亓王盼，牟英玉，張濤，張繼友，毛勝勇*

（1.國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，江蘇南京210095；2.動(dòng)物科學(xué)類(lèi)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京210095）

亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）是由于反芻動(dòng)物長(zhǎng)期采食過(guò)量的易發(fā)酵碳水化合物，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）大量累積，使瘤胃p H值較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在5.2～5.8之間的一種營(yíng)養(yǎng)代謝疾病［1-2］。SARA嚴(yán)重影響奶牛瘤胃健康、泌乳性能及機(jī)體健康，其已成為危害現(xiàn)代奶牛健康生產(chǎn)的主要問(wèn)題之一［3］。反芻動(dòng)物患SARA后，瘤胃的消化代謝受到影響，尤其是VFA濃度及組成發(fā)生改變，由于VFA是反芻動(dòng)物能量物質(zhì)的主要來(lái)源，因此，VFA的組成及數(shù)量的變化可能影響到進(jìn)入機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量［4-5］，進(jìn)而影響到機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝。一些研究也發(fā)現(xiàn)，SARA可影響奶牛機(jī)體氨基酸和碳水化合物代謝［6-7］。然而，以往的這些研究主要集中在對(duì)某種或某類(lèi)代謝物的研究，很少有研究探討SARA對(duì)奶牛整體代謝的影響。

近年來(lái)，代謝組學(xué)的發(fā)展為研究機(jī)體代謝提供了新思路，代謝組學(xué)可以檢測(cè)出關(guān)鍵代謝通路上的多種代謝物，有助于加深對(duì)代謝紊亂背后機(jī)制的了解。代謝組學(xué)技術(shù)目前已用于監(jiān)測(cè)奶牛瘤胃代謝組的變化［8-10］。血液是機(jī)體重要的媒介體液，其中包含了很多由機(jī)體代謝產(chǎn)生并聯(lián)系不同器官組織的代謝產(chǎn)物［11］。Zhang等［12］通過(guò)對(duì)奶牛血液代謝組學(xué)的檢測(cè)來(lái)篩選與奶牛酮病有關(guān)的生物標(biāo)志物；最近，Sun等［13］通過(guò)對(duì)血液及其他體液的代謝組的共同檢測(cè)，篩選出與奶產(chǎn)量和奶品質(zhì)相關(guān)的代謝物并作為生物標(biāo)記物。迄今，關(guān)于SARA對(duì)奶牛血液代謝產(chǎn)物的影響的研究仍主要集中在對(duì)血液中葡萄糖、游離脂肪酸、β-羥丁酸、膽固醇等常規(guī)參數(shù)的測(cè)定［7，14］，而對(duì)其血液整體代謝產(chǎn)物的研究相對(duì)較少，因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)奶牛血漿生化指標(biāo)及血漿代謝組的測(cè)定，研究了SARA對(duì)奶牛血漿代謝產(chǎn)物的影響，擬為尋找與SARA相關(guān)的代謝標(biāo)記物以及為SARA的診斷和治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2019年2月在江蘇省泰州市姜堰牧場(chǎng)進(jìn)行。選取8頭裝有永久性瘤胃瘺管、健康和體況相似的2～3胎泌乳中期奶牛，隨機(jī)分為兩組，每組4頭奶牛。試驗(yàn)采用全混合日糧。一組飼喂精粗比為4∶6的對(duì)照組日糧（control group，CON），一組飼喂精粗比為6∶4的處理組日糧（subacute ruminal acidosis group，SARA），試驗(yàn)周期為21 d。全混合日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，每天8：00和19：00各飼喂1次。在試驗(yàn)期間采用單欄拴系飼養(yǎng)，剩余采食量控制在采食量的10%左右。奶牛自由采食與飲水。

表1 日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Ingredient and nutrient composition of diet

1.2 樣品采集

于試驗(yàn)期每周的最后2 d檢測(cè)采食量，于試驗(yàn)期每周最后1 d晨飼后0、2、4、6、8及12 h從瘤胃腹囊部采集瘤胃內(nèi)容物，將所取得的瘤胃內(nèi)容物經(jīng)4層紗布過(guò)濾。所得瘤胃液立即用便攜式p H計(jì)（HI 99161；HANNA Instruments，美國(guó)）測(cè)定其pH值。于試驗(yàn)期每周最后1 d晨飼后6 h，用肝素鈉真空采血管從頸靜脈采集10 mL血液，室溫下2500 r·min-1離心10 min分離出血漿，一部分存放于液氮中，用于后續(xù)代謝組學(xué)檢測(cè)，一部分存放于-20℃，用于后續(xù)生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 血漿生化指標(biāo)測(cè)定

使用β-羥丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHBA）、葡萄糖（glucose，Glu）、總膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）測(cè)定試劑盒（建成生物，南京）對(duì)試驗(yàn)期每周最后1 d采集的共24個(gè)血漿樣品中的β-羥丁酸、葡萄糖、膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定。具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 代謝組學(xué)分析

樣品預(yù)處理：將24個(gè)血漿樣本置于室溫解凍，用移液槍吸取100μL樣本于1.5 mL EP管中；加入300μL甲醇，并加入10μL內(nèi)標(biāo)（2.8 mg·mL-1，2-氯苯丙氨酸）；渦旋混勻30 s，-20℃靜置1 h；置于4℃離心機(jī)中，12000 r·min-1離心15 min；吸取200 μL上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中待檢測(cè)。采用LCMS（Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive）儀器分 析 平 臺(tái)，C18色譜柱［Hyper gold C18（100.0 mm×2.1 mm，1.9μm）］；色譜分離條件為柱溫40℃；流速0.3 mL·min-1；流動(dòng)相組成A：水+5%乙腈+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；進(jìn)樣量為10μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃；流動(dòng)相梯度洗脫程序參考表2；之后按照正模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 KV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，30%；負(fù)模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，60%的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

表2 流動(dòng)相洗脫程序Table 2 Mobile phase elution procedures

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0中的混合模型（mix model）對(duì)瘤胃p H進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中日糧和飼喂天數(shù)作為固定效應(yīng)因子，牛作為隨機(jī)效應(yīng)因子，每天的采樣時(shí)間點(diǎn)作為重復(fù)測(cè)量因子。采用SPSS 22.0中的一般線性模型（general linear model，GLM）對(duì)血漿生化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05表示差異顯著，0.05＜P＜0.1表示具有差異顯著的趨勢(shì)。使用Compound Discoverer軟件（Thermo公司）對(duì)LC/MS檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和預(yù)處理，并在Excel 2010中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化及后期編輯，最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包含保留時(shí)間（retention time；RT）、分子量（molecular weight，Comp MW）、觀察量（樣本名稱(chēng)）、可提取物質(zhì)個(gè)數(shù)（ID）和峰強(qiáng)度等信息。運(yùn)用SIMCA-P軟件（Version 13，Umetrics AB，Sweden）對(duì)最終得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)主成分分析（principal component analysis；PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis；PLS-DA）獲得實(shí)驗(yàn)參數(shù)和樣本信息之間的相互關(guān)系，同時(shí)獲得描述變量對(duì)模型的貢獻(xiàn)度的數(shù)值（variable importance in the projection，VIP）。用非參數(shù)檢驗(yàn)計(jì)算兩組P值，然后用′p.adjust′［R（v3.6.1）］對(duì)P值進(jìn)行false discovery rate（FDR）校正。以VIP＞1，F(xiàn)DR＜0.05為條件來(lái)篩選差異代謝物。通過(guò)MetaboAnalys（thttp：//www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行差異代謝物的通路分析，并計(jì)算兩組差異代謝物之間的倍數(shù)變化關(guān)系（fold change，F(xiàn)C）。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃pH變化

與CON組相比，SARA組的pH顯著降低（6.13 vs 5.65，P=0.002），在1 d內(nèi)小于5.8的時(shí)間大于3 h，因此本試驗(yàn)成功誘導(dǎo)SARA模型。兩組之間的干物質(zhì)采食量沒(méi)有顯著差異（23.79 vs 22.40，P=0.524）（圖1）。

圖1 晨飼后12 h內(nèi)瘤胃p H隨時(shí)間的變化Fig.1 Changes in the ruminal p H within 12 h after morning feeding（means±SEM，n=4）

2.2 血漿生化指標(biāo)

與CON組相比，SARA組的β-羥丁酸濃度顯著下降，甘油三酯的濃度顯著上升，葡萄糖的濃度有顯著增加的趨勢(shì)（表3）。

表3 亞急性瘤胃酸中毒對(duì)血漿生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of SARA on plasma biochemical indexes

2.3 血漿代謝組學(xué)分析

根據(jù)Excel數(shù)據(jù)表中的Mass值，基于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)Metlin進(jìn)行全譜鑒定。本試驗(yàn)共鑒定出207種代謝物，這些代謝物主要包括氨基酸類(lèi)、核苷類(lèi)、糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)等。

2.3.1主成分分析和最小二乘法分析CON和SARA組比較的PCA得分結(jié)果表明，CON和SARA組能明顯分開(kāi)（圖2A，B），說(shuō)明兩組樣本之間的血漿代謝物存在明顯差異。PLS-DA模型中兩組形成兩個(gè)明顯的組別，分布在第一主成分兩側(cè)（圖2C，D），正負(fù)模式條件下的R2Y和Q2分別為0.984，0.770和0.974，0.769，R2Y代表在Y軸方向模型的累積解釋率，Q2代表模型的累積預(yù)測(cè)率；置換檢驗(yàn)分析可以看出，回歸線在Y軸上的截距均小于0（圖2E，F(xiàn)），說(shuō)明該模型對(duì)兩組的區(qū)分有較好的預(yù)測(cè)和解釋。

圖2 CON和SARA組正負(fù)模式下的主成分分析得分（A，B），偏最小二乘法分析得分（C，D）和置換檢驗(yàn)（E，F(xiàn)）Fig.2 PCA model score scatter（A，B），PLS-DA model（C，D）and permutation test（E，F(xiàn)）

2.3.2 血漿差異代謝物篩選 以VIP＞1，F(xiàn)DR＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出26種差異代謝物，主要為脂質(zhì)及脂肪酸、氨基酸、有機(jī)酸和苯甲酸類(lèi)物質(zhì)（表4）。與CON組相比，SARA組7-酮脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、12-酮脫氧膽酸、12（13）Ep-9-KODE和12，13-DHOME顯著上調(diào)，十一烷二酸、十六烷二酸、9-HODE、血氧烷B3和前列腺素E2顯著下調(diào)；除L-天冬酰胺外，所有的氨基酸類(lèi)物質(zhì)均顯著下調(diào)；所有的有機(jī)酸和苯甲酸類(lèi)物質(zhì)均顯著下調(diào)。進(jìn)一步使用MetaboAnalyst4.0網(wǎng)站對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)與SARA相關(guān)的差異代謝物主要富集在氨酰t-RNA生物合成和纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成這兩條代謝通路上（圖3）。對(duì)差異代謝物進(jìn)行聚類(lèi)分析，直觀的顯示出了這些差異代謝物在兩個(gè)組的每個(gè)樣品中的具體情況。可以看出（圖4），CON組的4頭牛顯著聚為一類(lèi)，SARA組的4頭牛顯著聚為一類(lèi)，同時(shí)膽酸類(lèi)物質(zhì)顯著聚為一類(lèi)，SARA組均顯著上調(diào)。

圖3 兩組差異代謝通路圖Fig.3 Metabolome pathway of the significantly different metabolites identified in the two groups

圖4 CON組和SARA組的血漿差異代謝物分層聚類(lèi)分析熱圖Fig.4 Heatmap of hierarchical clustering analysis of differential plasma metabolites in CON and SARA group

表4 血漿差異代謝物Table 4 Plasma differential metabolites

3 討論

代謝組學(xué)是對(duì)特定條件下的特定生物樣品中的所有代謝物所進(jìn)行的定性定量分析，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)生、藥物殘留和食品檢測(cè)等領(lǐng)域。本試驗(yàn)采用LC-MS平臺(tái)，檢測(cè)了患SARA后，奶牛血漿代謝物的變化情況，擬進(jìn)一步探究SARA與奶牛機(jī)體新陳代謝之間的深層聯(lián)系，并尋找與SARA相關(guān)的生物標(biāo)志物。

3.1 脂代謝

本研究發(fā)現(xiàn)，相比于CON組，SARA組奶牛血漿中的BHBA含量顯著下降，而甘油三酯的含量顯著上升，同時(shí)引起了一些脂肪酸濃度發(fā)生變化。有研究指出，血中的BHBA、游離脂肪酸和甘油三酯是反芻動(dòng)物乳腺合成乳脂的重要前體物［15-16］，這些物質(zhì)濃度的變化可能會(huì)對(duì)乳脂合成造成影響。同時(shí)，BHBA是酮體的主要成分之一，是肝臟中由脂肪代謝過(guò)程合成的小分子。先前有研究表明，當(dāng)奶牛飼喂含大麥谷物的日糧時(shí)，血漿中BHBA的濃度會(huì)隨著大麥比例的增加而降低［14］；Guo等［7］和孫燕勇等［17］也發(fā)現(xiàn)患SARA的奶牛血漿中BHBA濃度降低，李小杉等［18］和孫玲偉等［19］在臨床上證實(shí)，發(fā)生亞臨床酮病時(shí)，奶牛血液中BHBA含量為1.2 mmol·L-1。本試驗(yàn)中，血漿BHBA含量都在正常范圍內(nèi)，可以初步判斷SARA發(fā)生時(shí)試驗(yàn)動(dòng)物無(wú)酮病隱患。甘油三酯主要是在肝臟、脂肪組織和小腸中合成，其中以肝臟的合成能力最強(qiáng)。有研究指出，血漿中甘油三酯濃度的增加與脂肪肝有關(guān)，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)［20］。綜上，這些物質(zhì)濃度的變化可能表明SARA引起奶牛肝臟功能受損，使機(jī)體脂代謝發(fā)生紊亂。

膽汁酸主要是由肝臟中的膽固醇合成，膽酸是一種初級(jí)膽汁酸，主要在肝臟中合成，脫氧膽酸是一種次級(jí)膽汁酸，主要由膽酸在腸道中合成［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，SARA組奶牛血漿中的多種膽汁酸類(lèi)物質(zhì)（7-酮脫氧膽酸，脫氧膽酸，膽酸和12-酮脫氧膽酸）聚為一類(lèi)并且含量均顯著上升。有研究表明，高濃度的膽汁酸對(duì)機(jī)體有毒性作用，膽汁酸濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)培養(yǎng)的牛胰管上皮細(xì)胞造成組織損傷［21］。另外，膽汁酸在脂質(zhì)代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用，膽汁酸的合成速率與高脂血癥患者血漿甘油三酯水平的升高有關(guān)［23］。因此，SARA組膽汁酸含量的增加可能與甘油三酯含量的增加有關(guān)。肝腸循環(huán)是調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的重要途徑，膽汁酸在肝臟合成后經(jīng)膽鹽輸出泵進(jìn)入膽囊，進(jìn)食后分泌入腸道，最后在回腸中被重吸收，然后通過(guò)門(mén)靜脈血液回到肝臟，重新分泌到膽汁中［22］，該過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。由此，本研究中，發(fā)生SARA的奶牛血漿中膽汁酸含量的升高，可能預(yù)示著其膽汁酸的肝腸循環(huán)受阻，大量膽汁酸淤積在血漿中無(wú)法回到肝臟。本試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SARA組奶牛血漿中的前列腺素E2和類(lèi)前列腺素的濃度下調(diào)。前列腺素（prostaglandin，PG）是生物體內(nèi)的一種局部激素，它具有多種生理活性作用，能與特異性受體結(jié)合后介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列細(xì)胞活動(dòng)以及調(diào)節(jié)雌性生殖功能和分娩、血小板聚集、心血管系統(tǒng)平衡［24］。其主要是由不飽和脂肪酸組成的，因此，前列腺素在SARA組濃度的下調(diào)可能也與脂肪酸代謝有關(guān)。

3.2 氨基酸代謝

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，SARA組的L-天冬酰胺顯著上升，其余發(fā)生變化的氨基酸（精氨酸、色氨酸和蘇氨酸）均顯著下降。在上述氨基酸中，精氨酸主要參與TCA循環(huán)和尿素循環(huán)［25］；色氨酸和蘇氨酸均為生糖氨基酸，生糖氨基酸水平的降低，表明它們可能作為底物進(jìn)入三羧酸循環(huán)提供能量或參與糖異生過(guò)程產(chǎn)生葡萄糖［26］。差異代謝物中雖沒(méi)有檢測(cè)到甘氨酸的變化，但在SARA組奶牛血漿中發(fā)現(xiàn)多種酰基甘氨酸（異丁酰甘氨酸、異戊酰甘氨酸、馬尿酸和4-羥基馬尿酸）的濃度降低。在這些發(fā)生顯著變化的?；拾彼嶂?，馬尿酸是苯甲酰甘氨酸，是苯甲酸與甘氨酸的綴合物，其主要在肝臟中合成，通過(guò)此反應(yīng)，機(jī)體可清除苯甲酸的毒性。因此，SARA組馬尿酸濃度的降低，可能會(huì)造成苯甲酸等代謝廢物在體內(nèi)的積累，增加機(jī)體的患病風(fēng)險(xiǎn)［13，27］。

3.3 糖代謝

在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SARA組血漿中葡萄糖濃度有顯著升高的趨勢(shì)，這可能與SARA條件下奶牛瘤胃內(nèi)丙酸濃度增加有關(guān)［28］，由于進(jìn)入肝臟的丙酸數(shù)量增加，因而經(jīng)糖異生作用生成的葡萄糖的量也有所上升，該結(jié)果也與前人的研究結(jié)果一致［7，14，29］。6-磷酸-2-脫氫-D-葡萄糖酸酯是磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，其在SARA組奶牛血漿中的含量減少，在一定程度上暗示了糖代謝的磷酸戊糖途徑受阻，葡萄糖氧化分解減少。最后，針對(duì)以上討論，將差異代謝物可能參與的代謝途徑進(jìn)行總結(jié)（圖5）。

圖5 奶牛血漿差異代謝物可能參與的代謝途徑Fig.5 Proposed metabolic map of main plasma differential metabolites

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)采用LC/MS代謝組學(xué)技術(shù)，研究了飼喂高谷物日糧后奶牛血漿代謝物的變化情況。結(jié)果表明，與CON組奶牛相比，SARA組奶牛血漿中甘油三酯、膽汁酸類(lèi)物質(zhì)、12（13）Ep-9-KODE、12，13-DHOME和L-天冬酰胺等物質(zhì)含量升高，而B(niǎo)HBA、十一烷二酸、十六烷二酸、PGE2、L-精氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、6-磷酸-2-脫氫-D-葡萄糖酸酯和馬尿酸等物質(zhì)含量降低，表明SARA組奶牛脂代謝、氨基酸代謝和糖代謝都受到了不同程度的影響，這些物質(zhì)也可作為判斷SARA的潛在生物標(biāo)志物。