王鵬程，李 翔，趙天宇，戰(zhàn)春君,2,3，白仲虎,2,3，楊艷坤,2,3*

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

嗜甲醇巴斯德畢赤酵母通過甲醇利用途徑（Methanol utilization pathway，MUTpathway）代謝甲醇[1]。因其具有高效且嚴(yán)格調(diào)控的醇氧化酶1啟動(dòng)子（PAOX1）、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、高密度發(fā)酵、蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)等優(yōu)良特性，現(xiàn)已成為使用最廣泛外源蛋白表達(dá)宿主之一[2]。其表達(dá)系統(tǒng)基于甲醇代謝通路，但涉及大量轉(zhuǎn)錄和信號(hào)因子，且具體分子機(jī)理尚不清楚[3]。為尋找甲醇代謝潛在信號(hào)因子，分析K.phaffii以甲醇為碳源及甘油為碳源轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[4]，發(fā)現(xiàn)被甘油抑制而被甲醇顯著誘導(dǎo)的基因PAS_chr1-4_0516，通過蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與釀 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae）SUT2同源。而S.cerevisiae中SUT2為SUT1（Sterol up take 1，固醇攝取基因1）同源基因，可在厭氧條件下協(xié)同SUT1參與調(diào)控固醇攝取[5-7]，故畢赤酵母中響應(yīng)甲醇誘導(dǎo)的SUT2基因同樣可能為固醇代謝潛在基因。

畢赤酵母細(xì)胞中麥角固醇是最主要固醇成分[8]，也是過氧化物酶體膜重要組成[9]。過氧化物酶體是甲醇代謝主要細(xì)胞器[10-11]。因此，推測(cè)響應(yīng)甲醇誘導(dǎo)的SUT2通過調(diào)控麥角固醇代謝，影響過氧化物酶體膜形成以及過氧化物酶體增生，進(jìn)而參與甲醇代謝。

甲醇代謝時(shí)，過氧化物酶體量動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)通過細(xì)胞器生物發(fā)生與自噬之間的平衡實(shí)現(xiàn)[11]。過氧化物酶體自噬時(shí)，自噬相關(guān)蛋白ATG26通過GRAM結(jié)構(gòu)域（靶向過氧化物酶體自噬特異性膜突起）和PH結(jié)構(gòu)域（具有脂質(zhì)結(jié)合活性）與ATG30（Autopha?gy-related gene 30，自噬相關(guān)基因30）、ATG8（Au?tophagy-related gene 8，自噬相關(guān)基因8）、ATG11（Autophagy-related gene 11，自噬相關(guān)基因11）等蛋白協(xié)同作用，參與過氧化物酶體自噬，控制過氧化物酶體體積及總量[12]。此外，ATG26蛋白也具有甾醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可將麥角固醇轉(zhuǎn)化為甾醇葡萄糖苷[13]。結(jié)合SUT2潛在功能，本文深入研究SUT2與ATG26對(duì)麥角固醇作用及參與甲醇代謝機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菌株和質(zhì)粒如表1所示。文中所需引物均由蘇州金唯智公司合成；吡啶、氫氧化鉀購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，正己烷購自上海麥克林生化科技有限公司，N，O-雙（三甲基硅基）三氟代乙酰胺購自北京索萊寶科技有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2020購自日本島津公司；CO2培養(yǎng)箱3111購自賽默飛；其他材料、設(shè)備參照文獻(xiàn)[14]。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 sgRNA-ATG26敲除質(zhì)粒

輸入ATG26基因序列至在線網(wǎng)站（http://chop?chop.cbu.uib.no/），選擇菌種Pichia pastoris，獲得推薦的sgRNA序列；開展脫靶效應(yīng)分析，選擇特異性、評(píng)分較高且GC含量合適的sgRNA序列[15]。并根據(jù)sgRNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)sg-F/R，詳細(xì)序列如表2所示。將上下游引物通過寡鏈退火形成重組片段，采用Golden Gate assembly方法將其和BsaⅠ線性化的sgRNA-Cas9質(zhì)粒組裝并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)，對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒并測(cè)序后獲得陽性克?。ù薈RISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）。

1.2.2 pGAP-ATG26過表達(dá)質(zhì)粒

利用表2所示引物對(duì)ATG26-F/R，以GS115野生型基因組為模板作PCR，得到ATG26基因片段。將pGAPZB質(zhì)粒利用KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切得到載體片段。對(duì)片段和載體采用Gibson assembly，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)，對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒，利用引物對(duì)26-YZ-F/R作PCR并測(cè)序后獲得陽性克隆。

1.3 畢赤酵母感受態(tài)制作和轉(zhuǎn)化

畢赤酵母感受態(tài)制作和轉(zhuǎn)化（電擊法）參考Invitrogen官方手冊(cè)。

表2 研究所用引物Table 2 Primers in thisstudy

1.4 敲除菌株篩選及質(zhì)粒丟失

將電轉(zhuǎn)后酵母感受態(tài)涂布于博來霉素平板上，30℃培養(yǎng)3~5 d至形成單菌落，挑取轉(zhuǎn)化子于博來霉素YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，提取酵母基因組DNA。利用表2所示引物對(duì)sg-YZ-F/R擴(kuò)增目的片段并提交蘇州金唯智公司測(cè)序驗(yàn)證。

將陽性轉(zhuǎn)化子接種至無抗性MM培養(yǎng)基，用以丟失sgRNA質(zhì)粒。30℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h后于無抗性平板中劃線分離，30℃培養(yǎng)3~5 d后，挑取單菌落至博來霉素YPD培養(yǎng)基和無抗性YPD培養(yǎng)基。30℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h后，在無抗性YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而抗性YPD培養(yǎng)基中無法生長(zhǎng)的克隆，即為質(zhì)粒丟失成功克隆，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 主要培養(yǎng)基及菌株培養(yǎng)條件

1.5.1 主要培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物、2%Peptone、2%葡萄糖。

MM培養(yǎng)基：1.34%YNB、0.5%生物素、1%甲醇。

MG培養(yǎng)基：1.34%YNB、0.5%生物素、0.5%甘油。

酵母培養(yǎng)時(shí)，若需添加抗生素，博來霉素和氨芐青霉素終濃度均為100μg·mL-1。

1.5.2 菌株培養(yǎng)條件

將各菌株以1%接種量接種至5 mL YPD培養(yǎng)基，30℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)，過夜活化。以O(shè)D600=0.5初始量分別轉(zhuǎn)接至50 mL MM（1%甲醇）、MG（0.5%甘油）培養(yǎng)基，并用PBS清洗菌體2次。30℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)36 h時(shí)取樣并補(bǔ)加1%甲醇，培養(yǎng)60 h時(shí)再次取樣。

1.6 畢赤酵母胞內(nèi)麥角固醇含量檢測(cè)

取2 mL新鮮菌液，于5 000 r·min-1離心5 min收集菌體。收集細(xì)胞用500μL 20%氫氧化鉀溶液（含50%乙醇）重懸，于沸水中煮沸10 min裂解細(xì)胞，室溫冷卻后加入500μL正己烷，渦旋震蕩萃取5 min后靜置分層，吸取上層正己烷相至新離心管；下層水相中加入250μL正己烷，重復(fù)萃取靜置分層后再次吸取上層正己烷相與第一次萃取液合并。將離心管置于80℃金屬浴揮發(fā)正己烷，揮發(fā)干凈后加入50μL吡啶和100μL N，O-雙（三甲基硅基）三氟代乙酰胺，80℃反應(yīng)30 min后樣品制備完成[16]。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定樣品[17]。所用色譜儀為島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMSQP2020，色譜柱為DB-5MS（Agilent，30 m×0.25 mm×0.25μm），F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度300℃，載氣氦氣流速為1.2 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度300℃，分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL，分流比30∶1；柱箱程序升溫起始溫度80℃，然后以20℃·min-1速度升溫至280℃，保持15 min后以20℃·min-1速度升溫至300℃，保持5 min；質(zhì)譜掃描范圍為40~450 m·z-1。

1.7 畢赤酵母AOX1酶活性檢測(cè)

畢赤酵母AOX1酶活性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 p GAP-ATG26過表達(dá)菌株構(gòu)建

將目的基因PCR產(chǎn)物與雙酶切后pGAPZB載體作Gibson assembly并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)。涂布于博來霉素平板，挑取陽性轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確后抽提質(zhì)粒并單酶切線性化、電轉(zhuǎn)至GS115野生型菌株，博來霉素平板篩選。挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取基因組并PCR測(cè)序驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。理論長(zhǎng)度為812 bp，圖中所示樣品11~13均符合。

圖1 ATG26過表達(dá)菌株P(guān)CR驗(yàn)證Fig.1 Confirmation of ATG26 overexpression strainsby PCR

2.2 敲除菌株篩選

將構(gòu)建成功sgRNA-ATG26敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至GS115野生型菌株中，于博來霉素抗性平板中篩選陽性克隆，提取基因組DNA并PCR測(cè)序。比對(duì)結(jié)果如圖2所示，相比于野生型菌株，敲除菌株將95 bp處堿基A成功敲除。

圖2 敲除菌株序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence alignment of mutant strains and wild typestrains

2.3 SUT2高低表達(dá)對(duì)胞內(nèi)麥角固醇及AOX1酶活性的影響

按照1.5中培養(yǎng)及取樣方法分別檢測(cè)野生型、SUT2敲除和過表達(dá)菌株在常氧及低氧條件下胞內(nèi)麥角固醇含量及AOX1酶活性。其中，常氧下檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。甲醇培養(yǎng)基中，相比于野生型菌株（WT），過表達(dá)SUT2提高約21%胞內(nèi)麥角固醇含量，而敲除SUT2降低約10%~15%胞內(nèi)麥角固醇含量（見圖3a）。因所用培養(yǎng)基為不含麥角固醇基本培養(yǎng)基，且胞外上清中均檢測(cè)不出麥角固醇（數(shù)據(jù)未顯示），故3株菌均無法從胞外攝取麥角固醇，也未分泌麥角固醇至胞外。因此本研究推測(cè)SUT2可能通過促進(jìn)麥角固醇合成正向調(diào)節(jié)胞內(nèi)麥角固醇含量。而甘油培養(yǎng)基中各菌株胞內(nèi)麥角固醇含量無明顯變化（見圖3b），說明SUT2對(duì)麥角固醇合成的影響僅在甲醇誘導(dǎo)條件下存在，與SUT2在甲醇培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達(dá)現(xiàn)象一致。

通過檢測(cè)AOX1酶活性發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，SUT2過表達(dá)菌株（SUT2-OE）的AOX1酶活性提高約27%（見圖3c），說明過表達(dá)SUT2對(duì)AOX1具有一定程度促進(jìn)作用。因?yàn)?，相比于甘油培養(yǎng)基，甲醇培養(yǎng)基中畢赤酵母過氧化物酶體顯著增生[18]，而麥角固醇是過氧化物酶體膜重要組成[9]，所以甲醇培養(yǎng)基中過氧化物酶體與麥角固醇含量呈正相關(guān)；過氧化物酶體又是甲醇代謝主要細(xì)胞器[10-11]。結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)SUT2通過促進(jìn)胞內(nèi)麥角固醇合成并形成過氧化物酶體膜，促進(jìn)過氧化物酶體增生，參與甲醇代謝并促進(jìn)AOX1表達(dá)。

此外，SUT2敲除菌株（SUT2-KO）AOX1酶活性與野生型相近，但同樣有所提高（見圖3c）?？赡芤騍UT2敲除后激活其他代謝通路導(dǎo)致。

圖3 常氧條件下SUT2敲除、過表達(dá)及野生型菌株胞內(nèi)麥角固醇含量及AOX1酶活性Fig.3 Intracellular ergosterol content and AOX1 enzymeactivity of SUT2 knockout,overexpression and wild typestrainsunder normoxia

因S.cerevisiae中SUT2為厭氧條件下與SUT1協(xié)同發(fā)揮作用基因[5-7]，故本研究給予近似培養(yǎng)條件進(jìn)一步研究，在1.5培養(yǎng)方法上作調(diào)整，實(shí)現(xiàn)低氧條件：靜置于低氧培養(yǎng)箱（CO2∶空氣=1∶4）中培養(yǎng)，同時(shí)將三角瓶瓶口用封口膜多次纏繞封閉。

低氧條件下檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。相比于野生型，SUT2過表達(dá)對(duì)胞內(nèi)麥角固醇含量無明顯影響，敲除SUT2降低約9%~13%胞內(nèi)麥角固醇含量（見圖4a）。同時(shí)，SUT2過表達(dá)菌株AOX1酶活性具有一定程度提高，SUT2敲除菌株AOX1酶活性與野生型相似（見圖4b）。因?yàn)榧状即x為耗氧過程，低氧條件下甲醇代謝減弱[19]，AOX1和SUT2蛋白活性減弱，導(dǎo)致對(duì)胞內(nèi)麥角固醇合成以及AOX1酶活性促進(jìn)作用均不明顯；若達(dá)到完全厭氧條件，改變SUT2表達(dá)量可能對(duì)胞內(nèi)麥角固醇含量及AOX1酶活性均無明顯作用。

通過在不同氧含量、碳源條件下對(duì)畢赤酵母SUT2基因敲除、過表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)相比于S.cerevisiae，畢赤酵母SUT2基因具有不同功能：常氧條件下，甲醇培養(yǎng)基中畢赤酵母SUT2通過促進(jìn)胞內(nèi)麥角固醇合成，形成過氧化物酶體膜，促進(jìn)過氧化物酶體增生，從而參與甲醇代謝。

2.4 ATG26高低表達(dá)對(duì)胞內(nèi)麥角固醇及AOX1酶活性的影響

將構(gòu)建成功的ATG26敲除、過表達(dá)菌株同樣按照1.5方法培養(yǎng)及取樣，結(jié)果如圖5所示。甘油培養(yǎng)基中各菌株胞內(nèi)麥角固醇含量無明顯變化（見圖5b）。而甲醇培養(yǎng)基中，相比于野生型菌株（WT），ATG26過表達(dá)菌株（ATG26-OE）胞內(nèi)麥角固醇含量下降約18%，AOX1酶活性下降約14%~20%；而ATG26敲除菌株（ATG26-KO）胞內(nèi)麥角固醇含量提高約9%，AOX1酶活性提高約8%（見圖5a、c）。即ATG26對(duì)胞內(nèi)麥角固醇含量以及AOX1酶活性均具有反向調(diào)控作用。又因甲醇培養(yǎng)基中過氧化物酶體與麥角固醇含量呈正相關(guān)，故ATG26通過改變胞內(nèi)麥角固醇含量影響過氧化物酶體含量實(shí)現(xiàn)對(duì)AOX1酶活性反向調(diào)控作用。該調(diào)控作用源自ATG26具有的甾醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可促進(jìn)麥角固醇轉(zhuǎn)化為甾醇葡萄糖苷[11]，減少過氧化物酶體膜形成，進(jìn)而減少過氧化物酶體增生以及AOX1酶活性。此外，ATG26還可與ATG30、ATG8、ATG11等蛋白協(xié)同作用，參與過氧化物酶體自噬，調(diào)控過氧化物酶體總量及體積[10]。

2.5 巴斯德畢赤酵母SUT2與ATG26調(diào)節(jié)過氧化物酶體含量初步模型

基于上述試驗(yàn)結(jié)果和已知調(diào)控通路，總結(jié)得到巴斯德畢赤酵母SUT2與ATG26調(diào)節(jié)過氧化物酶體含量初步模型，如圖6所示。

圖4 低氧條件下胞內(nèi)麥角固醇含量及AOX1酶活性Fig.4 Intracellular ergosterol content and AOX1 enzymeactivity under hypoxia conditions

圖5 常氧條件下ATG26敲除、過表達(dá)及野生型菌株胞內(nèi)麥角固醇含量及AOX1酶活性Fig.5 Intracellular ergosterol content and AOX1 enzymeactivity of ATG26 knockout,overexpression and wild type strains under normoxia

與釀酒酵母SUT2參與厭氧條件下胞外麥角固醇攝取不同，畢赤酵母SUT2受甲醇顯著誘導(dǎo)，雖然其具體誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚[4]，但誘導(dǎo)表達(dá)的SUT2蛋白可能通過促進(jìn)胞內(nèi)麥角固醇合成并形成過氧化物酶體膜，進(jìn)而促進(jìn)過氧化物酶體增生并提高AOX1酶活，以此參與甲醇代謝。而同時(shí)存在ATG26蛋白一方面發(fā)揮甾醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性促進(jìn)麥角固醇轉(zhuǎn)化為甾醇葡萄糖苷，減少胞內(nèi)麥角固醇含量，進(jìn)而減少過氧化物酶體形成；另一方面作為自噬相關(guān)蛋白，與ATG30、ATG8、ATG11等協(xié)同作用，參與過氧化物酶體自噬。

因此，SUT2促進(jìn)麥角固醇合成，ATG26將麥角固醇轉(zhuǎn)化為甾醇葡萄糖苷，兩者動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)胞內(nèi)麥角固醇含量及過氧化物酶體含量，進(jìn)而調(diào)控甲醇代謝。

圖6 巴斯德畢赤酵母SUT2與ATG26調(diào)節(jié)過氧化物酶體含量模型Fig.6 Model of K.phaffii SUT2 and ATG26 regulating peroxisomecontent

3 討論與結(jié)論

受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)的畢赤酵母PAOX1表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛表達(dá)系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)基于甲醇利用途徑，涉及較多潛在信號(hào)因子。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，此前在K.phaffii中未被表征和深入研究的甲醇相關(guān)潛在因子SUT2，其具體功能機(jī)制尚不清楚。在S.cerevisiae中，SUT2響應(yīng)于厭氧條件，協(xié)同SUT1參與固醇攝取[5-7]；在植物細(xì)胞中，SUT2為糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與蔗糖代謝[20]。本研究結(jié)合釀酒酵母SUT2功能，合理推斷畢赤酵母SUT2功能并驗(yàn)證。最終發(fā)現(xiàn)畢赤酵母SUT2具有不同于釀酒酵母和植物細(xì)胞SUT2的全新功能，畢赤酵母SUT2響應(yīng)于有氧條件下甲醇代謝，促進(jìn)麥角固醇合成并形成過氧化物酶體膜，促進(jìn)過氧化物酶體增生，參與甲醇代謝。

畢赤酵母胞內(nèi)過氧化物酶體含量動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)通過生物發(fā)生和自噬降解之間平衡實(shí)現(xiàn)[11]，生物發(fā)生時(shí)PEX11（Peroxisomal protein 11，過氧化物酶體膜蛋白11）等蛋白從頭合成過氧化物酶體，胞內(nèi)麥角固醇含量對(duì)過氧化物酶體增生具有重要作用。此前研究報(bào)道中，一般通過改變PEX11等過氧化物酶體膜蛋白表達(dá)量調(diào)節(jié)過氧化物酶體含量[21]，尚未見利用胞內(nèi)麥角固醇含量調(diào)節(jié)過氧化物酶體含量方法。本研究結(jié)合ATG26和SUT2全新功能，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)麥角固醇含量，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過氧化物酶體含量，調(diào)控甲醇代謝全新模型。該模型中，SUT2促進(jìn)麥角固醇合成，進(jìn)而促進(jìn)過氧化物酶體增生和甲醇代謝；而ATG26將麥角固醇轉(zhuǎn)化為甾醇葡萄糖苷，減少胞內(nèi)麥角固醇含量和過氧化物酶體增生，減弱甲醇代謝。該模型建立豐富K.phaffii甲醇代謝機(jī)理研究，有助于進(jìn)一步完善畢赤酵母甲醇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，過表達(dá)SUT2和敲除ATG26均有利于提高AOX1酶活；即通過改造該模型，有利于增強(qiáng)基于甲醇利用途徑的PAOX1表達(dá)系統(tǒng)，為工業(yè)上應(yīng)用PAOX1表達(dá)系統(tǒng)提供一種新思路。

本研究SUT2受甲醇誘導(dǎo)具體機(jī)制尚不清楚，仍需后續(xù)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)新信號(hào)因子，進(jìn)一步闡明K.phaffii甲醇代謝調(diào)控機(jī)理。