孫飛，黃用豪

（天津市人民醫(yī)院麻醉科，天津300121）

結(jié)直腸癌是消化道最常見惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、惡性程度高、預(yù)后不良等特點，嚴(yán)重危害人類生命健康[1-2]。結(jié)直腸癌細(xì)胞持續(xù)性無限增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。七氟醚是臨床常用的吸入性麻醉藥物，廣泛應(yīng)用于多種手術(shù)，與惡性腫瘤關(guān)系密切，參與膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為變化過程[3-5]。microRNA（miRNA）是一類非編碼RNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生理過程，microRNA-203（miR-203）是miRNA 家族中重要一員，是抑癌非編碼小分子RNA 之一，其表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚可以通過調(diào)控miR-203 表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，但其在結(jié)直腸癌方面報道較少[7]。本研究通過體外實驗觀察七氟醚對人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞侵襲、遷移的影響以及對miR-203 的調(diào)控作用，探討其可能作用機制，為臨床診治結(jié)直腸癌提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器七氟醚（美國Baxter公司），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司），Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室（美國Corning 公司），900 型麻醉機（美國歐美達(dá)公司），miR-203 過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)空載體質(zhì)粒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司），兔抗人細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）多抗、p-ERK 多抗和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）多抗（美國CST 公司），山羊抗兔IgG-HRP（美國Abcam 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞接種于DMEM 培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% FBS+100 u/ml 青霉素+100 μg/ml 鏈霉素），置于體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次，取對數(shù)增殖期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞分組及干預(yù)轉(zhuǎn)染前1 d，將HCT116 細(xì)胞按2×105個/孔接種于6 孔板中，置于體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，參照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將miR-203 mimics 和 miR-203 mimics-NC 轉(zhuǎn)染至HCT116 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h。根據(jù)轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)條件分組：對照組（5% CO2培養(yǎng)+未轉(zhuǎn)染）、七氟醚組（4%七氟醚+5% CO2培養(yǎng)+未轉(zhuǎn)染），miR-203組（5%CO2培養(yǎng)+轉(zhuǎn)染miR-203 mimics）、miR-203+七氟醚組（4%七氟醚+5% CO2培養(yǎng)+轉(zhuǎn)染miR-203 mimics），miR-203-NC+七氟醚組（4%七氟醚+5% CO2培養(yǎng)+轉(zhuǎn)染miR-203 mimics-NC）。轉(zhuǎn)染后24 h 后，置于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)出綠色熒光的為陽性細(xì)胞，隨機選取20 個視野計數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3 CCK-8 實驗檢測細(xì)胞抑制率采用CCK-8實驗檢測細(xì)胞的增殖能力。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，各個時間點結(jié)束前4 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，每組設(shè)置5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 150 μl/孔，充分振蕩10 min 后，用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處測定各孔光密度（OD）值，實驗重復(fù)3 次，計算細(xì)胞抑制率。抑制率（%）=（1-實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。

1.2.4 qRT-PCR 法檢測miRNA-203 表達(dá)胰酶消化收集各組細(xì)胞，采用Trizol 試劑提取總RNA，分光光度儀檢測所提RNA 的濃度和純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，按照Real-time 定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 擴增。反應(yīng)體系包括：正反向引物各1 μl，cDNA 模板1 μl，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl，加ddH2O至總體積20 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，57℃退火30 s，70℃延伸30 s，循環(huán)40 次，分析熔解曲線，反應(yīng)結(jié)束后計算Ct 值，實驗重復(fù)3 次，取平均值。引物由上海吉瑪公司設(shè)計合成，以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-203 相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測將各組細(xì)胞以5×106個/ml 密度接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)90%時，用無菌移液槍頭在細(xì)胞表面垂直劃線，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次后在劃痕處拍照（0 h），更換培養(yǎng)基后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12 h 和24 h 拍照，測量劃痕間距，計算細(xì)胞遷移率。遷移率（%）=（0 h 劃痕距離-各時間劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100%。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力檢測以1∶2 稀釋的Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell 小室上室，加入不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中靜置1 h。對細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，密度調(diào)整為2×105個/ml，取200 μl 細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室上室，下室加入500 μl含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去上室多余細(xì)胞，每孔加入1 ml 多聚甲醛進(jìn)行固定，固定30 min 后，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，吸去染色液，PBS 洗滌3 次，晾干后于顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞量，以穿膜細(xì)胞數(shù)作為細(xì)胞侵襲力評價指標(biāo)，每孔隨機選取5 個視野，取平均數(shù)。

1.2.7 各組細(xì)胞ERK、p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量的檢測收集各組細(xì)胞，加入Ripa 裂解液，冰上裂解，離心后收集上清，用BCA 法檢測蛋白濃度并定量，蛋白樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴加熱使蛋白變性，配制10%聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入稀釋1∶500 的EPK、p-EPK、MMP-9、β-actin 一抗，4 ℃搖床孵育過夜，PBS 洗滌3 次，加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，PBS 洗滌3 次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、定影，以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 圖像分析軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值表示。每組均設(shè)5 個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率

轉(zhuǎn)染miR-203 mimics 和miR-203 mimics-NC 均有熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染率≥85%，可用于后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果 （×200）

2.2 各組細(xì)胞抑制率比較

七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細(xì)胞24 h、48 h、72 h 抑制率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點細(xì)胞抑制率有差異（F=49.586，P=0.000）；②各組細(xì)胞抑制率有差異（F=43.267，P=0.000）；③各組細(xì)胞抑制率變化趨勢有差異（F=41.258，P=0.000）。見表2。

表2 各組細(xì)胞抑制率的比較 （n=5，%，±s）

表2 各組細(xì)胞抑制率的比較 （n=5，%，±s）

組別七氟醚組miR-203組miR-203+七氟醚組miR-203-NC+七氟醚組24 h 20.13±2.21 22.36±2.48 36.49±3.78 23.84±2.67 48 h 36.48±3.89 37.59±3.91 50.81±5.15 35.48±3.75 72 h 45.61±4.87 48.17±5.02 63.59±6.58 47.26±4.93

2.3 各組細(xì)胞的miRNA-203表達(dá)水平比較

對照組、七氟醚組、miR-203組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細(xì)胞的miRNA-203 相對表達(dá)量分別為：（0.52±0.07）、（1.75±0.18）、（1.78±0.18）、（2.35±0.25）和（1.71±0.17），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=65.702，P=0.000）。七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細(xì)胞的miR-203 相對表達(dá)量較對照組升高，且以miR-203+七氟醚組最高（P＜0.05）；七氟醚組、miR-203組、miR-203-NC+七氟醚組細(xì)胞的miR-203 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組細(xì)胞遷移率比較

各組細(xì)胞12 h 和24 h 遷移率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點細(xì)胞遷移率有差異（F=86.523，P=0.000）；②各組細(xì)胞遷移率有差異（F=64.158，P=0.000）；③各組細(xì)胞遷移率變化趨勢有差異（F=102.557，P=0.000）。見表3 和圖2。

表3 各組細(xì)胞遷移率比較 （n=5，%，±s）

表3 各組細(xì)胞遷移率比較 （n=5，%，±s）

組別對照組七氟醚組miR-203組miR-203+七氟醚組miR-203-NC+七氟醚組12 h 50.12±4.86 20.36±3.01 22.81±2.52 12.59±1.85 19.58±3.14 24 h 81.15±8.53 37.53±6.71 44.67±6.85 20.37±3.21 40.67±6.54

圖2 各組細(xì)胞遷移距離比較 （×100）

2.5 各組細(xì)胞穿膜數(shù)量比較

對照組、七氟醚組、miR-203組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（146.20±15.16）個、（82.40±10.01）個、（80.6±10.21）個、（35.20±4.13）個、（85.80±10.06）個，經(jīng)單因素方差分析，各組穿膜細(xì)胞數(shù)量有差異（F=71.226，P=0.000）。七氟醚組、miR-203組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組穿膜細(xì)胞數(shù)量均較對照組減少，且miR-203+七氟醚組穿膜細(xì)胞最少（P＜0.05）。七氟醚組、miR-203 組、miR-203-NC+七氟醚組穿膜細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞穿膜數(shù)量比較 （×200）

2.6 各組細(xì)胞ERK、p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量比較

各組細(xì)胞p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量有差異（F=80.679 和83.729，均P=0.000）。七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細(xì)胞p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量較對照組降低，且以miR-203+七氟醚組最低（P＜0.05）。七氟醚組、miR-203 組、miR-203-NC+七氟醚組細(xì)胞p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組ERK 蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4 和圖4。

表4 各組細(xì)胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白相對表達(dá)量比較 （n=5，±s）

表4 各組細(xì)胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白相對表達(dá)量比較 （n=5，±s）

組別對照組七氟醚組miR-203組miR-203+七氟醚組miR-203-NC+七氟醚組ERK 1.03±0.11 1.10±0.12 1.05±0.11 1.07±0.12 1.11±0.12 p-ERK 0.95±0.10 0.46±0.05 0.45±0.05 0.28±0.03 0.49±0.06 MMP-9 1.08±0.11 0.51±0.05 0.53±0.06 0.34±0.04 0.55±0.06

圖4 各組細(xì)胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

手術(shù)是結(jié)直腸癌的主要治療方法，但術(shù)后易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差，因此，研究探討結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機制對其診斷、治療及預(yù)后有重要意義。七氟醚是臨床腫瘤切除術(shù)中常用麻醉藥，其對患者認(rèn)知功能損害小，可有效改善患者術(shù)后血液流變學(xué)指標(biāo)，降低手術(shù)引起的免疫抑制，降低血液黏稠度，減少血栓發(fā)生率[8-9]?；谄叻言诮Y(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用，本研究通過探討七氟醚對結(jié)直腸癌侵襲、遷移機制的影響，以期為結(jié)直腸癌診斷、治療及預(yù)后提供新途徑，為提高患者生存率提供新的理論參考[10]。

侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞顯著的惡性生物學(xué)特征，是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要因素，也是臨床抗腫瘤治療失敗和導(dǎo)致患者死亡的主要原因。惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是多種因素及多個基因相互調(diào)控的復(fù)雜過程，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移對提高患者生存質(zhì)量具有重要意義[11]。既往研究證實，七氟醚可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，在抗腫瘤方面顯示獨特作用，對患者生存率產(chǎn)生一定影響[12]。DING 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚通過靶向Ras 蛋白和靶向RhoA 蛋白抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移。KANG 等[14]研究顯示，七氟醚通過調(diào)節(jié)JNK 和p38 MAPK 信號通路影響卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。本研究七氟醚組細(xì)胞遷移率顯著降低，穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明七氟醚能抑制HCT116細(xì)胞侵襲和遷移。

CHI 等[15]研究顯示，miR-203 可通過靶向下游相關(guān)基因抑制肺小細(xì)胞癌增殖和遷移。ZHANG 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-203 可通過調(diào)控RGS17 抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究miR-203 組穿膜細(xì)胞顯著減少、細(xì)胞遷移率顯著下降，表明過表達(dá)miR-203 可抑制HCT116 細(xì)胞侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，miR-203 在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)較正常結(jié)直腸組織、細(xì)胞異常降低，在結(jié)直腸癌發(fā)病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[17]。本研究對照組miR-203 低表達(dá)，與以上研究結(jié)果一致，同時miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組miR-203 表達(dá)顯著升高，其中miR-203+七氟醚組miR-203 表達(dá)更高，提示七氟醚可能對miR-203 有調(diào)控作用。CHEN 等[18]研究表明，七氟醚可通過調(diào)節(jié)miR-203 表達(dá)抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。LIU等[19]研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚可通過調(diào)節(jié)miR-203 表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。由此表明，七氟醚能抑制HCT116細(xì)胞侵襲和遷移，可能是通過調(diào)控miR-203 表達(dá)發(fā)揮抑制作用。

ERK 參與腫瘤增殖、凋亡、侵襲及遷移過程，是MAPK 信號通路之一，p-ERK 是衡量ERK 信號通路的活性指標(biāo)，持續(xù)活化的ERK 通路有助于正常細(xì)胞向腫瘤表型轉(zhuǎn)化。MMP-9 是重要蛋白水解酶，在多種腫瘤中表達(dá)，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，增強細(xì)胞侵襲力和轉(zhuǎn)移力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。ERK活化可激活下游MMP-9，提高腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷ERK 信號通路可以降低人骨肉瘤細(xì)胞活力，抑制其增殖、遷移、侵襲[20]。另有研究顯示，葒草苷可以通過阻斷ERK 信號通路下調(diào)MMP-9 表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移[21]。本研究七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組p-ERK、MMP-9 蛋白水平顯著下降，表明ERK 信號通路被阻斷，從而影響HCT116 細(xì)胞侵襲和遷移。研究表明，miR-203 可以通過破壞ERK/MMP-9 信號軸抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移[22]。另有研究顯示，在乳腺癌細(xì)胞中，小干擾RNA 通過升高miR-203 表達(dá)，下調(diào)MMP-9 表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[23]。本研究miR-203+七氟醚組p-ERK、MMP-9 蛋白水平下降最顯著，表明七氟醚對HCT116 細(xì)胞的抑制作用可能是通過上調(diào)miR-203表達(dá)，阻斷ERK/MMP-9 通路，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞侵襲和遷移作用。

綜上所述，七氟醚有顯著抑制人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞侵襲和遷移作用，其作用機制可能是通過上調(diào)miR-203 表達(dá)、阻斷ERK/MMP-9 通路發(fā)揮調(diào)控作用，為臨床診治結(jié)直腸癌提供理論參考。