紅毛藻精深加工產(chǎn)品尚未見(jiàn)到[1]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)紅毛藻中含有豐富的多糖類成分，這種成分具有降血壓、降血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物活性[1-2]。海藻多糖的提取及活性研究一直是藻類資源研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，但由于紅毛藻價(jià)格較高，關(guān)于紅毛藻多糖的提取工藝及開(kāi)發(fā)應(yīng)用的研究報(bào)道較少。本文對(duì)紅毛藻多糖提取工藝中的料液比、溫度、時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，試制樣品，而后對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為紅毛藻多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅毛藻，購(gòu)自福建莆田南日鎮(zhèn)。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，Sigma公司；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、水楊酸、雙氧水、七水硫酸亞鐵等試劑均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)。

1.2 儀器

UH5300紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；H1650-V離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；QL-901漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-ZK2恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DFT-200粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量測(cè)定方法

精密稱量葡萄糖，用水配制成0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于20 mL具塞試管，加水至1.0 mL，配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/W)和5 mL濃硫酸，每個(gè)樣品加水補(bǔ)足至總體積10 mL，渦旋混勻后于30℃水浴反應(yīng)20 min，之后在 490 nm 測(cè)定吸光度[2]，以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 紅毛藻多糖提取

將干燥的紅毛藻用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩(40目)。稱取紅毛藻粉末1.0 g，置于100 mL三角燒瓶中，按照料液比1∶40(W/V)加入40 mL蒸餾水后，于80℃水浴加熱提取2.0 h，紗布過(guò)濾，離心取上清液，量取濾液體積并測(cè)定吸光度以計(jì)算紅毛藻多糖提取量。

1.3.3 提取液中多糖含量的測(cè)定

取紅毛藻多糖提取液0.5 mL，按照1.3.1方法依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/V)和5 mL濃硫酸，加水補(bǔ)足至10 mL，渦旋混勻，于30℃水浴反應(yīng)20 min后，在490 nm 測(cè)定吸光度[3]，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算提取液濃度，并計(jì)算提取液中紅毛藻多糖提取量。

多糖提取量(mg/g)=M1×V1/M2

(1)

式(1)中，M1：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品溶液的含量(mg/mL)；M2：取樣量(g)；V1：樣品定容體積(mL)。

1.3.4 紅毛藻多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

以料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為考察因素，以紅毛藻多糖提取量為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1)考察料液比對(duì)紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取1.0 g紅毛藻粉末12份，每個(gè)條件平行3份，按照料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V)，分別依次加入 30、40、50、60 mL的蒸餾水，在80℃水浴條件下提取2.0 h，按照1.3.1方法每組平行測(cè)定3次。

2)考察提取時(shí)間對(duì)紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取 1.0 g紅毛藻粉末12份，每個(gè)條件平行3份，分別加入40 mL(料液比1∶40)蒸餾水，于80℃水浴條件下提取，再分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時(shí)停止提取，離心取上清液，按照1.3.1方法每組平行測(cè)定3次。

3)考察提取溫度對(duì)紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取 1.0 g 紅毛藻粉末12份，每個(gè)條件平行3份，分別加入 40 mL(料液比1∶40)蒸餾水，并分別于70、80、90、100℃下提取1.5 h，離心取上清液，按照1.3.1方法每組平行測(cè)定3次。

1.3.5 紅毛藻多糖提取工藝優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以紅毛藻多糖提取量為考察指標(biāo)，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比為因子進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.6 提取工藝驗(yàn)證

為驗(yàn)證建立的最佳提取工藝，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。稱取1.0 g紅毛藻3份，按照建立的最佳提取工藝進(jìn)行提取，并按照1.3.1方法平行測(cè)定3次。

1.3.7 紅毛藻多糖的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1)紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測(cè)定

分別用5支7 mL離心管移取0.04 mg/mL DPPH-乙醇溶液1.5 mL，再依次加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為2 mg/mL)，并用水補(bǔ)足至3.0 mL，靜置30 min后在517 nm處測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算紅毛藻多糖對(duì)DPPH自由基的清除率[4-5]。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

(2)

式(2)中，A0為未加紅毛藻多糖溶液DPPH溶液的吸光度；A1為加紅毛藻多糖溶液后DPPH溶液的吸光度；A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

2)紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測(cè)定

分別向5支離心管加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為5 mg/mL)，用蒸餾水補(bǔ)足至1.0 mL，然后每支離心管分別加入0.3 mL 6 mmol/L FeSO4、1.5 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻，最后加入30% H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，靜置10 min后在510 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算紅毛藻多糖對(duì)羥基自由基的清除率[6-7]。

清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

(3)

式(3)中，A0為未加紅毛藻多糖溶液時(shí)羥基溶液的吸光度；A1為加紅毛藻多糖溶液后羥基溶液的吸光度；A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

根據(jù)1.3.1方法得到回歸曲線方程，如圖1所示，Y=9.945 0X-0.010 1(Y為吸光值，X為葡萄糖濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

2.2 紅毛藻多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)紅毛藻多糖提取量的影響

在水浴溫度80℃、提取時(shí)間2.0 h的條件下，分別以料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V)提取紅毛藻多糖，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)料液比從1∶30到1∶50，紅毛藻多糖的提取量呈上升趨勢(shì)，以1∶30到1∶40上升的趨勢(shì)較大，之后上升趨勢(shì)較慢，基本上趨于平衡狀態(tài)。這主要是因?yàn)殡S著料液比的增加，溶解的多糖也增多，且在一定范圍內(nèi)增加提取液的體積可以增大溶劑與提取物的接觸面積，使水溶性的多糖能夠較多地溶出，于是產(chǎn)生了隨水量增加而多糖提取量升高的現(xiàn)象，但是當(dāng)料液比增加到可以溶解所有能被提取出的多糖時(shí)，繼續(xù)增加水量，所溶解的多糖也不會(huì)再增加，出現(xiàn)了繼續(xù)加水而多糖提取量趨于平穩(wěn)的現(xiàn)象?？紤]后續(xù)多糖提取液濃縮干燥等能耗因素，料液比以1∶40為最佳。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)紅毛藻多糖提取量的影響

在水浴溫度80℃、料液比1∶40的條件下，分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時(shí)停止提取紅毛藻多糖，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取量在0.5 h到1.5 h逐漸增加，但在1.5 h 到2.0 h過(guò)程中，多糖的提取量基本不增加。這可能是因?yàn)樵谔崛〕跗?，多糖能夠被不斷提取出?lái)，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取量逐漸升高而不再有明顯的變化，所以盡管時(shí)間延長(zhǎng)也無(wú)法再提高多糖提取量。同時(shí)，也有可能是加熱過(guò)久導(dǎo)致部分多糖降解被破壞，從而導(dǎo)致提取量稍微下降。因此，提取時(shí)間選擇1.5 h 為最佳。

2.2.3 提取溫度對(duì)紅毛藻多糖提取量的影響

在料液比1∶40、提取時(shí)間1.5 h的條件下，分別于70、80、90、100℃下提取紅毛藻多糖，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著提取溫度的升高， 多糖含量逐漸增大， 在90℃后多糖含量略微減少。這是因?yàn)槎嗵堑娜芙舛入S著溫度的升高而升高，使得在一定范圍內(nèi)多糖提取量隨溫度升高而升高，但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，由于多糖的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致其發(fā)生分解，且溫度過(guò)高會(huì)消耗能量，多糖提取量呈下降趨勢(shì)。考慮到經(jīng)濟(jì)成本和防止多糖在高溫下遭受破壞，提取溫度不宜過(guò)高，選擇最佳提取溫度為90℃。

2.3 紅毛藻多糖提取工藝優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以紅毛藻多糖提取量為考察指標(biāo)，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比為因子進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

由表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析可得，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)紅毛藻多糖的提取量影響較顯著，而料液比對(duì)紅毛藻多糖的提取量影響最小。通過(guò)優(yōu)化的最佳提取工藝為A3B3C2，即以料液比為1∶40、在90℃下提取2.0 h為最佳提取工藝。通過(guò)表3正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果進(jìn)一步表明，提取溫度與提取時(shí)間對(duì)紅毛藻多糖的提取量起主要作用。

2.4 提取工藝驗(yàn)證

從表4提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，3份樣品的紅毛藻多糖的平均提取量為77.57 mg/g，RSD為2.80%，表明所建立的紅毛藻多糖提取工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.5 紅毛藻多糖的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測(cè)定

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)可知隨著樣品濃度的增加，樣品的清除率也在不斷增加，說(shuō)明紅毛藻多糖清除DPPH自由基呈劑量依耐型關(guān)系。根據(jù)樣品的濃度與清除率曲線結(jié)果可得，紅毛藻多糖清除DPPH自由基的IC50值為0.36 mg/mL。

2.5.2 紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測(cè)定

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)可知紅毛藻多糖對(duì)羥基自由基的清除率隨著濃度的增加而提高，表明紅毛藻多糖濃度與羥基自由基的清除率呈正相關(guān)。根據(jù)樣品的濃度與清除率曲線結(jié)果可得紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。

3 討論

海藻多糖是藻類植物中重要的組成成分之一，約占干重的20%～70%，它是一類混合物，是海藻細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)所含的各種高分子碳水化合物的總稱[8]。研究表明，海藻多糖具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和降血糖等[9-13]，因而其有望被開(kāi)發(fā)成為保健品或者藥品，為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有益的參考[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化紅毛藻多糖的提取工藝，最后確定紅毛藻多糖最佳提取工藝為料液比1∶40、在溫度為90℃下提取2.0 h?？寡趸钚匝芯勘砻骷t毛藻多糖能有效清除DPPH自由基，其 IC50值為0.36 mg/mL；紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。本研究可為紅毛藻多糖的高值化開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為海藻多糖的應(yīng)用前景[15]提供了理論參考。