劉月紅，趙家寧，王科，任博，王文帥

（西安市第四醫(yī)院1.臨床檢驗(yàn)中心，2.輸血科，陜西西安710004；3.重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安412060；4.灃東新城公共衛(wèi)生管理中心，陜西西安710086）

結(jié)腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率呈逐年升高趨勢[1-2]。手術(shù)切除、輔助化療、靶向治療是臨床治療結(jié)腸癌的主要手段，但治療過程中的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較高，整體預(yù)后并不理想。癌細(xì)胞過度增殖及侵襲是與結(jié)腸癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移直接相關(guān)的惡性生物學(xué)行為，針對癌細(xì)胞的增殖、侵襲進(jìn)行干預(yù)也是結(jié)腸癌新治療手段的靶點(diǎn)。

白細(xì)胞介素-37（Interleukin-37,IL-37）是近年來新發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素-1 家族的抑炎細(xì)胞因子，在固有免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用[3]。近年來，炎癥微環(huán)境與惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系受到了越來越多的關(guān)注[4-5]，具有抑炎作用的IL-37也被證實(shí)能夠在宮頸癌、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[6-8]。但I(xiàn)L-37 是否參與結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控仍未明確。為探討IL-37在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，探究未來使用IL-37治療結(jié)腸癌的可能性，本研究檢測IL-37 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的變化，并通過體外實(shí)驗(yàn)探討其對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集2017年4月—2019年4月在西安市第四醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其癌旁組織，共42 例。均取得患者的知情同意及醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞

結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，液氮中冷凍保存。

1.3 試劑與儀器

空白pcDNA3.1 質(zhì)粒、表達(dá)IL-37 的pcDNA3.1 重組質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合

成，質(zhì)粒濃度2.0 mg/ml；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen 公司，MTS 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega 公司，IL-37、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（p-STAT3）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的單克隆一抗購自英國Abcam公司，DP430總RNA 提取試劑盒、KR118 cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒、FP209 Talent 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自北京天根公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組HT29 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 在培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化并傳代繼續(xù)培養(yǎng)。取傳代后對數(shù)生長期的細(xì)胞，分為對照組、空白質(zhì)粒組、IL-37 質(zhì)粒組。對照組用不含轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒的RPMI 1640 處理；空白質(zhì)粒組用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染空白pcDNA3.1 質(zhì)粒，質(zhì)粒終濃度為1.0 μg/ml；IL-37質(zhì)粒組用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染表達(dá)IL-37 的pcDNA3.1重組質(zhì)粒，質(zhì)粒終濃度為1.0 μg/ml。每個(gè)處理?xiàng)l件設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，連續(xù)處理24 h。

1.4.2 MTS 檢測細(xì)胞增殖能力傳代細(xì)胞接種于96 孔板中，分組處理24 h 后，采用MTS 細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測細(xì)胞的增殖能力，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色后在酶標(biāo)儀490 nm 波長處檢測光密度（OD）值，OD 值越高表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.4.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲活力在Transwell 的上室預(yù)涂基質(zhì)膠，而后傳代細(xì)胞接種在Transwell 的上室并分組處理；向下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640，趨化上室內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行侵襲。24 h 后，取下小室膜，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5 個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.4 Western blotting 檢測IL-37、p-STAT3、p-Akt蛋白表達(dá)取結(jié)腸癌組織、癌旁組織和分組處理后的HT29 細(xì)胞，采用RIPA 裂解液提取組織及細(xì)胞中的蛋白，測定蛋白含量后取30 μg 蛋白進(jìn)行Western blotting 檢測。將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中電泳，而后電轉(zhuǎn)移至NC膜，用5%脫脂牛奶封閉NC膜2 h，用1∶1 000 稀釋的IL-37、STAT3、p-STAT3、Akt、p-Akt 一抗4℃孵育過夜；次日，用1∶1 000 稀釋的HPR 二抗孵育NC 膜1 h，顯影后得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算IL-37、p-STAT3、p-Akt 蛋白相對表達(dá)量，β-actin為陰性對照。

1.4.5 qRT-PCR 檢測細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）mRNA 相對表達(dá)量取分組處理后的HT29 細(xì)胞，采用總RNA提取試劑盒分離細(xì)胞中的RNA，采用cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用Talent 熒光定量檢測試劑盒配置PCR 體系對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s、60℃退火25 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。β-actin 為陰性對照。Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 正反向引物序列見表1。自動生成循環(huán)閾值（Ct），2-△△Ct法計(jì)算Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中IL-37 蛋白相對表達(dá)量的比較

結(jié)腸癌組織和癌旁組織中IL-37 蛋白相對表達(dá)量為（0.31±0.07）和（0.92±0.16）。兩者比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.393，P=0.000），結(jié)腸癌組織中IL-37 蛋白相對表達(dá)量降低。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中IL-37蛋白相對表達(dá)量

2.2 3 組結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中IL-37 蛋白相對表達(dá)量的比較

結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中，對照組、空白質(zhì)粒組和IL-37 質(zhì)粒組的IL-37 蛋白相對表達(dá)量分別為（0.20±0.06）、（0.22±0.08）和（0.98±0.21），3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.384，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，IL-37 質(zhì)粒組IL-37 的蛋白相對表達(dá)量高于對照組及空白質(zhì)粒組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組HT29細(xì)胞中IL-37蛋白相對表達(dá)量

2.2 3 組結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞的OD 值和穿膜細(xì)胞數(shù)比較

3 組結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞的OD 值和穿膜細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，IL-37 質(zhì)粒組的OD 值、穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組及空白質(zhì)粒組降低。見圖3 和表1。

圖3 3組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞侵襲能力比較 （結(jié)晶紫染色×400）

表1 3組HT29細(xì)胞的OD值和穿膜細(xì)胞數(shù)的比較（x±s）

2.3 3 組結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量比較

3 組結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，IL-37 質(zhì)粒組CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量較對照組及空白質(zhì)粒組降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量的比較 （±s）

表2 3組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量的比較 （±s）

組別Cyclin D1 mRNA Bcl-2 mRNA MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA對照組空白質(zhì)粒組IL-37質(zhì)粒組F 值P 值0.88±0.15 0.93±0.17 0.40±0.08 126.060 0.000 0.79±0.14 0.84±0.18 0.50±0.09 93.394 0.000 0.91±0.16 0.98±0.17 0.33±0.08 137.658 0.000 0.71±0.15 0.77±0.20 0.45±0.08 67.348 0.000

2.4 3 組結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中p-STAT3、p-Akt 蛋白相對表達(dá)量的比較

3 組結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中p-STAT3、p-Akt 蛋白相對表達(dá)量的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較，IL-37 質(zhì)粒組較對照組及空白質(zhì)粒組p-STAT3、p-Akt 的蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表3 和圖4。

表3 3組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中p-STAT3、p-Akt蛋白相對表達(dá)量的比較 （±s）

表3 3組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中p-STAT3、p-Akt蛋白相對表達(dá)量的比較 （±s）

組別p-STAT3 p-Akt空白對照組空白質(zhì)粒組IL-37質(zhì)粒組F 值P 值0.92±0.15 0.98±0.17 0.42±0.09 135.021 0.000 0.96±0.18 0.91±0.14 0.40±0.10 126.300 0.000

圖4 3組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中p-STAT3、p-Akt蛋白的表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生涉及多因素、多環(huán)節(jié)，其中炎癥微環(huán)境與結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)系近年來受到越來越多的關(guān)注[9]。在腫瘤的炎癥微環(huán)境中，多種促炎因子、趨化因子、血管新生因子表達(dá)增多，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及腫瘤新生血管的形成[10-12]。IL-37是新型的抑炎細(xì)胞因子，對多種促炎因子、趨化因子的生成具有抑制作用。已有報(bào)道，結(jié)腸癌IL-37低表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期較IL-37 高表達(dá)患者明顯縮短[13-14]。本研究所檢測的結(jié)腸癌組織及癌旁組織中，結(jié)腸癌組織中IL-37 蛋白相對表達(dá)量低于癌旁組織。以上結(jié)果提示IL-37 表達(dá)減少與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸均密切相關(guān)，IL-37可能具有抑癌作用，本研究進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證IL-37的抑癌作用。

有研究報(bào)道，IL-37 對宮頸癌、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲具有抑制作用[6-8]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中觀察IL-37 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用。已培養(yǎng)的結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染表達(dá)IL-37 的pcDNA3.1 重組質(zhì)粒，可以觀察到結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中IL-37 蛋白相對表達(dá)量增多，說明轉(zhuǎn)染表達(dá)IL-37 的重組質(zhì)粒能夠引起結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中IL-37 的過表達(dá)。在過表達(dá)IL-37 后分別通過MTS 細(xì)胞增殖試劑盒和Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖及侵襲可知，細(xì)胞的OD 值及侵襲能力均降低，說明過表達(dá)IL-37 能夠顯著抑制結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞的增殖和侵襲，與既往關(guān)于IL-37 在其他惡性腫瘤中的抑癌作用吻合[15-16]。

在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲受到相應(yīng)基因的調(diào)控，Cyclin D1和Bcl-2是促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因，MMP-2和MMP-9是促進(jìn)細(xì)胞侵襲的基因。已有研究報(bào)道，結(jié)腸癌組織中上述增殖和侵襲基因的表達(dá)均明顯增多[17-20]。Cyclin D1能夠使細(xì)胞周期加速并促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，Bcl-2能夠拮抗線粒體途徑凋亡并促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，MMP-2和MMP-9能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜并促進(jìn)細(xì)胞向鄰近組織侵襲[21]。在本研究中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)IL-37 后，結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量均降低，說明IL-37 對結(jié)腸癌細(xì)胞中促增殖及促侵襲基因的表達(dá)具有抑制作用，這與IL-37 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用吻合。

在明確IL-37 能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲并調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)后，本研究還對IL-37 發(fā)揮上述作用的分子機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。宮頸癌、肺癌的相關(guān)研究證實(shí)，IL-37 能夠通過抑制STAT3的激活來發(fā)揮抑癌作用[8，21]；肝癌的相關(guān)研究證實(shí)，IL-37 能夠通過抑制Akt 的激活來發(fā)揮抑癌作用[22]。在結(jié)腸癌中，STAT3 和Akt 的表達(dá)均明顯增多[23-24]，且阻斷STAT3/Akt 通路能夠抑制離體培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)順鉑化療的敏感性[25]。本研究在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)IL-37 后，IL-37 質(zhì)粒組細(xì)胞中的p-STAT3、p-Akt 蛋白相對表達(dá)量降低，說明IL-37 對結(jié)腸癌細(xì)胞中STAT3/AKT 通路的激活具有抑制作用，這也可能是IL-37 在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制。

綜上所述，IL-37 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)減少；在體外實(shí)驗(yàn)中，增加IL-37 的表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲，且該抑制作用可能與抑制STAT3/Akt 通路有關(guān)，今后IL-37 有望成為治療結(jié)腸癌的新靶點(diǎn)，但本研究未能得到IL-37 直接通過STAT3/Akt 通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的證據(jù)。今后應(yīng)進(jìn)一步使用STAT3/Akt 通路抑制劑或設(shè)計(jì)STAT3、Akt 的siRNA，在過表達(dá)IL-37 的同時(shí)聯(lián)用STAT3/Akt 通路抑制劑或siRNA，以此來驗(yàn)證IL-37通過STAT3/Akt 通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用。