邱 勰 雷鐵池 韓冰玉 姚云竹 廖志凱 胡雙海

武漢大學人民醫(yī)院皮膚性病科，湖北武漢，430060

皮膚老化一般被分為自然老化和光老化，通常具有皺紋形成、皮膚松弛、色素沉著等改變。目前臨床上已經(jīng)采用了如光子嫩膚、玻尿酸注射等方式來預防或延緩皮膚老化，但具有時效短、不良反應多等局限性[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人眶周皮膚注射自體培養(yǎng)FBs后，皮膚張力明顯改善[2]，這表明細胞注射治療在改善皮膚老化方面已經(jīng)表現(xiàn)出一定的價值。

最近，用單細胞RNA測序技術(single-cell RNA sequencing)發(fā)現(xiàn)人和鼠的真皮FBs存在異質性。位于真皮淺層的乳頭層成纖維細胞(papillary FB)和位于深層的網(wǎng)狀層成纖維細胞(reticular FB)在細胞表型和生物學功能上有較大差異[3,4]。網(wǎng)狀層FBs比乳頭層FBs分泌膠原蛋白的能力更強，而乳頭層FBs的增殖能力比網(wǎng)狀層FBs強[4]。隨著皮膚老化，乳頭層FBs逐漸消失。還發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的乳頭層FBs分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)的能力在老年人中明顯高于年輕人[4]。由于小鼠胚胎第18.5天(E18.5)[5]的真皮含乳頭層FBs高達81.8%[4]。我們的假說是自胎鼠(E18.5)皮膚分離培養(yǎng)FBs，經(jīng)CM-Dil熒光染料活細胞標記后皮下注射至光老化小鼠的皮膚，檢查同種異體小鼠FBs注射是否具有抗老化作用，旨在探索下一步用自體真皮成纖維細胞治療(autologous dermal fibroblast therapy)抵抗人皮膚衰老的可行性與機制。

1 材料與方法

1.1 材料收集 取BALB/c健康雄性小鼠20只(購自湖北省動物實驗中心)，隨機分為：未處理組5只、僅做照光處理的模型組5只、照光處理后注射PBS的空白組5只、照光后進行細胞治療的治療組5只，所有小鼠均用冰王脫毛膏脫去背部5 cm×6 cm面積的毛發(fā)。每個組的5只小鼠并于同一籠，飼養(yǎng)于25℃室溫中，予以相同的無菌食用水和飼料喂養(yǎng)，并維持12 h光照的晝夜節(jié)律。

1.2 紫外線照射構建老化模型 每日用0.6 J/cm2劑量的UVA和60 mJ/cm2劑量的UVB于模型組、空白組和治療組小鼠裸露皮膚區(qū)正上方30 cm處，每日混合照射1次，持續(xù)8周，以鼠背部出現(xiàn)皮膚粗糙增厚，皺褶顯著，色素明顯加深體征表示造模成功。

1.3 鼠FBs體外培養(yǎng)及CM-Dil熒光染料活FBs標記

1.3.1 胎鼠FBs體外培養(yǎng) 取胎鼠(E18.5)10只，活力碘中浸泡10 min，無菌剝離全層皮膚，在PBS中沖洗2～3次后將其剪成2 cm×4 mm皮片，與4℃條件下在0.25%Dispase酶中消化12 h后，機械分離表皮和真皮。將真皮剪碎，加入含有EDTA的胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱中消化15 min，用含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，1000 rpm離心5 min后棄上清。用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，在37℃、5% CO2條件接種于培養(yǎng)皿中，每隔兩日進行細胞換液。

1.3.2 FBs標記 參考Reichenberger等[6]的方法給FBs進行染色標記，取原代培養(yǎng)的FBs，在含有EDTA的胰蛋白酶中于37℃環(huán)境下消化5 min后用含10%FBS的等量培養(yǎng)基終止消化，1000 rpm離心5 min，棄上清，1 mL PBS重懸制成細胞懸液，以2 μM/mL的終濃度加入CM-Dil染料(thermo fisher，C7000)，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min，再于4℃環(huán)境下孵育15 min。孵育后1000 rpm離心5 min，棄上清，PBS洗滌2～3次，離心，棄上清，用培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后用熒光顯微鏡觀察細胞染色情況。

1.4 FBs注射處理

1.4.1 取已被CM-Dil熒光染料標記的約為5×105/mL密度的胎鼠FBs細胞懸液1 mL，用胰島素針抽取對小鼠進行皮內注射，均勻注射5個皮丘，每隔3日對小鼠進行環(huán)鉆取皮，并將取得的皮膚進行冰凍切片處理，于熒光顯微鏡下觀察FBs在小鼠體內的存活情況，確定FBs在小鼠體內最為活躍的日期。

1.4.2 治療組小鼠每隔5日用胰島素針抽取1 mL已被標記的密度為5×105/mL的胎鼠FBs,進行皮內注射,每只小鼠均勻注射5個點，每個點約1×105個細胞，空白組用同樣方法注射等量PBS處理，一共注射4次。

1.5 組織病理

1.5.1 切片處理 4次注射結束后將小鼠處死解剖，提取背部裸露皮膚，部分予以冰凍切片后觀察熒光顯色情況；部分用甲醛固定后石蠟包埋，切厚度約為4 μm的切片，進行HE、Masson染色。

1.5.2 HE染色 二甲苯將切片脫蠟，將已脫蠟的組織切片經(jīng)由高濃度酒精到低濃度，最后入蒸餾水后放入蘇木精溶液中5 min，在酸堿中分色數(shù)秒后流水沖洗1 h，再于70%和90%濃度的酒精中脫水10 min，最后用伊紅染色3 min。染色后經(jīng)純酒精脫水，再應用二甲苯使其透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠表皮及真皮厚度。

1.5.3 Masson染色 二甲苯將切片脫蠟，將已脫蠟的組織切片經(jīng)由高濃度酒精到低濃度，最后入蒸餾水后，用Weigert鐵蘇木素染色液染色5 min，酸性乙醇分化10 s后流水沖洗1 h，再于Masson藍化液中返藍5 min，水洗，在麗春紅品紅染色液中染色8 min后用磷鉬酸溶液洗滌2 min，放入苯胺藍染色液中染色1 min。染色后經(jīng)純酒精脫水，再應用二甲苯使其透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察對比各組小鼠真皮膠原形態(tài)。

1.5.4 皮膚新生膠原測定 精確稱取濕重約5 g的組織，研磨后3000 rpm離心10 min，取上清。參照試劑盒說明書(購自武漢潔洋盛公司)用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠皮膚樣本中I型前膠原羧基端肽(PICP)的表達水平。

2 結果

2.1 體外培養(yǎng)FBs的形態(tài)以及注射后不同時間體內示蹤FBs存活 FBs接種于培養(yǎng)皿12 h后可觀察到部分貼壁，接種6～7天后細胞增長至80%以上；倒置熒光顯微鏡顯示：2 μM/mL的終濃度下，CM-Dil染色的FBs細胞膜表達陽性，呈現(xiàn)明亮的紅色熒光(圖1)。

圖1 1a：倒置顯微鏡明場鏡頭下觀察的貼壁生長6～7日的胎鼠FBs(×100)；1b：同一視野下用2 μM/mL終濃度的CM-Dil標記的FBs的熒光染色圖像(×100)；1c：merge圖像；比例尺：100 μm

在小鼠皮內注射FBs后每隔3日環(huán)鉆取皮進行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察，可以見到第3日熒光強度最高，之后逐漸下降，到第9日幾乎見不到熒光(圖2)，因此選擇第3日處死各個實驗組小鼠進行下一步試驗。

圖2 熒光正置顯微鏡下觀察CM-Dil標記的FBs在小鼠皮內存活情況，左列為DAPI標記熒光，中間列為CM-Dil標記熒光，右列為merge圖像(×100)；比例尺：100 μm

2.2 胎鼠FBs對光老化小鼠皮膚的改善作用

2.2.1 大體圖對比 從大體圖對照可見模型組、空白組和治療組的小鼠背部裸露皮膚經(jīng)紫外光照射后出現(xiàn)較明顯皺紋、質地變厚、彈性減弱、干燥、色素沉著等改變，治療組小鼠的背部裸露皮膚在連續(xù)4次胎鼠FBs注射后，相較空白組以及模型組小鼠皮膚皺紋深度相對較淺，空白組對比模型組小鼠皮膚老化情況無明顯改善(圖3)。

圖3 注射治療前后各組小鼠背部皮膚情況，每次注射1 mL注射物，予以分點在脫毛區(qū)域注射，共5個點，每個點200 μL(治療組每個注射點約1×105個細胞)

2.2.2 熒光及免疫組化結果 用免疫熒光檢測法對各組小鼠的背部皮膚冰凍切片觀察結果可見，治療組的小鼠在4次注射后第3日可見背部明亮的紅色熒光，其他3組小鼠紅色熒光強度非常弱(圖4)。

圖4 熒光顯微鏡下觀察注射處理后各組小鼠背部皮膚冰凍切片，A：未處理組，B：模型組，C：空白組，D：治療組，最左列為DAPI染色結果，中間列為CM-Dil染色結果，最右列為merge圖像(×100)；比例尺：100 μm

HE染色結果提示，小鼠照光后表皮厚度明顯增加(P<0.05)，空白組和模型組小鼠的真皮厚度相比未處理組小鼠明顯變薄(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；經(jīng)FBs治療后，小鼠皮膚的真皮厚度明顯增厚，P<0.05，具有統(tǒng)計學意義(圖5)，但表皮厚度變化相比空白組變化不明顯(表1)。

圖5 5a～5d：分別為未處理組、模型組、空白組和治療組。小鼠經(jīng)照光后表皮均明顯增厚(HE，×100)

表1 胎鼠FBs皮內注射對光老化小鼠表皮及真皮厚度的影響

Masson染色見模型組和空白組小鼠對比正常組膠原纖維斷裂，明顯紊亂，第4次注射FBs3日后，治療組小鼠光損傷區(qū)域真皮層內變性、斷裂的膠原纖維明顯減少，并可見少量新生膠原(圖6)。

圖6 6a～6d：分別為未處理組、模型組、空白組和治療組，可見模型組和空白組小鼠相對未處理組小鼠真皮層的膠原纖維明顯疏松紊亂，注射FBs后斷裂紊亂的膠原纖維明顯減少(Masson染色，×100)

2.3 ELISA結果 FBs注射4次后，治療組小鼠皮膚新生膠原濃度相比空白組和模型組明顯增多，對比未處理組含量較低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。空白組小鼠和模型組小鼠PICP濃度無明顯差異(P>0.05)，且兩組PICP濃度相對未處理組小鼠均降低，(P<0.05)。見表2。

表2 胎鼠FBs皮內注射對光老化小鼠真皮PICP表達水平的影響

3 討論

長時間以來，人們一直認為FBs只不過是一群均一的負責產生膠原和彈性纖維蛋白以及細胞外基質的間充質細胞。近年來的研究發(fā)現(xiàn)真皮至少存在有兩個FBs亞群，即乳頭層FBs和網(wǎng)狀層FBs，乳頭層FBs有更高的細胞增殖和分化能力，并能調節(jié)毛囊等附屬器再生[8，9]，隨著年齡增長，乳頭層FBs表達減少[10]，老化皮膚的乳頭層FBs增加了基質金屬蛋白酶的表達[4]，導致乳頭層的膠原大量斷裂并排列紊亂，皮膚色素沉著，深層皺紋增加[11]。相反，網(wǎng)狀層FBs數(shù)目增加，并能合成大量纖維狀膠原蛋白(與疤痕FBs的類似)增加了皮膚僵硬度(stiffness)。最近有人提出用真皮的不同區(qū)域成纖維細胞(zonal dermal fibroblast)進行皮內填充注射，可獲得較好的抗皮膚衰老的效果[2]。由于人類臨床試驗的倫理限制，我們選擇了E18.5的胎鼠皮膚分離培養(yǎng)FBs，此時真皮含乳頭層FBs細胞高達81.8%[4]，觀察注射胎鼠真皮FBs對老化小鼠皮膚的改善作用。

我們用紫外線(UVA聯(lián)合UVB)照射建立小鼠皮膚老化模型，觀察到老化小鼠背部皮膚相對于對照組出現(xiàn)皮膚皺紋、色素沉著、皮膚松弛等現(xiàn)象。皮內注射后CM-Dil熒光染料標記活FBs示蹤試驗顯示，注射后第3天細胞存活最高，之后逐漸下降，到第9日幾乎見不到熒光標記細胞。我們在此基礎上進行實驗，發(fā)現(xiàn)胎鼠FBs注射4次后從大體照片上能夠觀察到相對于模型組以及空白組小鼠背部皮膚皺紋明顯變淺、炎癥反應也相對較輕；HE和Masson染色可見真皮厚度明顯增厚(P<0.05)，膠原纖維的排列也更為緊密有序；I型膠原是真皮中維持皮膚張力和承受拉力的重要成分，在老化小鼠皮膚中，I型膠原明顯減少，且形態(tài)表現(xiàn)粗細不等，分布不均[12]。而酶聯(lián)免疫吸附試驗的結果也進一步證實了胎鼠FBs的皮內注射有助于I型膠原的產生，從而改善皮膚老化。

本研究我們初步證實了胎鼠FBs對紫外線誘導的小鼠皮膚老化有改善作用，而胎鼠FBs中有較高比例的乳頭層FBs，皮內注射胎鼠FBs可促進I型膠原蛋白的從頭合成，改善了皮膚老化。是否人自體真皮乳頭層FBs注射能成為抗皮膚衰老的新治療手段仍待臨床進一步證實。