王德信,楊曉瑩

(1.菏澤學院農業(yè)與生物工程學院，山東 菏澤 274015；2菏澤學院學報編輯部，山東 菏澤 274015)

農學學科是應用型學科，專業(yè)實踐性強，實驗教學是重要的實踐性環(huán)節(jié)，開設綜合性設計實驗是提高學生實踐能力和創(chuàng)新能力重要方法[1].有效利用所學課程知識，掌握文獻資料的查閱，系統(tǒng)的設計實驗，準確分析實驗結果，使學生認識實驗因素的作用，獲得與生產相關問題的分析技能，為農業(yè)生產工藝、農產品加工工藝優(yōu)化設計等做出貢獻.因此積極開設綜合實驗設計教學，對于提高學生統(tǒng)計分析能力以及實驗設計水平具有重要意義[2].卵磷脂的提取純化及鑒定實驗是農學、食品科學等相關專業(yè)生物化學課程中的一個重要實驗，重點要求學生掌握卵磷脂的提取工藝與鑒定方法，同時驗證卵磷脂的基本性質.卵磷脂的提取與鑒定綜合設計性實驗要求學生通過正交試驗設計方法優(yōu)化蛋黃中卵磷脂的提取條件，訓練學生實驗設計水平并掌握分析方法，提升綜合創(chuàng)新能力.

1 實驗原理

卵磷脂又稱磷脂酰膽堿、蛋黃素，在食品工業(yè)中廣泛用作乳化劑、抗氧化劑、食品營養(yǎng)添加劑等[3].卵磷脂廣泛存在于動植物中，是由脂肪酸、甘油、磷酸組成的甘油磷脂，大豆種子和蛋黃中含量較高，其中蛋黃中卵磷脂含量可達10%左右，含量最豐富，因此稱為卵磷脂.卵磷脂具有抗衰老、增強記憶力、降血脂、修復腦損傷、降血糖、促消化、抗氧化以及提高免疫力等功效，因此卵磷脂被認為是排在蛋白質、維生素之后的“第三營養(yǎng)素”[4].

卵磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿及乙醇中，不溶于丙酮；但丙酮能夠溶解油脂和游離脂肪酸、甘油三酯等，因而可以利用乙醚、乙醇等有機溶劑進行提取[5].

蛋黃中卵磷脂提取與鑒定綜合設計實驗采用乙醇與乙醚的混合提取液為溶劑，利用丙酮沉淀卵磷脂，隨后對沉淀物進行干燥，便可獲得卵磷脂.卵磷脂中的膽堿在堿性溶液中可分解為三甲胺，具有特殊的魚腥味，可根據(jù)此性質鑒定卵磷脂[6].

一般來說，卵磷脂是由膽堿磷脂(PC，phosphatidylcholine)、膽胺磷脂(PE,phosphatidylethanolamine)、肌醇磷脂(PI，phosphatidylinositol)等混合而成的混合物；狹義上的卵磷脂是指膽堿磷脂，分子式C35H66NO7P，分子量為643.875，分子結構見圖1.

圖1 卵磷脂分子結構(膽堿磷脂)

2 實驗要求

該綜合設計實驗是《生物化學》課程的實驗內容之一.具體要求：第一，掌握正交試驗設計方法，學會制定實驗設計方案；第二，掌握卵磷脂的提取工藝及實驗操作；第三，學會應用統(tǒng)計學分析軟件及方法分析實驗結果.要求每一位同學認真查閱文獻資料，制定詳實的實驗方案，認真做好每次實驗的原始記錄，以便進行資料整理和分析.

3 實驗方法

3.1 試劑材料與設備

雞蛋、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、氫氧化鈉、植物油、紗布、濾紙、漏斗、燒杯、鐵架臺、玻璃棒、恒溫水浴鍋等，化學試劑均為分析純.

3.2 實驗方案

本實驗中的溫度、乙醇與乙醚混合物比例、抽提時間、物料比例等是影響卵磷脂提取率的重要因素，因此實驗中涉及4個因素，采用多因素試驗設計方法最合理，即正交試驗設計.用特制的正交表格來安排實驗，能夠通過少量實驗取得較好的效果.根據(jù)卵磷脂提取原理，將卵磷脂提取工藝流程設計為如圖2所示，按照此流程，蛋黃提取液被逐步純化，最終獲得較純的卵磷脂。根據(jù)要求用4因素3水平正交試驗設計(表1).

圖2 卵磷脂提取流程圖

表1 抽提物、溫度、時間和料液比

通過正交試驗設計只需做9次實驗，即可探索出最優(yōu)條件，見表2.

表2 試驗設計方案L9(34)

4 實驗方法

4.1 卵磷脂的提取

選取新鮮雞蛋1枚，輕輕在雞蛋小頭擊破一個小孔，讓蛋清從小孔中流出，取出蛋黃放置于燒杯中，攪碎備用.根據(jù)實驗設計邊攪拌邊加入相應量的乙醇和乙醚混合提取液，控制相應溫度，保溫時間按照表2進行.提取結束后過濾，將濾液蒸干，加入氯仿抽提一次，抽提液用丙酮沉淀，卵磷脂即被沉淀出來，得到粗卵磷脂.

4.2 卵磷脂的純化

取沉淀的粗卵磷脂，用少量無水乙醇溶解，得到乙醇粗提液，加入少量體積的20%的ZnCl2水溶液，充分攪拌；過濾，獲得濾液，加入適量丙酮(4 ℃冰箱預冷)洗滌，充分攪拌，丙酮洗滌2次，洗滌液為無色狀態(tài)，得到白色臘狀物質，即為精卵磷脂.

4.3 卵磷脂鑒定

1)三甲胺實驗，取制取的卵磷脂1份,放入試管中，加入10%NaOH溶液2 mL并在水浴上加熱，卵磷脂分解生成膽堿，膽堿在堿的作用下，生成三甲胺，三甲胺有魚腥昧.

2)乳化實驗，取2支試管，分別加入10 mL蒸餾水，一支加入卵磷脂，并使之均勻分散在水中，加入10滴植物油；另一支不加卵磷脂作為對照，劇烈搖動后靜置，比較試管內容物的乳化狀.

5 實驗結果

5.1 卵磷脂提取條件優(yōu)化

卵磷脂提取率是指蛋黃中提取出的粗卵磷脂占蛋黃總質量的比例，利用正交試驗設計，研究雞蛋黃中卵磷脂的提取率，結果表明乙醇與乙醚5∶1的混合物，60 ℃浸提30 min，卵磷脂提取率高，可達45.1%，結果見表3.

表3 不同條件下蛋黃卵磷脂的提取率 %

5.2 卵磷脂的鑒定

通過三甲胺實驗，說明卵磷脂在堿性環(huán)境中可水解為三甲胺，三甲胺有魚香味，可證明提取物為卵磷脂.卵磷脂的乳化實驗進一步證明卵磷脂的分子結構中具有親水結構和疏水結構，可做乳化劑.

6 綜合設計性實驗的實驗教學組織形式與效果

6.1 設計實驗方法，創(chuàng)新研究內容的教學組織方式

由于本實驗工作量大，內容涉及文獻檢索、實驗設計、統(tǒng)計分析、生物化學等多個學科，要求組織學生分組，3～5人一組，查閱文獻資料，學會利用正交試驗設計方法，優(yōu)化蛋黃中卵磷脂提取條件.

6.2 綜合設計性實驗的教學效果

通過以科學研究思維為導向，融合多門學科的綜合設計性實驗教學，將教學與科學研究有機結合，提高學生學習的興趣，培養(yǎng)學生科研的思維能力，為今后的研究生學歷教育奠定了基礎.總體上看學生積極性高，能夠自主完成實驗設計及實驗方案的制定任務，能夠調動學生自主學習性，充分發(fā)揮學生的創(chuàng)新性思維，極大提升了學生對科學研究的興趣.在實驗成績考核上，采用全過程考核方式，在規(guī)定的課時內完成整個實驗，文獻資源檢索占比20%，實驗設計及實驗方案占50%，實驗操作及實驗結果占30%，實驗考試貫穿整個實驗流程，要求學生之間通力合作，培養(yǎng)學生的團隊意識，實驗過程中必須精心配合，分工合作.教師在整個實驗過程中在實驗設計及實驗操作、結果分析等方面給予全程指導，及時更正，保證實驗的順利實施.

7 綜合設計性實驗教學的思考

綜合設計性實驗是有助于開發(fā)學生思維能力和創(chuàng)新能力的有效途徑，積極開設綜合設計性實驗有助于培養(yǎng)學生科研思維，提升學科興趣、鞏固專業(yè)思想，同時為學好本專業(yè)相關課程奠定基礎.但是綜合設計性實驗耗時長，涉及知識點多，需大量精力，另外實驗設計相對復雜，有一定難度，同時需要教師精心設計并有足夠耐心，才能取得相應效果，否則達不到預期目標.綜合設計性實驗是提升學生動手能力和科研思維的重要手段，積極開展綜合設計性實驗教學研究，提升學生創(chuàng)新能力，是應用型專業(yè)發(fā)展和培養(yǎng)技能型人才的需要.