張怡評(píng) ，楊婷 ，洪專 ，盧紹基*，鄧明

1.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心（廈門 361005）；2.廈門塔斯曼生物工程有限公司（廈門 361021）

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal）Iljinskaja.）又名搖錢樹，系胡桃科青錢柳屬植物，多分布于熱帶和亞熱帶的山區(qū)，是中國(guó)特有的單種屬植物及國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一，主產(chǎn)于江西、湖南、貴州、廣西、湖北等地[1]。青錢柳的樹葉、樹皮、樹根都可以入藥，也可作為普通的食品原料，具有清熱解毒、生津止渴、止痛等功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉含有多糖類、黃酮類、三萜及有機(jī)酸類化合物及一些無機(jī)元素等[3-7]，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種生物活性[4-5,8-11]。關(guān)于青錢柳抗氧化活性研究主要集中在青錢柳多糖及黃酮類化合物上，體外抗氧化活性研究表明，青錢柳多糖及總黃酮能夠清除DPPH自由基、ABTS自由基及羥基自由基活性；大鼠體內(nèi)抗氧化活性研究表明，青錢柳多糖能夠使高血脂大鼠肝臟的總超氧化物歧化酶的活性、谷胱甘肽過氧化物酶的活性、過氧化氫酶的活性及總抗氧化（T-AOC）顯著提高[12-15]。近年來，青錢柳葉作為食品、保健品的研究開發(fā)是其研究的重點(diǎn)，已有青錢柳保健茶等功能性食品上市[16]，然而，尚未見青錢柳多酚的提取及抗氧化活性的研究報(bào)道，試驗(yàn)采用乙醇提取法提取青錢柳多酚化合物，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為青錢柳功能性食品的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

青錢柳（采自貴州省雷山縣，樣品留存廈門塔斯曼生物工程有限公司）；沒食子酸（純度98%，批號(hào)110831-201906，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；福林酚試劑、碳酸鈉、無水乙醇、鄰苯三酚、Tris-HCl試劑、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等（均為分析純，購自汕頭西隴化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200E超生波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；UH5300紫外可見分光光度計(jì)（日立株式會(huì)社制作所）；DFT-200A萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；HH-ZK2水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；NT-901渦旋振蕩器（海門市其林貝儀器制造有限公司）；H1650-W離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青錢柳多酚提取單因素試驗(yàn)

取青錢柳葉，粉碎，過0.180 mm粒徑篩，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%和80%）、超聲提取時(shí)間（10，20，30，40，50和60 min）、超聲提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、料液比（1∶5，1∶15，1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL）為單因素進(jìn)行考察，篩選正交試驗(yàn)因素及水平。

1.3.2 青錢柳多酚提取工藝優(yōu)化

在單因素基礎(chǔ)上采用四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。采用乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%，70%和80%）、超聲提取時(shí)間（10，20和30 min）、超聲提取溫度（40，50和60 ℃）、料液比（1∶25，1∶35和1∶45 g/mL）為單因素，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.3 青錢柳多酚含量的測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)方法，采用福林酚測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定[17]。即以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配制成20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液。分別吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg/mL）置于10 mL離心管中，向試液中依次加入1.5 mL福林酚試劑和4 mL 8%碳酸鈉溶液，最后加水補(bǔ)齊到10 mL，渦旋混合后將離心管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，分別測(cè)定765 nm處溶液的吸光度。以沒食子酸濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=0.031x+0.043 3，R2=0.999，在4～20 μg/mL質(zhì)量濃度范圍有良好的線性關(guān)系。吸取1 mL樣品液自加入福林酚試劑起按照步驟進(jìn)行測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 青錢柳多酚體外抗氧化活性研究

試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[18]方法，對(duì)青錢柳多酚的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，主要包括超氧陰離子自由基清除率測(cè)定、鐵離子還原力測(cè)定和DPPH自由基清除率測(cè)定。

1.3.4.1 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)：取2 950 μL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl于石英比色皿中，加入50 μL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，迅速混合，測(cè)定在波長(zhǎng)325 nm的吸光度，每隔30 s測(cè)1次，300 s后停止，吸光度隨時(shí)間的變化即斜率為ΔA0。樣品溶液：取適量濃度的樣品XμL于石英比色皿中加入（2 950-X）μL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl，加入50 μL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，迅速混合，測(cè)定在波長(zhǎng)325 nm的吸光度，每隔30 s測(cè)1次，300 s后停止，吸光度隨時(shí)間的變化即斜率為ΔA樣，計(jì)算對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響。

1.3.4.2 鐵離子還原力測(cè)定

吸取1 mL一定濃度的多酚提取液于具塞試管中，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸緩沖鹽和1 mL 1%的鐵氰化鉀，混勻，50 ℃恒溫水浴20 min后，取出急速冷卻（冰欲），加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混合后以3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL雙蒸水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻靜置10 min，在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.4.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

取適量DPPH，用乙醇配制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的溶液，避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?.5 mL DPPH溶液，加適量提取液用乙醇補(bǔ)足到3 mL，靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。將樣品配制成一定的濃度按照上述反應(yīng)后測(cè)定，計(jì)算出對(duì)DPPH自由基清除率的影響。

式中：A0為未加提取液時(shí)DPPH溶液的吸光度；A1為加提取液時(shí)DPPH溶液的吸光度；A2為提取液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取5份青錢柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL）、提取時(shí)間25 min，分別加入40%，50%，60%，70%和80%乙醇水溶液超聲提取，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算多酚提取率。

由圖2可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，青錢柳多酚的提取率先增加后下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)，多酚的提取率最高，達(dá)到1.76%，采用80%乙醇提取，多酚提取率下降明顯。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇60%，70%和80%這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

2.1.2 超聲提取時(shí)間對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取6份青錢柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL），分別加入70%乙醇超聲，提取10，20，30，40，50和60 min，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進(jìn)行測(cè)定。

由圖3可見，隨著超聲提取時(shí)間增加，多酚提取率逐漸升高，超聲提取時(shí)間從10 min到20 min提取率升高迅速，超聲提取20 min時(shí)的提取率為1.78%；超聲提取時(shí)間從20 min到50 min提取率升高趨勢(shì)趨于平緩，超聲提取時(shí)間50 min時(shí)，提取率為1.90%，延長(zhǎng)30 min，提取率僅提高0.12%。因此超聲提取時(shí)間選擇10，20和20 min這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

2.1.3 超聲提取溫度對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取5份青錢柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL），分別加入70%乙醇，于30，40，50，60和70 ℃超聲提取20 min，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進(jìn)行測(cè)定。

由圖4可見，隨著提取溫度增加，青錢柳多酚的提取率先增加后下降，提取溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，青錢柳多酚的提取率達(dá)到最高，為1.83%；提取溫度高于50℃時(shí)，多酚的提取率反而下降，可能是由于溫度過高導(dǎo)致多酚被破壞。因此，超聲提取溫度選擇40，50和60 ℃這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 超聲提取溫度對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

2.1.4 料液比對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取6份青錢柳粉，各2.0 g，采用不同料液比（1∶5，1∶15，1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL），分別加入70%乙醇，于50 ℃超聲提取20 min，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進(jìn)行測(cè)定。

由圖5可見，多酚提取率隨著料液比增加而升高，料液比增加到1∶35（g/mL）后，多酚的提取率增加趨于緩慢，因此料液比選擇1∶25，1∶35和1∶45（g/mL）這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 料液比對(duì)青錢柳多酚提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在青錢柳多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以青錢柳多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲提取時(shí)間（B）、超聲提取溫度（C）和料液比（D）為4個(gè)提取因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，采用四因素三水平正交試驗(yàn)法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，按照1.3.3的方法進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2青錢柳多酚提取正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果可得，超聲提取時(shí)間對(duì)多酚提取率影響最顯著，料液比次之，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)青錢柳多酚的提取率的影響最小。由表3方差分析結(jié)果可得提取時(shí)間對(duì)多酚提取率具有顯著性影響，試驗(yàn)結(jié)果可得最佳提取工藝為A1B3C2D3，即以60%乙醇、料液比1∶45（g/mL），在50 ℃下超聲提取30 min為最佳提取工藝。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取3份青錢柳粉，各2 g，按照確定的最佳提取工藝進(jìn)行提取并測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 單位：%

在選取的最佳提取工藝條件下，青錢柳多酚的平均提取率為1.87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.12%，所建立的最佳提取工藝穩(wěn)定可行。

2.4 青錢柳多酚體外抗氧化活性試驗(yàn)

2.4.1 青錢柳多酚的提取

取100 g青錢柳，根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳提取工藝進(jìn)行提取多酚，過濾，濾液濃縮后冷凍干燥，開展體外抗氧化試驗(yàn)研究。

2.4.2 超氧陰離子清除率測(cè)定結(jié)果

人體內(nèi)存在一定數(shù)量的超氧陰離子，不發(fā)生化學(xué)變化對(duì)人體無害，但與羥基（OH-）結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損壞，破壞人類機(jī)體功能，因此，適當(dāng)攝入具有清除自由基活性的食物，對(duì)于保護(hù)人體機(jī)體功能具有重要意義[3,9]。由圖6可知，青錢柳多酚提取物對(duì)超氧陰離子的清除率呈劑量依賴性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.976，青錢柳多酚對(duì)超氧陰離子的IC50值為120.96 μg/mL。

圖6 青錢柳多酚對(duì)超氧陰離子的清除效果

2.4.3 鐵離子還原力測(cè)定結(jié)果

樣品的還原力與其抗氧化性具有明顯相關(guān)性，一般樣品的吸光度越大，樣品的還原力越強(qiáng)，其抗氧化活性越強(qiáng)[18]。測(cè)定青錢柳多酚對(duì)鐵離子還原力，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青錢柳多酚對(duì)鐵離子還原力隨著濃度增加而增強(qiáng)，青錢柳多酚對(duì)鐵離子還原力的IC50值為9.84 μg/mL，見圖7。

圖7 青錢柳多酚對(duì)鐵離子的還原力

2.4.4 DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果

DPPH是一種有機(jī)自由基，被廣泛應(yīng)用于定量檢測(cè)食品的抗氧化能力[18]。試驗(yàn)考察青錢柳多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著青錢柳多酚質(zhì)量濃度增加，其DPPH自由基清除能力增強(qiáng)，其質(zhì)量濃度與清除率相關(guān)性為0.995，青錢柳多酚對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為5.81 μg/mL，見圖8。

圖8 青錢柳多酚對(duì)DPPH自由基清除效果

3 結(jié)論

人體內(nèi)正常的生理代謝過程也會(huì)產(chǎn)生含氧自由基，很多疾病和組織損壞都和體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有聯(lián)系，如果自由基過量就會(huì)加快細(xì)胞衰老，引起疾病[9]。前期有藥理研究發(fā)現(xiàn)青錢柳提取物（多糖或黃酮類物質(zhì)）有清除自由基等抗氧化活性[9,13]，但尚未見青錢柳多酚提取的研究報(bào)道。采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)，建立青錢柳多酚的最佳提取工藝：以60%乙醇、料液比1∶45（g/mL），在50 ℃下超聲提取30 min，在此工藝下，青錢柳多酚的提取率可達(dá)1.96%。同時(shí)，對(duì)青錢柳多酚的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，青錢柳多酚對(duì)DPPH自由基的清除率及鐵離子還原力較強(qiáng)，而對(duì)超氧陰離子自由基的清除率較弱，試驗(yàn)結(jié)果可為青錢柳多酚在功能性食品等開發(fā)應(yīng)用上提供參考。