劉淑集，黃珊紅，陳曉婷，陳 貝，許 旻，蘇永昌，劉智禹*

[1.福建省水產(chǎn)研究所，國(guó)家海水魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門(mén))，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361013；2.廈門(mén)海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361100]

將魚(yú)經(jīng)過(guò)采肉、漂洗、精濾、脫水?dāng)嚢杓皟鼋Y(jié)加工得到魚(yú)糜[1]，再將魚(yú)糜經(jīng)過(guò)擂潰(斬拌)、成型、加熱和冷卻工序制成魚(yú)糜制品[2]。漂洗是魚(yú)糜加工過(guò)程中的關(guān)鍵工藝[3]，但魚(yú)糜在經(jīng)過(guò)漂洗的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生廢液，漂洗廢液直接排放會(huì)導(dǎo)致水質(zhì)受到嚴(yán)重污染。而且魚(yú)肉中30%～40%蛋白質(zhì)以不溶性的魚(yú)糜微粒和水溶性的形式存在于魚(yú)糜漂洗液中，隨著漂洗液的丟棄而流失，造成了蛋白質(zhì)的浪費(fèi)。經(jīng)研究表明，魚(yú)糜漂洗液回收蛋白質(zhì)中氨基酸種類(lèi)齊全，并且比例均衡，符合FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式，是理想的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[4]?；厥者@部分的魚(yú)糜漂洗液不僅能減少環(huán)境污染，降低廢水處理費(fèi)用，還能在很大程度上增加企業(yè)潛在的利潤(rùn)。因此，如何回收魚(yú)糜漂洗液中的水溶性蛋白質(zhì)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)?；厥蒸~(yú)糜漂洗液的方法主要有絮凝法[5]、超濾法、等電點(diǎn)沉淀法[6]和離子交換法[7]等。但這些方法各有利弊，無(wú)法同時(shí)滿足回收率、操作簡(jiǎn)便、成本低廉等要求。

三氯化鐵(FeCl3)是一種蛋白質(zhì)絮凝劑，可使蛋白質(zhì)聚沉而進(jìn)行回收。它易溶于水，具有絮凝速度快、安全無(wú)毒、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品、造紙、化工、煤礦、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中的廢水處理[8]。孫紅杰等[9]采用8 mg/mL的FeCl3絮凝地下水，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH>6時(shí)，主要絮凝機(jī)理是以氫氧化鐵[Fe(OH)3]的網(wǎng)捕卷掃為主；當(dāng)pH<4時(shí)，主要絮凝機(jī)理是Fe3+以壓縮雙電層為主。因此，本研究擬開(kāi)展FeCl3法回收魚(yú)糜漂洗液中蛋白質(zhì)工藝的研究與優(yōu)化，以期應(yīng)用于魚(yú)糜加工過(guò)程中漂洗液廢水的處理，回收蛋白質(zhì)，變廢為寶，提高魚(yú)糜加工的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

試驗(yàn)材料：河鲀，購(gòu)自福建省鲀之鮮水產(chǎn)有限公司。魚(yú)糜漂洗液：將河鲀魚(yú)肉進(jìn)行斬拌2 min；水的溫度保持在10℃，水和魚(yú)糜的比例為7∶1，配好水和魚(yú)糜的比例后開(kāi)始進(jìn)行漂洗，分3次漂洗，一次3 min；漂洗后靜置3 min以上，倒出漂洗液，儲(chǔ)存。

試驗(yàn)試劑：三氯化鐵(FeCl3)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Pierce BCA Protein Assay Kit BCA蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司。

試驗(yàn)儀器：pH計(jì)、斬拌機(jī)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫振蕩器、M200PRO酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

工藝流程：在10 mL魚(yú)糜漂洗液中加入一定量的FeCl3溶液，調(diào)節(jié)一定的pH，放置在一定溫度的水浴鍋保溫一定時(shí)間，4 000 r/min離心10 min。取上清液25 μL和BCA試劑200 μL混合于酶標(biāo)板上，放置在37℃恒溫振蕩器震蕩30 min。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.1 單因素試驗(yàn)法

以蛋白質(zhì)回收率(Rate of protein recovery，RPR)為指標(biāo)，在固定其他影響因素保持不變的狀態(tài)下，分別考察1% FeCl3溶液添加量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL)、pH(3、5、7、9、11)、回收溫度(25、45、55、65、75℃)、回收時(shí)間(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h)對(duì)蛋白質(zhì)回收效果的影響，每個(gè)水平試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定

蛋白質(zhì)回收率=[1-(絮凝后上清液中蛋白質(zhì)含量/魚(yú)糜漂洗液原液中蛋白質(zhì)含量)]×100%

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化FeCl3法回收蛋白質(zhì)的工藝條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理[10]，選取pH(X1)、回收溫度(Temperature，T)(X2)與1% FeCl3溶液添加量(Addition of 1% FeCl3solution，AFS)(X3)3個(gè)因素作為自變量，以蛋白質(zhì)回收率(Y)作為響應(yīng)值，在pH(3、5、7)、回收溫度時(shí)間(60、65、70℃)和1% FeCl3溶液用量(1.0、1.5、2.0 mL)3因素3水平上對(duì)FeCl3法回收蛋白質(zhì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果與分析

2.1 各單因素對(duì)FeCl3法回收蛋白質(zhì)的影響

2.1.1 FeCl3溶液添加量對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響

FeCl3溶液添加量對(duì)回收魚(yú)糜漂洗液中的蛋白質(zhì)有明顯的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。在pH 7、回收溫度55℃和回收時(shí)間3 h的條件下，隨著FeCl3溶液添加量的增加，蛋白質(zhì)回收率隨之快速增加，這是由于Fe(OH)3的吸附作用引起的。所以，當(dāng)漂洗液中蛋白質(zhì)濃度較高時(shí)，需要的FeCl3濃度相對(duì)較高，說(shuō)明FeCl3的用量和漂洗液蛋白質(zhì)的濃度存在一定的正相關(guān)關(guān)系[11]。當(dāng)1% FeCl3溶液添加量超過(guò)1.5 mL時(shí)，蛋白質(zhì)回收率增加的趨勢(shì)變慢，因此，選擇FeCl3溶液的添加量為1.5 mL，此時(shí)蛋白質(zhì)回收率為75.33%。

2.1.2 pH對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響

pH對(duì)魚(yú)糜漂洗液中蛋白質(zhì)回收效果的影響如圖2所示。在回收溫度55℃、回收時(shí)間3 h和1% FeCl3溶液添加量為1.5 mL的條件下，隨著pH的增加，漂洗液中蛋白質(zhì)的回收率越來(lái)越高，當(dāng)pH為5時(shí)，回收率最高，為58.29%。之后隨著pH的升高，蛋白質(zhì)的回收率逐漸下降。在弱酸性范圍內(nèi)，隨著pH的升高，水解作用增強(qiáng)。當(dāng)pH達(dá)到5～6時(shí)，F(xiàn)e3+轉(zhuǎn)化為Fe(OH)3膠體，該膠體具有較強(qiáng)的吸附架橋和吸附電中和功能，使蛋白質(zhì)能夠得到最大程度的凝聚。但繼續(xù)增大pH，絮凝作用減弱，導(dǎo)致蛋白質(zhì)回收率下降[12]。因此，選擇pH 5作為后續(xù)優(yōu)化的條件。

2.1.3 回收溫度對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響

回收溫度對(duì)FeCl3法回收魚(yú)糜漂洗液中的蛋白質(zhì)有明顯的影響，結(jié)果如圖3所示，在pH 7、回收時(shí)間3 h和1% FeCl3溶液添加量為1.5%的條件下，隨著回收溫度的升高，蛋白質(zhì)回收率逐漸增高。當(dāng)溫度達(dá)65℃時(shí)，蛋白質(zhì)的回收率最高，為88.39%。當(dāng)繼續(xù)提高溫度，蛋白質(zhì)回收率反而下降，這可能是因?yàn)楦邷厥沟鞍踪|(zhì)失去活性，造成蛋白質(zhì)脫附，導(dǎo)致回收率下降[13-14]。因此，回收溫度選擇65℃為宜。

2.1.4 回收時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響

在pH 7、回收溫度55℃和1% FeCl3溶液添加量為1.5 mL的條件下，回收時(shí)間對(duì)FeCl3回收魚(yú)糜漂洗液中的蛋白質(zhì)的影響較小，結(jié)果如圖4所示。Fe3+在很短的時(shí)間內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化為Fe(OH)3膠體?；厥? h時(shí)蛋白質(zhì)的回收率達(dá)60.22%，4 h 時(shí)回收率增加到61.99%，增加緩慢，此后繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，蛋白質(zhì)回收率幾乎呈穩(wěn)定狀態(tài)。所以選取的回收時(shí)間為4 h。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)各單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行組間的顯著性分析[15]發(fā)現(xiàn)，pH、回收溫度、1%FeCl3溶液添加量和回收時(shí)間4個(gè)因素在設(shè)定的水平之間的限制差異P值分別0、0、0、0.452，其中回收時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)回收率沒(méi)有顯著影響，所以選擇pH(pH/X1)、回收溫度(T/X2)和1%FeCl3溶液添加量(AFS/X3)為自變量，以蛋白質(zhì)回收率(RPR/Y)為因變量，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，進(jìn)行3因素3水平的魚(yú)糜漂洗液回收工藝優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

從表1的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以看出在不同pH、回收溫度和1%FeCl3溶液添加量的影響下，蛋白質(zhì)回收率各不相同。1%FeCl3溶液添加量在1.5～2.0 mL、回收溫度在60～65℃、pH在5～7時(shí)，蛋白質(zhì)回收率達(dá)到最高值。

根據(jù)Box Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組試驗(yàn)，得到二次多項(xiàng)式擬合方程為：

Y=93.21+9.40X1+1.37X2-3.39X3+1.62X1X2+5.51X1X3-0.33X2X3-8.71X12-12.39X22-10.64X32。

根據(jù)二次模型的方差分析結(jié)果(表2)，Y方程回歸模型的P值為0.035 2(<0.05)，說(shuō)明模型達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)P值為0.055 4，失擬不顯著，說(shuō)明方程擬合良好，回歸方程式具有可靠性。

表2 蛋白質(zhì)回收率二次回歸方程方差分析結(jié)果

續(xù)表2

由表1和表2可以看出，各響應(yīng)因素影響程度：X1>X3>X2，即回收時(shí)pH對(duì)蛋白質(zhì)的回收率影響最大。

3個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)回收率影響交互作用的響應(yīng)面結(jié)果如圖5所示。隨著pH、溫度和1%FeCl3溶液添加量的增加，蛋白質(zhì)的回收率先升高后下降，3個(gè)因素的兩兩交互曲面整體呈現(xiàn)凸起，為倒“U”形，等高線呈橢圓形，說(shuō)明3個(gè)因素兩兩間存在一定的交互作用。

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，以蛋白回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定回收魚(yú)糜漂洗液的最優(yōu)工藝為溫度65.44℃、pH 5.94、1% FeCl3溶液添加量1.37 mL，此時(shí)蛋白回收率達(dá)到最大值，為(96.47±0.953)%。為操作便利，將此條件調(diào)整為溫度65℃、pH 6、1% FeCl3添加量1.4 mL，并進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算蛋白質(zhì)的回收率為95.14%，與模型預(yù)測(cè)值沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得出的試驗(yàn)結(jié)果是在pH為5～6、溫度為55～65℃、1%FeCl3溶液添加量為1.5～2.0 mL時(shí)，蛋白質(zhì)回收率較高，達(dá)88.49%。通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化，得到試驗(yàn)結(jié)果為10 mL魚(yú)糜漂洗液在溫度65℃、pH 6、1% FeCl3溶液添加量為1.4 mL時(shí)，蛋白回收率達(dá)到95.14%。獲得的FeCl3法回收魚(yú)糜漂洗液中的蛋白質(zhì)優(yōu)化工藝，可進(jìn)行放大并被應(yīng)用于魚(yú)糜生產(chǎn)企業(yè)；回收的蛋白質(zhì)可作為蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑添加在魚(yú)粉、飼料中，有助于企業(yè)充分利用魚(yú)糜漂洗液的蛋白質(zhì)，提高魚(yú)糜加工的附加值，減少排放漂洗液帶來(lái)的環(huán)境污染，降低污水處理成本，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。