趙茗， 周莊， 齊典文， 孫濤， 郭昶志， 趙桂松， 馬天曉， 劉思源， 胡彤宇， 張國(guó)川

骨肉瘤是兒童青少年最常見(jiàn)的骨原發(fā)惡性腫瘤，其年發(fā)病率約為(4～5)/100萬(wàn)[1]。隨著手術(shù)結(jié)合新輔助化療技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤患者的5年生存率由20世紀(jì)70年代以前的約20%提升到現(xiàn)在的60%以上，然而其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及多藥耐藥等問(wèn)題尚未得到解決[2]。安全有效的新藥研發(fā)與應(yīng)用仍是目前亟待解決的問(wèn)題。β-欖香烯是從中草藥莪術(shù)中提取的具有抗腫瘤活性的物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療，如肺癌、前列腺癌等[3-5]。多項(xiàng)研究表明β-欖香烯可以通過(guò)多種細(xì)胞通路誘導(dǎo)包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的凋亡并抑制細(xì)胞增殖[6-9]。還有研究表明，β-欖香烯能通過(guò)降低腫瘤基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的水平抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[10]。

自噬是將細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)成分轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體并降解的過(guò)程。在正常情況下，自噬通過(guò)轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)及清除受損的細(xì)胞器以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。自噬起始于雙膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡的形成，它可以吞噬受損細(xì)胞器或衰老的蛋白質(zhì)，然后自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，其中的內(nèi)容物被降解。病理?xiàng)l件下誘導(dǎo)的自噬是一種細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，可以使細(xì)胞在生存壓力下存活，但廣泛或持久的自噬也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此自噬是平衡細(xì)胞死亡和存活的重要決定性因素[11-12]。目前已有多項(xiàng)研究證明β-欖香烯所誘導(dǎo)的自噬在胃癌、肝癌及肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)起保護(hù)作用[13-15]。然而β-欖香烯是否能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生自噬及其在凋亡中的作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在對(duì)β-欖香烯在骨肉瘤中誘導(dǎo)自噬發(fā)生的信號(hào)通路及其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人骨肉瘤細(xì)胞株143B購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；β-欖香烯注射液購(gòu)自大連金港制藥有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、DAPI均購(gòu)自日本Dojindo公司；Annexin Ⅴ/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA試劑盒、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia GE公司;活化型半胱天冬酶3(Cleaved caspase-3)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-AKT)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha B，LC3B)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將143B細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況每天換液1次，每2～3天傳代1次，選取狀態(tài)佳、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的143B細(xì)胞，用PBS洗滌后，胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞以2×104/ml接種到96孔板，每孔100 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。貼壁培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度(10、20、50、100、150 μg/ml)β-欖香烯的為實(shí)驗(yàn)組，未用β-欖香烯處理的為對(duì)照組，24、48 h后從培養(yǎng)箱中取出，每孔加入10 μl CCK-8。繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)每孔的吸光度(A)值。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將經(jīng)0、20、50 μg/ml β-欖香烯處理48 h后的143B細(xì)胞用PBS洗滌后加入1 ml結(jié)合緩沖液，漂洗細(xì)胞1次棄上清液。依次加入100 μl結(jié)合緩沖液及2.5 μl Annexin Ⅴ，重懸混勻，于37 ℃避光溫育15 min，再加入2 μl PI，于37 ℃避光溫育3 min；每管加入結(jié)合緩沖液400 μl，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析：在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限(FITC-/PI-)為活細(xì)胞；右上象限(FITC+/PI+)為凋亡晚期細(xì)胞；右下象限(FITC+/PI-)為凋亡早期細(xì)胞。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察LC3B蛋白的表達(dá)及分布

將細(xì)胞接種于玻底培養(yǎng)皿中(2×104/孔)，貼壁后加入0、20、50 μg/ml的β-欖香烯培養(yǎng)48 h，PBS清洗，于-20 ℃用乙醇固定10 min，3%BSA室溫封閉30 min，LC3B一抗室溫孵育2 h，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗培養(yǎng)1 h。細(xì)胞核由DAPI共染。PBS清洗后用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白表達(dá)、分布及細(xì)胞自噬情況。

1.2.5 蛋白印跡法(Western blotting)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將143B細(xì)胞以5×104/ml的密度接種于6孔板中，貼壁后加入20 μg/ml β-欖香烯培養(yǎng)，分別于0、12及24 h收集細(xì)胞，測(cè)定AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白水平；同樣方法培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，加入0、20、50 μg/ml β-欖香烯，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行凋亡、自噬及AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白測(cè)定。加入裂解液提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加熱變性，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，一抗(Cleaved-caspase 3、LC3B、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR)4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，二抗反應(yīng)1 h，ECL試劑盒顯影，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS System凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響

β-欖香烯對(duì)143B細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性。β-欖香烯對(duì)143B細(xì)胞作用24 h和48 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為58.89 μg/ml和18.48 μg/ml(圖1)。

圖1 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞存活率的影響

2.2 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響

20、50 μg/ml β-欖香烯處理143B細(xì)胞48 h后，其細(xì)胞凋亡率明顯高于0 μg/ml β-欖香烯組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2，表1)。20、50 μg/ml β-欖香烯處理143B細(xì)胞后，其Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯高于0 μg/ml β-欖香烯組(P<0.05，圖3，表1)。

2A：0 μg/ml β-欖香烯組;2B：20 μg/ml β-欖香烯組;2C：50 μg/ml β-欖香烯組圖2 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡的影響

圖3 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞中Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

2.3 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤細(xì)胞自噬的影響

經(jīng)20、50 μg/ml β-欖香烯處理骨肉瘤143B細(xì)胞48 h后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自噬體數(shù)量明顯增多(圖4)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)20、50 μg/ml β-欖香烯處理143B細(xì)胞后，其自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平較0 μg/ml β-欖香烯組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5，表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平比較

圖4 0、20、50 μg/ml β-欖香烯組的143B細(xì)胞自噬情況(熒光顯微鏡 ×400)

圖5 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平的影響

2.4 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，20 μg/ml β-欖香烯處理骨肉瘤143B細(xì)胞12 h、24 h后，其p-AKT、AKT、p-mTOR及mTOR蛋白表達(dá)水平較0 h組均顯著降低(P<0.05)。20、50 μg/ml β-欖香烯處理143B細(xì)胞48 h后，其p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平較0 μg/ml β-欖香烯組明顯降低(P<0.05，圖6，表2、3)。

圖6 β-欖香烯對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的影響

表2 20 μg/ml β-欖香烯處理骨肉瘤143B細(xì)胞0、12、24 h后p-AKT、AKT、p-mTOR及mTOR蛋白表達(dá)水平比較

表3 各組p-AKT、AKT、p-mTOR及mTOR蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

近年來(lái)，許多研究證實(shí)中藥具有良好的抗腫瘤活性。欖香烯作為一種新型的抗腫瘤中草藥，在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出廣泛的抗腫瘤作用。已獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，用于惡性積液及部分實(shí)體腫瘤的治療。

本研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，并呈濃度依賴性；且證實(shí)β-欖香烯可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率顯著增加，Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，由此筆者推測(cè)β-欖香烯可能通過(guò)活化Caspase-3誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。有研究表明，β-欖香烯可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯抑制多種腫瘤的細(xì)胞增殖，如肝癌、肺癌及卵巢癌等[9,14,16]，但其對(duì)胃癌細(xì)胞只是抑制了細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞周期并無(wú)明顯影響[13]，這可能是由于不同細(xì)胞株的調(diào)節(jié)機(jī)制不同所致。

本研究還發(fā)現(xiàn)β-欖香烯可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的自噬現(xiàn)象，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的自噬小體。LC3是目前最常用的自噬標(biāo)記物，常用LC3B抗體進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)自噬發(fā)生后，胞漿內(nèi)的LC3-Ⅰ經(jīng)過(guò)修飾激活轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ以結(jié)合膜形式聚集于自噬體表面，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ為檢測(cè)自噬水平的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)β-欖香烯處理過(guò)的骨肉瘤細(xì)胞，其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)水平明顯增高，與之前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯可以誘導(dǎo)胃癌、肝癌及肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬的結(jié)果一致[13-15]。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，自噬可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞死亡[16-17]，自噬也可抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[5,12-13,18]。然而β-欖香烯誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制并未明確。

自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以保證其正常增殖及分化的重要方式，可以使細(xì)胞渡過(guò)營(yíng)養(yǎng)不足、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)而存活下來(lái)，異常的細(xì)胞自噬會(huì)引起腫瘤、肝病及肺病等[11,19]。mTOR是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，其下游有多種自噬相關(guān)蛋白參與自噬的各個(gè)環(huán)節(jié)。PI3K-AKT-mTOR通路是細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)因素中重要的信號(hào)系統(tǒng)。正常條件下，處于活化狀態(tài)的mTOR抑制細(xì)胞內(nèi)的自噬；然而當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，活性受到抑制的mTOR則會(huì)促進(jìn)自噬的發(fā)生[12,19]。本研究發(fā)現(xiàn),20、50 μg/ml β-欖香烯處理骨肉瘤143B細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中的p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平較0 μg/ml β-欖香烯組明顯降低；此外，20 μg/ml β-欖香烯處理骨肉瘤143B細(xì)胞12、24 h后，p-AKT、AKT、p-mTOR及mTOR蛋白表達(dá)水平較0 h組均顯著降低。因此筆者認(rèn)為β-欖香烯可以通過(guò)抑制AKT和mTOR的活化從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。

綜上所述，β-欖香烯可以顯著抑制骨肉瘤143B細(xì)胞增殖，引起骨肉瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)誘發(fā)細(xì)胞自噬。但β-欖香烯所致自噬反應(yīng)在其所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中所發(fā)揮的具體作用仍未明確，尚需進(jìn)一步研究及評(píng)估。