黃婉秋, 石冬冬, 蔡紅英,2, 于大力, 孟昆, 楊培龍,2*

(1.中國農業(yè)科學院飼料研究所， 農業(yè)農村部飼料生物技術重點實驗室， 北京 100081;2.生物飼料開發(fā)國家工程研究中心， 北京 100081)

木質纖維素是生物量的主要組分，主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。木質纖維素降解以后能夠生成還原糖，這些還原糖再進一步發(fā)酵能夠生成乙醇、丁醇等有機燃料。充分利用木質纖維素為再生清潔能源提供了一個優(yōu)化的途徑。纖維素的生物降解是一系列酶聯合作用的結果，主要有外切-β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase，CBHs，EC 3.2.1.91)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG，EC 3.2.1.21)和內切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EG，EC 3.2.1.4)。在自然界中，許多昆蟲具有完整、復雜的木質纖維素消化降解系統(tǒng)，被看作是高效的生物能源轉化器，有著很大的應用價值。這些昆蟲之所以能消化和利用大量的木質纖維素，是因為其消化系統(tǒng)及其微生物存在各類木質纖維素酶以及非催化性蛋白，在腸道特定的理化環(huán)境條件下，促使其能夠高效降解和轉化纖維素、半纖維素、甚至木質素這類高聚合度的大分子結構[1]。

白星花金龜(Protaetiabrevitarsis)屬于鞘翅目(Coleoptera)、花金龜科(Cetoniidae)，是一種全國性分布的農業(yè)害蟲，其幼蟲為腐食性，以植物根部、雜草等為食。但有研究者基于白星花金龜幼蟲的腐食性模擬自然界秸稈等的腐爛狀況，發(fā)現白星花金龜幼蟲能夠有效的降解玉米秸稈、小麥秸稈和花生殼；且在其腸道中發(fā)現了豐富的與纖維素降解相關的微生物[2-3]。田小燕等[4]利用宏基因組測序分析了白星花金龜幼蟲腸道細菌的多樣性，通過細菌群落功能挖掘，發(fā)現其后腸含有豐富的纖維素降解酶。

本研究以富含纖維素的菌糠系統(tǒng)飼喂白星花金龜幼蟲，從其中、后腸中篩選出能夠特異、高效降解纖維素的菌株，并對高效菌株進行基因組分析，確定與纖維素降解相關的基因，推測其降解酶及協同方式，也為篩選優(yōu)質酶、構建纖維素降解工程菌提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試昆蟲 白星花金龜由中國農業(yè)科學院河北廊坊基地提供，取1齡幼蟲50只，分裝于33 cm×23 cm×20 cm大小的避光箱中，用菌糠飼喂，溫度控制在28 ℃左右，每隔3 d清理一次箱中蟲糞，將幼蟲喂養(yǎng)至3齡，解剖取其中、后腸道。

1.1.2主要試劑和儀器 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，北京博奧拓達科技有限公司；木聚糖，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；剛果紅，國藥集團化學試劑有限公司。

SHTI150C智能型恒溫恒濕箱，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司；IS-RDS3疊加式恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；CT15RE離心機，日本日立有限公司；T100 PCR儀，美國伯樂公司；1530-00636酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司BSC-1600 ⅡA2生物安全柜，江蘇蘇凈集團有限公司；MS-01H磁力攪拌器，美國精騏有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基 菌糠：棉籽殼60%、玉米芯25%、麥麩12%、石灰2%、石膏1%。

腸原液篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 5 g、酵母膏0.5 g、剛果紅0.05 g、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5 g、MnSO4·5H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、ZnSO4·7H2O 0.01 g、CuSO4·5H2O 0.01 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.1 g、K2HPO40.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g、明膠2 g、剛果紅0.05 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、K2HPO40.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7。

木聚糖培養(yǎng)基：木聚糖5 g、明膠2 g、剛果紅0.05 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、K2HPO40.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7。

濾紙條培養(yǎng)基：牛肉膏1.5 g、蛋白胨1.0 g、CaCO32.0 g、Whatman No.1濾紙條1 cm×6 cm、蒸餾水1 000 mL。

產酶培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、(NH4)2SO44 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、牛肉膏5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7。

1.2 樣品處理和菌株篩選

1.2.1樣品處理 取菌糠喂養(yǎng)的3齡幼蟲7只，禁食2 d后用無菌水沖洗干凈蟲體表面，再用75%酒精浸泡蟲體3 min，最后用無菌水沖洗浸泡。在無菌條件下，將蟲體表面剪開，取出完整中、后腸道，將7只幼蟲的腸道混合在一起，研磨勻漿，用0.9%生理鹽水進行稀釋，一共設置9個稀釋梯度10-1～10-9，選取每個梯度的稀釋液各100 μL涂布于腸原液篩選培養(yǎng)基上，每個梯度重復三次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)。

1.2.2羧甲基纖維素鈉瓊脂平板篩選 挑取在腸原液培養(yǎng)基上生長的單菌株至LB培養(yǎng)基上劃線分離，再將純化的菌株分別接種至羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和木聚糖培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)3 d。觀察菌株生長情況，記錄水解圈大小與菌落直徑。

1.2.3濾紙降解實驗 將水解圈較大的純菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數期后按照3%接種量轉接至濾紙條培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫搖床，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，同時設置不加菌液的濾紙條培養(yǎng)基作為對照組，每個處理3個重復。觀察濾紙降解情況，篩選出優(yōu)勢菌株。

1.3 菌種分類分析

提取每株細菌菌株的基因組DNA為模板，選用細菌16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增，PCR反應體系(50 μL)：2×Pfu DNA polymerase 25 μL，正反向引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR產物經諾唯贊FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit膠回收試劑盒回收后送北京博邁德基因工程技術有限公司測序。測序結果通過NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLASTn比對分析。以篩選出的優(yōu)勢菌株16S rRNA基因序列及比對結果中相似度較高的16S rRNA基因序列為材料，使用Mega 6.0生物信息學軟件構建系統(tǒng)進化樹，確定菌株所屬類別。

1.4 CMC酶活測定

將菌株接種至產酶培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫搖床180 r·min-1培養(yǎng)。取不同時期菌液離心后的上清，使用二硝基水楊酸(DNS)法測定酶活，反應體系為100 μL酶液，900 μL 1%(質量體積百分比)的CMC-Na底物。底物在反應溫度預熱3 min后，加入酶液反應10 min，然后加入1.5 mL DNS終止反應，沸水煮5 min，置于冰上冷卻，用酶標儀在540 nm波長下測定OD值。同時設置一組對照，在加入酶液前先加入1.5 mL DNS終止反應。酶活定義：每分鐘分解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量，用U·mL-1表示。

1.5 全基因組測序和分析

將h9菌株送至金唯智生物科技有限公司進行denovo全基因組測序分析?；诮M裝結果進行編碼基因預測及rRNA、tRNA、其他ncRNA的預測，然后對預測出的基因進行COG、CAZy等數據庫的功能注釋分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

解剖獲得的昆蟲腸道樣品在腸原液篩選培養(yǎng)基上進行腸道菌分離，根據剛果紅染色降解圈的大小來判斷菌株對纖維素的降解能力。結果表明，從腸原液培養(yǎng)基中初步篩選分離出90株能夠產生水解圈的菌株，分別屬于假單胞菌、芽孢桿菌、纖維單胞菌等屬。結合濾紙條降解結果篩選到5株降解菌(表1和圖1)，菌株h15可對纖維素和木聚糖產生較大的水解圈；菌株h3和H4可對纖維素和木聚糖產生水解圈，同時也有一定的濾紙降解能力，它們在第14 d時可呈現濾紙膨脹、邊緣略有降解的狀態(tài)。菌株h9無木聚糖水解圈，但其纖維素水解圈及濾紙降解的綜合效果最好，且菌株h9對濾紙條的降解隨時間逐漸加強，在第7 d時可將濾紙徹底崩解成糊狀。

表1 降解菌篩選結果Table 1 Selection result of strain

2.2 菌株分類分析

綜合水解圈和濾紙降解試驗，發(fā)現菌株h9的纖維降解效果最好，因此，對其進行了深入分析。將菌株h9的16S rRNA基因序列在NCBI上使用BLASTn序列比對分析，選取結果中相似度最高的菌屬作為材料，利用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2可知，菌株h9的16S rRNA基因序列與纖維單胞菌屬(Cellulomonas)的多個菌株具有較高的同源性，序列一致性超過98.9%。其中，與登錄號為NR 114320.1的波斯纖維單胞菌CellulomonaspersicaJCM18111序列相似度為99.86%，序列比對覆蓋率達100%，因此，將菌株h9命名為Cellulomonassp. h9。

圖2 基于16S rRNA序列同源性的h9菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of h9 strain based on 16S rRNA sequence homology

2.3 Cellulomonas sp. h9菌株的生長與產酶特性

2.3.1h9生長曲線 菌株h9在產酶培養(yǎng)基中的菌體密度變化趨勢如圖3所示，在28 ℃、培養(yǎng)基pH 7條件下，培養(yǎng)24 h后進入快速生長期，培養(yǎng)至96 h時，菌體生長達到平臺穩(wěn)定期。

圖3 菌株h9在產酶培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain h9 in enzyme production medium

2.3.2菌株h9酶活性的變化 在以CMC-Na為碳源培養(yǎng)的過程中，菌株h9的CMC酶活變化如圖4所示?？梢钥闯?，培養(yǎng)基初始階段酶活較低，在120 h左右時，CMC酶活達到最大值0.19 U·mL-1，且pH 7條件下的酶活高于pH 4，50 ℃條件下的酶活高于30 ℃。推測菌株h9產酶為中性纖維素或堿性纖維素酶。

圖4 菌株h9的CMC酶活性Fig.4 CMC enzyme activity of strain h9

2.4 全基因組測序及基因注釋

為了解菌株h9的纖維素降解相關基因，對菌株的基因組denovo進行了測序，組裝后得到該菌株的基因組，全長3 784 732 bp，GC含量較高，為73.53%，基因組共包含3 433個基因，其中編碼基因3 352個(97.64%)，非編碼RNA 81個(13個rRNA、45個tRNA、23個其他ncRNA)。

通過COG數據庫(cluster of orthologous groups of proteins)比對，將編碼基因進行功能分類，如圖5所示，注釋到的蛋白分布于22個COG的條目中，維持生命基本功能的相關基因在功能基因中占比較大。一共注釋到2 590個功能基因，其中轉錄相關基因有247個(9.54%)，碳水化合物運輸和代謝(G)功能的基因有238個(9.19%)，次生代謝產物生物合成、運輸和分解代謝(Q)功能的基因共有128個(4.94%)，細胞內物質轉運、分泌和膜泡運輸(U)功能的基因有42個(1.62%)，氨基酸轉運與代謝的基因212個(8.19%)。

2.5 纖維降解相關基因分析

根據CAZy(carbohydrate-active enZYmes database)數據庫分析，首先注釋了糖脂代謝相關的基因，包括糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GHs)161個(26.44%),糖基轉移酶(glycosyl transferases，GTs)195個(32.02%),多糖裂合酶(polysaccharide lyases，PLs)4個(0.66%)，糖脂酶(carbohydrate esterases，CEs)32個(5.25%)，輔助功能的酶(auxiliary activities，AAs)13個(2.13%)等(圖6)。

注：A—RNA轉錄和加工；B—染色質結構和動力學；C—能源生產和轉換；D—細胞周期控制、細胞分離、染色體分區(qū)；E—氨基酸運輸和代謝；F—核苷酸運輸和代謝；G—碳水化合物運輸和代謝；I—脂質運輸和代謝；J—翻譯、核糖體結構和合成；K—轉錄；L—復制、重組和修復；M—細胞壁/膜/外膜合成；N—細胞運動；O—轉譯后修飾、蛋白質周轉、分子伴侶；P—無機離子運輸和代謝；Q—次級代謝產物的合成、運輸和分解代謝；R—通用功能預測；S—未知功能；T—信號轉導機制；U—胞內運輸、分析和膜泡運輸；V—防御機制。Note: A—RNA processing and modification; B—Chromatin structure and dynamics; C—Energy production and conversion; D—Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E—Amino acid transport metabolism; F—Nucleotide transport and metabolism; G—Carbodydrate transport and metabolism; H—Coenzyme transpore metabolism; I—Lipid transport metabolism; J—Translation, ribosomal structure and biogenesis; K—Transcription; L—Replication, modification, protein turnover, chaperones; P—Inorganic ion transport and metabolism; Q—Secondary metabolites, biosynthesis, transport and catabolism; R—General function prediction only; S—Function unknown; T—Signal transduction mechanisms; U—Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V—Defense mechanisms.圖5 菌株h9基因組COG功能分類Fig.5 COG functional classification of strain h9 genome

其次，重點進行了纖維降解相關基因的注釋分析，從中分析預測出內切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)的相關基因有6個，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的相關基因有12個，外切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)的相關基因有2個(表2)。

表2 菌株h9中纖維素酶基因Table 2 Cellulase genes in strain h9 genome

3 討論

本研究利用羧甲基纖維素鈉和濾紙條培養(yǎng)基同時從白金花金龜幼蟲腸道中篩選纖維素降解菌，結果發(fā)現,兩種分離方法有很大區(qū)別，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上剛果紅水解圈較大的菌株對濾紙的降解效果并不理想，這很可能是多種原因造成的。一方面，溫度、平板厚度、初始pH、接種量等都對水解圈的大小有影響[5]，包衎等[6]也發(fā)現,液體樣品中酶的濃度與形成的水解圈直徑，并不總是呈直接關系，還可能受其他因素影響。另一方面，剛果紅固體平板培養(yǎng)的條件與濾紙條的液體培養(yǎng)基條件不同。羧甲基纖維素鈉屬于可溶性底物，通常用來測定內切葡聚糖酶的活性，內切葡聚糖酶隨機作用于分子內的糖苷鍵，形成纖維素短鏈，其還原糖生成的速率不高；濾紙條培養(yǎng)基中的濾紙屬于非可溶性底物，是一種由長纖維棉紙漿制成的通用模式底物，纖維素酶使纖維素的無定形區(qū)與結晶區(qū)發(fā)生水解，通常用來測定纖維素酶的總活力。多項研究表明，不同底物或者不同測定方法得到的纖維素水解活力結果存在一定的差別，其結果無法相互比較，纖維素酶對可溶性底物與不可溶性底物的活力并不具有明顯的相關性[7-8]。此外，內切和外切酶在體系中的比例、反應過程中底物與酶的濃度、反應的時間等條件都對降解結果有很大影響[9]。因此，在篩選菌株的過程中，并不能以水解圈大小或者濾紙的降解效果來作為判斷菌株產纖維素酶活力大小的唯一指標。綜合利用水解圈實驗和濾紙降解實驗，可以篩選出降解效果較好的菌株。

注：GT—糖基轉移酶；CBM—碳水化合物結合模塊；PL—多糖裂合酶；CE—糖脂酶；GH—糖苷水解酶；AA—輔助功能酶。Note: GT—Glycosyl transferases; CBM—Carbohydrate-binding modules; PL—Polysaccharide lyases; CE—Carbohydrate esterases; GH—Glycoside hydrolases; AA—Auxiliary activities.圖6 菌株h9 CAZy family分布Fig.6 CAZy family distribution of strain h9 genome

多項研究從昆蟲體內篩選得到產纖維素酶的細菌，Handique 等[10]從甲蟲(Lepidiotamansueta)的幼蟲腸道發(fā)現了5株具有纖維素降解活性的檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)；陳俊梅等[11]從蠼螋(Earwigfurficulidae)腸道中篩選得到一株具有堿性內切葡聚糖酶活性的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus) Q5；寧娜[12]從黃翅大白蟻(Macrotermesbarneyi)腸道中得到一株具有漆酶活性的高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis) CMC2；傅慧靜[13]從松墨天牛(MonnochamusalternatusHope)腸道中得到一菌具有木質素過氧化物酶活性的粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)；Briones-Roblero等[14]從嗜根線蟲(D.rhizophagus)腸道中得到了具有內切葡聚糖酶活性的節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)和具有木聚糖酶活性的假單胞菌(P.azotoformans)；Adriana等[15]從草地貪夜蛾(S.frugiperdalarvae)腸道中篩選得到具有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性的堅硬芽孢桿菌(Bacillusfirmus) NCIMB 9366(T)，這些昆蟲來源的纖維素降解細菌大多能夠產內切葡聚糖酶，少部分菌株產木質素降解相關的漆酶、過氧化物酶，體現出昆蟲腸道是一個蘊藏著纖維素降解菌的寶庫，對纖維素降解菌的篩選有著很大的潛力。本研究從白星花金龜幼蟲中、后腸篩選出90株能夠產生水解圈的菌株。其中，分離得到的Cellulomonassp. h9菌株CMC酶活為0.19 U·mL-1，高于許婧[16]從暗黑鰓金龜腸道篩選的Cellulosimicrobiumsp. HP18和Alcaligenaceaesp. HP14菌株CMC酶活。

纖維單胞菌是一類重要的纖維降解菌，其產酶特性得到了多項研究的確認。例如，侯晶[17]從Cellulomonasbogoriensis基因組中擴增得到三個糖苷水解酶基因；Anthony等[18]從CellulomonasbiazoteaATCC 486菌株中獲得了5個β-葡萄糖苷酶基因；Elberson等[19]從土壤中分離得到Cellulomonaspersica，發(fā)現其能夠降解纖維素，但目前尚未見對其纖維素酶基因的研究。研究發(fā)現，Cellulomonasflavigena能夠產生木聚糖酶、β-木糖苷酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等多種酶類[20-21]。這說明了在纖維單胞菌中，蘊含著相當豐富的與纖維素降解相關的酶基因資源。本研究中，菌株Cellulomonassp. h9基因組預測了12個β-葡萄糖苷酶基因，且有3個(4-211、4-263、4-381)已經得到初步的功能驗證，其中酶活較高的4-211基因與Chan等[18]報道的β-葡萄糖苷酶基因cba4序列相似度為42.83%，可能是一個新酶的編碼基因。

總之，本研究篩選到纖維降解活性較強的Cellulomonassp. h9菌株，根據全基因組測序結果，分析了其潛在的纖維素降解酶基因，且已有多個基因進行了功能驗證，后續(xù)實驗有望進一步驗證其他基因的功能，就酶的性質，以及各酶之間的協同反應等方面進行深入研究，以期闡釋菌株降解纖維素的機制。