鄭培明，李俊蒙，張 鵬，高 嵐

1.河南省人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院胃腸外科，河南 鄭州 450003

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，中國是胃癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，死亡率居第2位［1］。由于早診率低，大多數(shù)胃癌患者就診時已處于晚期，錯過了手術(shù)機會。以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療是美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦的進展期胃癌患者的一線化療方案［1-2］，然而耐藥成為限制患者臨床受益、困擾臨床醫(yī)師的一大難題［3］。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）是腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的重要組成部分。TAM與腫瘤細胞之間的相互作用促進腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥等進程［4］。外泌體作為細胞間信息傳遞的重要媒介，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［5］。我們的前期研究［6］已證實，胃癌中存在大量TAM，并且可通過外泌體的傳遞促進胃癌進展。

miRNA是外泌體中非編碼RNA的重要組成部分，且發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［7］。我們前期對巨噬細胞來源外泌體miRNA進行芯片分析，結(jié)果顯示，miR-223表達豐富，miR-223也與多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等密切相關(guān)［8］。本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，探討巨噬細胞是否通過外泌體傳遞miR-223促進胃癌細胞對奧沙利鉑的耐藥及可能的作用機制，旨在為胃癌的防治提供新策略。

1 材料和方法

1.1 細胞系

本實驗所使用的單核細胞系THP-1、胃癌細胞系SGC-7901均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑

細胞培養(yǎng)用的DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，mRNA、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，transwell小室購自美國Corning公司，細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）及細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）所用FBXW7、MCL1及二抗均購自美國CST公司，GAPDH抗體購自英國Abcam公司，白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-13等細胞因子購自美國PeproTech公司，LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司，miRNA mimics、inhibitor及陰性對照均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，Alexa Fluor 488 Phalloidin購自美國Life Technologies公司；常規(guī)生化試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

胃癌細胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基，THP-1細胞用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，添加10%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。所有細胞均在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫箱中溫育培養(yǎng)。巨噬細胞的誘導(dǎo)極化：THP-1細胞先加320 nmol/L佛波酯（phorbol-12-myristate 13-acetate，PMA），刺激6 h后加入IL-4（20 ng/mL）+IL-13（20 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細胞共培養(yǎng)實驗采用0.4 μm的transwell小室，提前1 d將需要共培養(yǎng)的胃癌細胞接種至24或12孔板中，待細胞貼壁后加入transwell小室，小室上層接種預(yù)先刺激誘導(dǎo)好的巨噬細胞，共培養(yǎng)48 h后收集下層胃癌細胞，用于后續(xù)功能試驗。

1.3.2 外泌體的分離與鑒定

分離：收集巨噬細胞培養(yǎng)基5 0 mL，2 000×g離心10 min收集上清液，10 000×g離心30 min收上清液，用0.22 μm濾膜過濾1次，100 000×g離心90 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）重懸后洗滌1次，100 000×g離心70 min，得到純度較高的外泌體，最后用PBS重懸。透射電鏡：吸取樣品10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，吸取醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，常溫干燥數(shù)分鐘，上機80～120 kⅤ成像觀察外泌體的形態(tài)。胃癌細胞與巨噬細胞來源外泌體共培養(yǎng)時，首先檢測純化外泌體濃度，然后按1×105個細胞加10 μg外泌體的比例進行共培養(yǎng)。

1.3.3 miR-223 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染

Cy 3 標記的mi R-223 mimics、mi R-223 inhibitor 及相應(yīng)的陰性對照由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成，使用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染巨噬細胞。收集轉(zhuǎn)染后的巨噬細胞培養(yǎng)上清液并分離外泌體，然后將其加入胃癌細胞的培養(yǎng)基中。使用Alexa Fluor 488 Phalloidin標記F-actin從而顯示細胞骨架，然后通過共聚焦顯微鏡觀察胃癌細胞中是否有Cy3紅色熒光。采用CCK-8及凋亡實驗觀察轉(zhuǎn)染miR-223 inhibitor巨噬細胞來源外泌體共培養(yǎng)的胃癌細胞對奧沙利鉑的化療敏感性。

1.3.4 CCK-8實驗

稀釋胃癌細胞使其培養(yǎng)液濃度為3×104個細胞/mL，每孔100 μL加到96孔板中，待細胞貼壁生長后加入不同濃度的奧沙利鉑，每個濃度每組實驗接種5個復(fù)孔。48 h后進行細胞活性檢測。每次測試加10 μL CCK-8（按1∶10）至待測孔中，混勻，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中放置1～2 h，在酶標儀上測定450 nm處的吸光度（D）值，不同組孔的D值減去空白對照孔的D值的差值反映細胞數(shù)量。最后根據(jù)實驗結(jié)果比較各組間差異。所有實驗均獨立重復(fù)3次。

1.3.5 細胞凋亡實驗

②數(shù)據(jù)資源預(yù)處理。這個時期是整個數(shù)據(jù)挖掘過程中最為重要的時期，經(jīng)過對各種相關(guān)數(shù)據(jù)資源的轉(zhuǎn)化、剖析與處理，不但能讓數(shù)據(jù)更易于被識別，更能切實提升數(shù)據(jù)挖掘的成效。給后期相關(guān)數(shù)據(jù)的分析與挖掘提供便利，提高數(shù)據(jù)處理的精準性。比如，依據(jù)計算機互聯(lián)網(wǎng)系統(tǒng)數(shù)據(jù)包中的端口信息、IP地址、等，對各類數(shù)據(jù)資源進行分類處理與集合整理，為將來的數(shù)據(jù)挖掘做好鋪墊工作。

用于凋亡檢測的胃癌細胞預(yù)先與巨噬細胞或巨噬細胞來源外泌體進行共培養(yǎng)，然后加入既定濃度的奧沙利鉑作用48 h。胰酶消化細胞，制備單細胞懸液，并進行細胞計數(shù)。吸取1×106個細胞加入到5 mL流式細胞術(shù)所用試管中。吸取100 μL的細胞懸液至新的流式管中，分別加入5 μL FITC-Annexin Ⅴ和5 μL 7-AAD。輕輕混勻后室溫避光反應(yīng)15 min。每管中加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，并在1 h內(nèi)上機檢測。分別計算早期凋亡和中晚期凋亡比例，比較分析各組間差異。

1.3.6 RTFQ-PCR實驗

總RNA的提取采用Qiagen試劑盒，mRNA的反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT Master Mix，miRNA的反轉(zhuǎn)錄采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis，PCR按SYBR RTFQ-PCR Kit試劑盒說明書操作，mRNA檢測以GAPDH為內(nèi)參，miRNA檢測以U6作為內(nèi)參，使用7900HT RTFQPCR System（美國Applied Biosystems公司）進行擴增反應(yīng)，最后使用公式2-ΔΔCt進行不同組間基因表達差異的比較。

1.3.7 Western blot

首先采用含蛋白酶抑制劑的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）裂解液裂解細胞及外泌體收集蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度后配置10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）膠80 Ⅴ電泳，半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)膜、封閉后4 ℃一抗溫育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween，PBST）洗膜后溫育熒光二抗，用ODYSSEY紅外成像系統(tǒng)掃描聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜成像。

1.3.8 血漿標本的收集與分離

分別收集2020年5月—2020年9月河南省人民醫(yī)院收治的30例胃癌初診患者及20名同年齡段健康體檢者血液標本，兩步法分離血漿，4 ℃下3 000×g離心10 min，第2次4 ℃下12 000×g離心10 min，收集上清-80 ℃保存直至外泌體分離。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞通過外泌體直接傳遞miR-223至胃癌細胞

首先通過透射電鏡、粒徑分析技術(shù)對巨噬細胞來源外泌體進行鑒定，觀察到分離得到的外泌體具有典型的茶杯樣結(jié)構(gòu)，大小為80～100 nm，符合外泌體的典型特征（圖1A、B）。巨噬細胞轉(zhuǎn)染熒光標記的Cy3-miR-223后分離外泌體并與SGC-7901共培養(yǎng)，采用熒光顯微鏡在SGC-7901中觀測到紅色熒光，對照組無熒光（圖1C）。RTFQ-PCR檢測胃癌細胞中miR-223的表達水平，發(fā)現(xiàn)與巨噬細胞共培養(yǎng)后SGC-7901細胞miR-223的表達水平顯著升高（7.48±0.66），而用GW4869阻斷外泌體分泌后SGC-7901細胞miR-223的表達水平無明顯變化（1.49±0.18）（圖1D）。SGC-7901細胞直接與巨噬細胞來源外泌體共培養(yǎng)后miR-223的表達水平顯著升高（8.52±0.77）（圖1E），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 巨噬細胞通過外泌體直接傳遞miR-223至胃癌細胞Fig.1 Macrophages transmit exosomal miR-223 to gastric cancer cells directly

2.2 巨噬細胞外泌體源miR-223促進胃癌細胞對奧沙利鉑的耐藥

胃癌細胞SGC-7901與巨噬細胞共培養(yǎng)后，其對奧沙利鉑的敏感性降低，半數(shù)抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）明顯升高（12.45±2.29），而用GW4869阻斷外泌體分泌后IC50降至正常（5.06±0.29）（圖2A）。進一步實驗表明，胃癌細胞SGC-7901與巨噬細胞來源外泌體共培養(yǎng)后，其對奧沙利鉑的敏感性降低，IC50明顯升高（9.77±1.17），而當巨噬細胞轉(zhuǎn)染miR-223拮抗劑后，胃癌細胞SGC-7901 IC50無明顯改變（4.79±0.26）（圖2B）。此外通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)與巨噬細胞來源外泌體共培養(yǎng)后，SGC-7901凋亡率顯著下降［（12.5±0.3）%］，而當巨噬細胞轉(zhuǎn)染miR-223拮抗劑后，SGC-7901凋亡率無明顯改變［（28.7±0.4）%］（圖2C）。RTFQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與巨噬細胞來源外泌體共培養(yǎng)后，SGC-7901細胞miR-223水平顯著升高（9.33±1.02），轉(zhuǎn)染miR-223拮抗劑后，miR-223表達水平恢復(fù)正常（1.43±0.45）（圖2D）。

圖2 巨噬細胞外泌體源miR-223促進胃癌細胞對奧沙利鉑的耐藥Fig.2 Exosomal transfer of TAM-derived miR-223 confers oxaliplatin resistance to gastric cancer cells

2.3 外泌體源miR-223促進胃癌細胞對奧沙利鉑耐藥的機制

之前的研究［9-10］表明，F(xiàn)BXW7是miR-223的重要靶向分子標志物之一，并且在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控MCL1的降解影響細胞凋亡。RTFQ-PCR及Western blot結(jié)果顯示，與巨噬細胞及其來源外泌體共培養(yǎng)后，SGC-7901細胞FBXW7的表達水平顯著下降，MCL1蛋白的表達水平升高，用GW4869阻斷巨噬細胞外泌體分泌或轉(zhuǎn)染miR-223拮抗劑后，F(xiàn)BXW7及MCL1蛋白的表達水平無明顯變化（圖3）。

圖3 巨噬細胞通過外泌體傳遞miR-223促進胃癌奧沙利鉑耐藥的機制Fig.3 Mechanism of TAM-derived exosomal miR-223 promoting oxaliplatin resistance in gastric cancer cells

2.4 血漿外泌體源miR-223在胃癌患者中的表達水平

通過RTFQ-PCR檢測不同胃癌患者及健康對照者血液標本中外泌體源miR-223的表達水平，結(jié)果表明，腫瘤組患者血漿中外泌體源miR-223的表達水平顯著高于健康對照組，而對奧沙利鉑耐藥的胃癌患者血漿中外泌體源miR-223的表達水平顯著高于化療敏感組（1.28±0.45vs0.51±0.33）（圖4）。

圖4 血漿外泌體源miR-223在胃癌患者中的表達水平Fig.4 Expression levels of plasma exosomal miR-223 in different gastric cancer patients and paired healthy controls

3 討論

隨著腫瘤靶向治療及免疫治療時代的到來，針對免疫細胞的研究成為近年來的研究熱點。作為腫瘤微環(huán)境中重要的免疫調(diào)節(jié)細胞之一，巨噬細胞的極化參與腫瘤進展，同時又受其調(diào)控。巨噬細胞通?？煞譃榻?jīng)典活化（M1）型巨噬細胞和選擇性活化（M2）型巨噬細胞，二者可以相互轉(zhuǎn)化［11］。一般來說，M1型TAM具有抗腫瘤作用，M2型TAM具有促腫瘤作用［12］。在包括胃癌在內(nèi)的大多數(shù)實體腫瘤中，TAM主要以M2型為主，TAM的浸潤數(shù)量、類型等與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、耐藥等進程密切相關(guān)［13-14］。外泌體是細胞外囊泡的一種，可通過傳遞miRNA、脂質(zhì)、蛋白等多種活性分子實現(xiàn)細胞間信息傳遞［15］。大量研究［16-18］表明，腫瘤微環(huán)境中包括TAM在內(nèi)的基質(zhì)細胞可通過外泌體的釋放，影響腫瘤細胞的特性，促進腫瘤進展。miRNA作為外泌體的重要組成部分，受到外泌體脂質(zhì)雙分子層的包裹不易降解，從而更有利于miRNA的傳遞及進入目標細胞行使其調(diào)控功能［7，15］。

我們的前期研究［6，19］表明，M2型TAM在胃癌組織中大量浸潤，其可通過外泌體的傳遞與胃癌細胞相互作用，從而促進胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥。本研究表明，體外誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞與胃癌細胞SGC-7901共培養(yǎng)后，巨噬細胞可通過外泌體傳遞miR-223分子至胃癌細胞中，增強胃癌細胞的抗凋亡能力，促進其對化療藥物奧沙利鉑的耐藥。阻斷巨噬細胞中miR-223分子表達后，巨噬細胞促進SGC-7901化療耐藥的作用明顯減弱，表明miR-223可能是巨噬細胞通過外泌體促進胃癌細胞耐藥的重要參與者。FBXW7被證實是miR-223的重要靶向分子標志物之一［9］，其作為p53依賴性腫瘤抑制基因，主要通過泛素化降解途徑對下游多個重要癌基因發(fā)揮調(diào)控作用［10］。有研究［20］表明，miR-223/FBXW7軸在腫瘤細胞對多種藥物的耐藥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與本研究結(jié)果一致。初步機制探討表明，巨噬細胞外泌體源miR-223進入胃癌細胞后，下調(diào)FBXW7的表達，解除其對下游基因MCL1的調(diào)控，從而增強胃癌細胞的抗凋亡能力，促進胃癌細胞對奧沙利鉑的耐藥，詳細的作用機制有待進一步研究。

作為液體活檢的重要研究對象，外泌體在腫瘤的早期診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評估中具有廣泛的應(yīng)用前景［21］。本研究通過對臨床胃癌患者的血液標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體源miR-223在胃癌患者尤其是奧沙利鉑耐藥患者中呈顯著高表達，提示其有望成為臨床胃癌患者療效監(jiān)測的有效分子標志物，但此部分研究患者數(shù)量較少，存在一定局限性，其臨床應(yīng)用價值有待于更大規(guī)模的隊列研究予以驗證。

綜上所述，本研究證實，TAM外泌體源miR-223通過靶向FBXW7促進胃癌細胞對奧沙利鉑的耐藥，不僅豐富了我們對臨床胃癌化療耐藥的認識，同時有望為今后圍繞阻斷TAM外泌體分泌的基礎(chǔ)研究和臨床靶向治療提供新的線索。