范明智， 李學峰， 吳曉晗， 劉懿萱， 李美蘭， 廉美蘭*

(1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002;2.延邊農(nóng)業(yè)科學院，吉林 龍井 133400)

東北刺人參 (OplopanaxselatusNakai)，是一種多刺的落葉灌木，在中國、俄羅斯和韓國等國用于治療多種疾病，醫(yī)藥市場需求量巨大[1]，因此其作為藥材被大量采伐，野生資源受到了嚴重破壞，目前已被《中國物種紅色名錄》定為瀕危種、國家二級重點保護植物[2]。目前東北刺人參的栽培體系尚未建立，致使其產(chǎn)品開發(fā)以及活性的深入研究受到了極大限制[3]。因此，許多學者利用植物組織培養(yǎng)技術對東北刺人參進行培養(yǎng)，來獲取大量植物材料[4-6]，其中有研究表明，生物反應器分批補料培養(yǎng)模式可以增加東北刺人參不定根產(chǎn)量以及次生代謝產(chǎn)物的含量，可作為傳統(tǒng)植物資源的替代材料[7]。

食源性疾病是影響食品安全的重要因素，而細菌污染往往是食源性疾病產(chǎn)生的主要原因[8-9]，世界衛(wèi)生組織在2015年底對全球食源性疾病進行了首次評估，數(shù)據(jù)顯示平均每年有大約1/10的人因食用被污染的食物而生病，且有42萬人因此而死亡[10]。肉蛋類產(chǎn)品作為食品中一個重要類別，其本身就存在著嚴重的細菌污染問題，且在加工過程中極易出現(xiàn)生熟不均的情況，在這種情況下食用這類食物，輕者會出現(xiàn)腹痛腹瀉等癥狀，嚴重者會引發(fā)食物中毒甚至死亡[11]。單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和豬霍亂沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)是食源性疾病中死亡的主要原因之一[12]。其中，豬霍亂沙門氏菌具有極其廣泛的動物宿主，是污染肉蛋類食物最常見菌株，經(jīng)常引發(fā)食源性疾病的爆發(fā)[13-14]，與豬霍亂沙門氏菌引起的疾病相比，由單增李斯特菌引起的疾病雖發(fā)病率很低，但死亡人數(shù)卻很高。在家禽加工廠和零售產(chǎn)品中普遍存在單增李斯特菌[15]，而且這種微生物可以在低溫的環(huán)境中存活下來，因此，極難清除[16]。據(jù)2020年上海地區(qū)的一項污染監(jiān)測分析表明，上海地區(qū)市售生鮮肉中存在較高的單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的污染率，極易引發(fā)食源性疾病[17]。因此該試驗以東北刺人參不定根為試驗材料，旨在探明其對單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的抑菌活性，并探明抑菌機制，為東北刺人參不定根相關產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與粗提物

參照吳曉晗等的方法[18]培養(yǎng)東北刺人參不定根，取20 g增殖培養(yǎng)的東北刺人參不定根，切至1 cm左右大小，接種至5 L氣升式生物反應器中后，加入3 L培養(yǎng)液(1/2MS+IBA 3 mg/L+白糖40 g/L，pH值5.8)，通氣量設置為225 mL/min，培養(yǎng)20 d后，加入1 L補充培養(yǎng)基(1MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L，pH值5.8)，將通氣量調(diào)至300 mL/min，再培養(yǎng)20 d后收獲，用清水沖洗后在45 ℃下烘干，得東北刺人參不定根干品作為試驗材料。稱取5 g不定根干品于500 mL錐形瓶中，加入250 mL乙醇，30 ℃溫度下超聲2次后合并濾液，濾液減壓濃縮得東北刺人參不定根粗提物(OCE)，用于抑菌研究。

1.2 試驗菌種

單增李斯特菌、豬霍亂沙門氏菌2種菌種購自上海魯微科技有限公司。單增李斯特菌應用胰蛋白胨大豆酵母浸膏培養(yǎng)基培養(yǎng)，豬霍亂沙門氏菌應用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 最低抑菌濃度(MIC)的確定

利用2, 3, 5氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定OCE的MIC。將100 μL濃度為107CFU/mL的菌液加入96孔板中，再加入100 μL不同濃度的OCE，使粗提物的最終濃度分別達到8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL，以培養(yǎng)液作為對照，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入20 μL 0.2%TTC(北京索萊寶科技有限公司)溶液，避光培養(yǎng)4 h后，觀察顏色確定MIC，每個處理均設置3次重復。

1.3.2 電導率測定

參照高原的方法[19]對菌液電導率(EC)進行測定。15 mL離心管中加入5 mL 108CFU/mL的菌液，在5 000 r/min條件下離心5min，去上清后加入5 mL的PBS和5 mL OCE，混合均勻，使離心管中的OCE濃度達到MIC，對照加5 mL的PBS和5 mL無菌水。離心管在氣浴恒溫振蕩器(SHZ-82，常州金壇良友儀器有限公司)中以120 r/min溫育，每隔0.5 h用電導率儀(DDSJ-308A，雷磁)測定菌液中的EC值。

1.3.3 核酸泄露

利用分光光度法對菌細胞核酸泄露量進行測定。取108CFU/mL的菌液5 mL，在5 000 r/min條件下離心5 min，離心后的菌液去上清，加入1 mL PBS打散后加至含50 mL培養(yǎng)液的三角瓶中，再加入OCE調(diào)節(jié)濃度至MIC，加同等體積的無菌水作為對照，三角瓶于氣浴恒溫振蕩器中以120 r/min溫育，每隔0.5 h取樣1次，離心取上清于260 nm處測定吸光度，來判斷核酸泄露情況。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定

菌液中蛋白質(zhì)含量利用蛋白定量試劑盒(南京建成科技有限公司，中國)進行測定，將1×108CFU/mL的菌液5 mL在5 000 r/min條件下離心5 min，離心后的菌液去上清，加入1 mL PBS打散后加至含100 mL培養(yǎng)液的三角瓶中，加入OCE調(diào)節(jié)濃度至MIC，加同等體積的無菌水作為對照，三角瓶于氣浴恒溫振蕩器中以120 r/min溫育，在0和4 h分別取樣，5 000 r/min下離心5 min后，按照試劑盒操作(表1)。反應10 min后于595 nm下測定吸光度，并按照試劑盒說明計算并分析蛋白質(zhì)泄露情況。

表1 蛋白酶試劑盒操作表

1.3.5 堿性磷酸酶(AKP)活性測定

使用AKP酶試劑盒(南京建成科技有限公司)對菌液中AKP酶活性進行測定，2瓶含有50 mL培養(yǎng)液的三角瓶中分別加入1 mL 1×108CFU/mL的菌液，加入OCE并調(diào)節(jié)濃度至MIC，對照加等量的無菌水?；旌衔镉跉庠『銣卣袷幤髦幸?20 r/min溫育，在0和4 h分別取樣，5 000 r/min下離心8 min后，吸取上清液按照AKP試劑盒操作(表2)，反應10 min后，測定520 nm處的吸光度，并按照試劑盒說明計算并分析菌液中AKP酶活性。

表2 堿性磷酸酶酶試劑盒操作表

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.3.0 (GraphPad Software, Inc., SanDiego, CA)進行方差分析和t檢驗，顯著性為P< 0.05，所有試驗均采用3次重復。

2 結果與分析

2.1 OCE的抑菌活性

OCE的抑菌活性通過TTC法進行測定。TTC與活菌接觸后會呈紅色，因此，可以通過TTC與菌液接觸產(chǎn)生的顏色變化來判斷菌液中的細菌活性，根據(jù)TTC的顯色結果可以看出，隨著OCE濃度的升高，混合液的顏色逐漸變淺，當OCE濃度為4和8 mg/mL時，單增李斯特菌以及豬霍亂沙門氏菌96孔板中混合液變得澄清，紅色沉淀完全消失(圖1)，證明4和8 mg/mL分別為單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的MIC，表明OCE對單增李斯特菌的抑菌效果略優(yōu)于豬霍亂沙門氏菌。

2.2 OCE對菌細胞滲透性的影響

2.2.1 OCE對EC的影響

當細胞膜的滲透性受到破壞時，菌細胞中的內(nèi)溶物質(zhì)會發(fā)生泄露，導致菌液中的EC值發(fā)生變化，因此可以通過菌液的EC來反映出菌細胞膜滲透性受損程度(圖2)，OCE處理菌液后，測得單增李斯特菌菌液中的EC值在2 h前出現(xiàn)明顯的上升趨勢，2 h后趨于穩(wěn)定，而對照組的EC值始終保持穩(wěn)定(圖2A)，豬霍亂沙門氏菌菌液中EC值與單增李斯特菌具有相似的變化趨勢，在前3 h內(nèi)，菌液中的EC值持續(xù)上升，而后趨于穩(wěn)定，對照組保持穩(wěn)定狀態(tài)(圖2B)。證明經(jīng)OCE處理后，使得菌細胞中的內(nèi)溶物泄露，導致EC值升高。

2.2.2 OCE對核酸泄露的影響

在正常的活細胞中，核酸通常只存在于細胞膜的內(nèi)部，只有當細胞膜受到損傷時，在菌液中才會檢測到大量核酸，OD260值常用來評價核酸的泄露水平，可以作為判斷細胞滲透性變化的指標之一。經(jīng)OCE處理4 h后，單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌菌液中的OD260均顯著提高，而對照組菌液中的OD260值基本保持不變(圖3)。表明OCE處理后菌細胞膜完整性受到破壞，導致核酸泄露。

2.2.3 OCE對蛋白質(zhì)泄露的影響

蛋白質(zhì)是組成細胞和組織的重要成分，胞外蛋白質(zhì)的含量也是衡量細胞膜滲透性的重要指標之一。蛋白含量試劑盒的原理是利用考馬斯亮藍的顯色反應來評價蛋白質(zhì)含量的變化，按試劑盒操作的結果表明，經(jīng)OCE處理4 h之后，單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌菌液中的蛋白質(zhì)含量均顯著提高，分別達到處理前的2.88倍和2.82倍，而對照組無明顯變化(圖4)。表明OCE破壞了菌細胞膜的滲透性，使得蛋白質(zhì)大量泄漏，起到了抑菌的效果。

2.2.4 OCE對AKP酶活性的影響

AKP酶是參與細胞膜上能量代謝的一種關鍵酶，在正常的細胞中，往往在胞外無法檢測到，只有當菌細胞壁遭到破壞時，才會泄露到菌液中。AKP酶試劑盒測定的結果表明，在經(jīng)OCE處理前，只檢測到菌液中很低的AKP酶活性，而經(jīng)OCE處理4 h之后，2種測試菌種菌液中的AKP酶活性均極顯著提高，對照組基本保持恒定(圖5)。表明OCE對單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的細胞壁均造成了不同程度的破壞。

3 討論與結論

人類在漫長的生活史中與致病菌的抗爭從未停止，致病菌及其傳播方式的多樣性使得細菌感染類疾病非常多樣并且極難根除，其中，單增李斯特菌和沙門氏菌則是食源性致病菌中的典型代表[20]。20世紀抗生素的發(fā)明成為了人類對抗致病菌的“秘密武器”，但是隨著抗生素的過度使用，導致耐藥細菌瘋狂涌現(xiàn)，并且耐藥水平不斷增加，抗生素已然走下“神壇”[21]。目前，許多研究人員都致力于從藥用植物中提取抗菌物質(zhì)，來替代抗生素[22]。目前有許多研究表明，植物提取物具有較好的抑菌活性，如蒲公英[22]、桑黃[23]、金銀花[24]等，其中Jin等[25]研究發(fā)現(xiàn)，東北刺人參不定根粗提物對大腸桿菌具有較好的抑菌效果，但是對于單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的抑菌效果還未研究。這些植物具有良好的抑菌活性，得益于其含有豐富的活性物質(zhì)，如黃酮、多糖、皂苷等。傅建等[26]研究發(fā)現(xiàn)，血人參總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均具有較好的抑菌效果；韓璐[27]發(fā)現(xiàn)，狼爪瓦松愈傷組織的多糖純化物對綠膿桿菌以及枯草芽孢桿菌具有抑制作用；雷發(fā)玲等[28]研究發(fā)現(xiàn)，無患子皂苷對單增李斯特菌等8種菌均具有抑制作用。而東北刺人參的粗提物中含有大量的黃酮及多糖，具體是那種物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用還有待于進一步證明。

植物活性成分的抑菌機制往往表現(xiàn)為破壞細菌的細胞壁以及細胞膜結構，使胞內(nèi)大分子的含量變化等，進而影響細菌的正常生理功能[29]。有研究表明夾江石斛水粗提物通過破壞菌細胞壁以及細胞膜通透性，從而達到對金黃色葡萄球菌的抑制作用[30]。芳樟醇可以使大腸桿菌細胞膜通透性增大，進而使細胞內(nèi)容物外泄，導致細胞功能異常和死亡[31]。而該試驗的結果表明，東北刺人參不定根粗提物對單增李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的MIC分別為4和8 mg/mL，具有較好的抑菌效果。并且經(jīng)不定根粗提物處理后菌液中EC、OD260、蛋白質(zhì)含量以及AKP酶活性均具有明顯的上升趨勢，可以推測東北刺人參不定根粗提物的抑菌機制可能是通過破壞細菌的細胞膜，改變菌膜的滲透性來起到抑菌的作用。因此，東北刺人參不定根粗提物可以用于開發(fā)抑菌產(chǎn)品，應用于食源性疾病的預防和治療。