朱倩男， 王玨， 陳銳， 查小明， 史躍年， 王水

上肢淋巴水腫是乳腺癌腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)(axillary lymph node dissection ，ALND)后最常見的并發(fā)癥之一。目前，前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node，SLN)活檢術(shù)廣泛用于臨床腋窩淋巴結(jié)陰性的患者，盡可能避免不必要的ALND。然而，對于SLN有轉(zhuǎn)移或者探查SLN失敗的患者依舊需要進行ALND。少數(shù)行SLN活檢的患者也出現(xiàn)術(shù)后上肢水腫[1-4]。

Kimberg[5]于2007年提出逆行腋窩淋巴示蹤(axillary reverse mapping，ARM)的概念，通過顯影劑逆向顯影腋窩淋巴管網(wǎng)，以利于在行ALND和(或)前哨淋巴結(jié)活檢(sentinel lymph node biopsy,SLNB)時保護患者上肢至腋窩的淋巴通道，進而降低上肢水腫的發(fā)生率，提高患者的生活質(zhì)量[6-13]。ARM的可行性基于以下假設(shè)：乳腺和上肢的淋巴回流通路在結(jié)構(gòu)和功能上有相對獨立性，兩者之間僅有極少的交通支，乳腺原發(fā)惡性腫瘤不會累及上肢來源的淋巴系統(tǒng)[14-16]。然而，ARM有一定局限性，有研究者發(fā)現(xiàn)在少數(shù)情況下SLN同時接收上肢淋巴液[2-19]。Casabona等[7]的研究結(jié)果顯示，在37.5%(27/72)的患者中上肢匯至腋窩的淋巴管道與乳腺匯至腋窩的淋巴管的獨立性不明顯，SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)有重疊。因此，有不少研究針對SLNB時ARM的可行性、ARM示蹤的淋巴結(jié)檢出率及分布情況、ARM示蹤的淋巴管分布情況、ARM示蹤的淋巴結(jié)腫瘤侵襲情況、SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)的關(guān)系等進行了探討。亞洲的ARM臨床研究較少，且大多直接在患者身上借鑒西方經(jīng)驗進行研究。我們希望通過動物研究來驗證ARM操作的可行性，探索適合ARM實行的最佳染料、最佳注射點，同時尋找ARM示蹤的淋巴結(jié)和淋巴管的分布規(guī)律，進而指導(dǎo)ARM在臨床中的應(yīng)用。結(jié)合發(fā)展中國家核素法施行的困難以及熒光法需要專用設(shè)備提高操作成本等，我們選擇價格低廉、操作簡單的染料染色法(亞甲藍和納米炭混懸注射液)行ARM的研究。

1 研究材料

1.1 研究對象 健康雌性新西蘭大白兔54只，體重(1 800±300)g，非懷孕、非哺乳期，購自金陵種兔場，均單籠飼養(yǎng)，兔舍安靜，恒溫24 ℃，空氣濕度60%～70%，將全價飼料、飲水全部備入飼槽中，任兔自由采食。

1.2 研究染料 1%亞甲藍注射液(美藍)，購自江蘇濟川制藥有限公司；納米炭混懸注射液(卡納琳)，0.5 ml：25 mg，購自重慶萊美藥業(yè)股份有限公司。

1.3 研究器材 動物手術(shù)臺，3%戊巴比妥鈉20 ml及1 ml注射器，紗布、棉球、繃帶，血管鉗、眼科剪、眼科鑷、刀柄、刀片，計時器。

2 實驗步驟

所有大白兔均用3%的戊巴比妥鈉麻醉，置于手術(shù)臺上。手術(shù)前刮除兔子雙側(cè)上肢兔毛，充分暴露皮膚。將兔子按照體重從輕到重編號后，通過安全隨機數(shù)隨機選取每次研究的大白兔。

2.1 淋巴管網(wǎng)的獨立性 隨機選擇9只大白兔，在其右側(cè)最上方乳腺注入0.5 ml亞甲藍行SLN活檢，右側(cè)上肢皮下注射0.5 ml卡納琳行ARM。同時在這批兔子的左側(cè)最上方乳腺注入0.5 ml卡納琳行SLN活檢，左側(cè)上肢皮下注射0.5 ml亞甲藍行ARM。5 min后解剖腋窩，評估上肢淋巴管網(wǎng)與腋窩淋巴管網(wǎng)的相對獨立性。

2.2 上肢淋巴管的匯集特點 隨機選擇3只大白兔，以環(huán)形網(wǎng)狀樣(縱向每隔1 cm、橫向每隔1 cm)于雙側(cè)趾蹼間、掌間、上肢的皮下、肌肉中注入亞甲藍，每側(cè)共注入亞甲藍2 ml，每個注射點均勻注射染料，解剖腋窩，觀察上肢染色的淋巴匯集至腋窩的情況。

2.3 注射染料、部位的選擇 隨機選擇9只大白兔并隨機分為3個亞組，每亞組3只，全麻后用亞甲藍染色右側(cè)上肢淋巴管，卡納琳染色左側(cè)上肢淋巴管，每亞組中每只大白兔雙側(cè)上肢染料計量相同，3只大白兔染料計量分別為2 ml、1 ml、0.5 ml。第一組注射部位選擇兔趾蹼間的皮下處，第二組選擇肘部屈側(cè)皮下處，第三組選擇上肢近腋窩內(nèi)側(cè)皮下與肌間溝處。等待5 min后解剖腋窩，觀察匯入腋窩的引流上肢淋巴液的淋巴結(jié)與淋巴管的顯色情況，選擇最佳注射部位并選定后續(xù)實驗染料注射劑量。

2.4 ARM示蹤淋巴結(jié)與淋巴管的分布 根據(jù)上述三部分實驗結(jié)果進一步研究ARM下上肢淋巴液引流至腋窩淋巴結(jié)與淋巴管的分布情況：在33只雌性新西蘭大白兔雙側(cè)上肢近心1/3處內(nèi)側(cè)肌間溝的皮下、肌間溝及肌內(nèi)注射亞甲藍，充分按摩5 min后解剖腋窩，詳細記錄淋巴管、淋巴結(jié)顯色及分布情況。

本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會和南京醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心的倫理批準，批準號：1601179。

3 結(jié)果

從上肢淋巴管網(wǎng)獨立性的研究可見大白兔雙側(cè)腋窩區(qū)藍染的淋巴管網(wǎng)與黑染的淋巴管網(wǎng)是相對獨立的。17側(cè)上肢ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN不是同一淋巴結(jié)(圖1A)。僅有一側(cè)發(fā)現(xiàn)了1枚(1/18)雙染的淋巴結(jié)，這枚淋巴結(jié)就是交匯的ARM示蹤淋巴結(jié)和SLN(圖1B)。

上肢淋巴管匯集的研究結(jié)果顯示上肢淋巴管道流入腋窩時分為淺層淋巴通路和深層淋巴通路，深層淋巴通路在腋窩區(qū)匯聚成數(shù)根較粗的淋巴干(圖1C)，亞甲藍對于淋巴管的顯色更為清晰。

注射染料、部位選擇研究的結(jié)果提示亞甲藍與卡納琳對淋巴結(jié)的染色效果相近，均可清晰呈現(xiàn)淋巴結(jié)，但亞甲藍對于淋巴管的顯象更為清晰，更適合用于ARM技術(shù)的施行。最佳的染料注射部位為上肢的肌間溝處(圖2)。

在研究ARM示蹤的淋巴結(jié)與淋巴管分布的33只大白兔中，有兩只大白兔因麻醉死亡，9只大白兔僅一側(cè)上肢ARM操作成功。經(jīng)統(tǒng)計，共45側(cè)上肢的腋窩區(qū)探查到藍染淋巴結(jié)，47側(cè)上肢腋窩區(qū)探查到藍染淋巴管，其中有37例同時探查到藍染的淋巴結(jié)與淋巴管。為了便于統(tǒng)計觀察，我們將腋窩通過下述方法劃分為五個區(qū)域[11]：以前鋸肌、腋靜脈、第二肋間臂神經(jīng)、背闊肌前緣及胸背神經(jīng)血管束為標志物，區(qū)域A以腋靜脈和第二肋間臂神經(jīng)為上下界，胸背神經(jīng)與背闊肌前緣為前后界；區(qū)域B毗鄰A區(qū)域，在A區(qū)前方，以腋靜脈和第二肋間臂神經(jīng)為上下界，前鋸肌后緣與胸背神經(jīng)為前后界；區(qū)域C在B區(qū)下方，由第二肋間臂神經(jīng)、前鋸肌后緣和胸背神經(jīng)分隔而成；區(qū)域A的下方、區(qū)域C的后方即為區(qū)域D；腋靜脈上方的空間定位區(qū)域E(圖3A)。在我們的研究中，藍染淋巴結(jié)常位于某一個區(qū)域，只有1只大白兔的一側(cè)在A、B區(qū)均發(fā)現(xiàn)1枚藍染淋巴結(jié)。藍染淋巴結(jié)多數(shù)分布在腋靜脈與第二肋間臂神經(jīng)之間，也就是A、B區(qū)域，A區(qū)域檢出率為58.7%(27/46)，B區(qū)域檢出率為32.6%(15/46)，C區(qū)域檢出率為8.7%(4/46)，D、E區(qū)域未檢出藍染淋巴結(jié)。藍染淋巴管多伴行于腋靜脈。我們?nèi)鐖D3B所示，將其走行分成4種路線：路線1伴行于腋靜脈上方；路線2伴行于腋靜脈下方，但在第二肋間壁神經(jīng)上方；路線3從CD區(qū)域縱行向AB區(qū)域方向；路線4是較為細小的數(shù)條淋巴管走行于腋窩區(qū)域。只有一側(cè)上肢出現(xiàn)了同時伴行于腋靜脈上下的淋巴管分支，以及同時有路線1與2的走行，其他多數(shù)為單種走行路線，具體分布情況為：路線1占10.4%(5/48)，路線2占77.1%(37/48)，路線3占10.4%(5/48)、路線4占2.1%(1/48)。

1A：卡納琳黑染了1枚前哨淋巴結(jié)(箭頭1)，亞甲藍行ARM示蹤藍染了1枚淋巴結(jié)(箭頭2)，ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN不是同一個淋巴結(jié)；1B：有ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN重疊(箭頭3)；1C：通過亞甲藍行ARM發(fā)現(xiàn)，上肢淋巴管網(wǎng)分為深淺兩層，在匯入腋窩淋巴結(jié)之前會先匯聚成數(shù)根較粗的淋巴干(箭頭4)圖1 大白兔上肢與乳腺匯入腋窩的淋巴管網(wǎng)的情況

2A：沿著上臂內(nèi)側(cè)肌間溝皮下注射亞甲藍可以同時清晰的顯影淋巴管(箭頭1)和淋巴結(jié)(箭頭2)；2B：卡納琳可以清晰顯示淋巴結(jié)(箭頭3)，但是示蹤淋巴管效果較差圖2 分別用亞甲藍與卡納琳行ARM的示蹤情況

3A：ARM淋巴結(jié)多數(shù)位于腋靜脈和第二肋間壁神經(jīng)之間(A、B區(qū)域)。ARM淋巴結(jié)多數(shù)位于一個區(qū)域中，少數(shù)可同時存在于A、B區(qū)域；3B：ARM淋巴管多沿腋靜脈走行，多數(shù)為路線1的情況圖3 ARM淋巴結(jié)和淋巴管在腋窩的分布情況

4 討論

目前不少研究結(jié)果認為多數(shù)情況下乳腺的淋巴引流與上肢的淋巴引流在腋窩區(qū)鮮有匯聚，SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)不重疊，偶爾兩者會出現(xiàn)交匯[1-3,6-13]。本研究中，藍染的淋巴網(wǎng)與黑染的淋巴網(wǎng)相對獨立，也證實了SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)的相對獨立性。在多數(shù)研究中，為了藍染上肢淋巴管網(wǎng)，前哨淋巴結(jié)的活檢僅用核素法進行操作，部分術(shù)者認為單一示蹤劑會降低SLN檢出率，堅持染料結(jié)合核素法行SLN活檢，拒絕ARM技術(shù)[11]。我們將亞甲藍用于ARM技術(shù)、卡納琳結(jié)合核素法用于SLN活檢，可以保證SLN檢出率的同時進行ARM技術(shù)。

盡管ARM示蹤的淋巴結(jié)不等同于SLN淋巴結(jié)，但是少數(shù)案例中兩者是可以重疊的，側(cè)面解釋了為什么有的患者僅進行了SLN活檢也會出現(xiàn)上肢淋巴結(jié)水腫。一般ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN兩者的交匯率波動于0～21%(3/14)[1-3,5-21]。我們的動物實驗也證實兩者有為同一枚淋巴結(jié)的可能，交匯率為5.56%(1/18)，與臨床結(jié)果相似。當然，這些研究的樣本量較小，需進一步擴大樣本量后深入研究，進一步分析臨床數(shù)據(jù),評估交匯可能。

值得一提的是上肢淺層與深層的淋巴液在匯入腋窩的過程中會由細小的分支匯成數(shù)根主干。通過解剖證實保護這些淋巴干管道可以維持上肢淋巴管網(wǎng)的完整性。ARM技術(shù)可以顯示這些淋巴干并有助于術(shù)者在術(shù)中可視的情況下對這些淋巴干進行保護，減少因淋巴干切斷后引起上肢淋巴水腫。

我們研究中的一部分是通過對不同注射點注射同等計量的染料來進行ARM操作，對比發(fā)現(xiàn)上肢近心端的肌間溝內(nèi)側(cè)為最佳注射點。和其他注射點如指蹼間、肱二頭肌、肱三頭肌相比，肌間溝內(nèi)側(cè)注射點不僅可以有效地進行ARM操作，同時可以最大限度降低染色導(dǎo)致的不美觀。用亞甲藍進行ARM技術(shù)簡易且價格適中，其染色速度快，染色效果鮮明，對匯入腋窩淋巴系統(tǒng)中的上肢淋巴管顯色清晰，淋巴結(jié)及淋巴管染色效果均較理想；卡納琳對淋巴結(jié)染色效果明顯，但難以清晰顯示淋巴管，不利于術(shù)中保護上肢淋巴管道，而上肢匯總?cè)胍父C的淋巴管往往是維持上肢淋巴循環(huán)的關(guān)鍵，因此卡納琳難以用于ARM技術(shù)[14]。但在行ARM時，卡納琳可結(jié)合核素和(或)熒光染料進行SLN活檢，且檢出率較為穩(wěn)定。上肢淋巴引流可分淺深兩層，深層淋巴管至腋窩一般匯集成數(shù)根淋巴管，主淋巴管有1～3根，匯入相近位置的淋巴結(jié)，ALND主要損傷上肢深部淋巴引流的主管道，術(shù)中如果保留1～2根藍染淋巴管并保留部分藍染淋巴結(jié)，一定程度上維持了上肢淋巴循環(huán)的完整性，減少了對上肢淋巴循環(huán)的破壞，進而減少術(shù)后水腫的發(fā)生。絕大多數(shù)情況下，上肢引流至腋窩的淋巴管沿腋靜脈下方走行，其匯入的ARM示蹤的淋巴結(jié)多數(shù)位于腋靜脈下方、第二肋間臂神經(jīng)上方、近上肢處。此次研究中并未發(fā)現(xiàn)D區(qū)、E區(qū)有藍染淋巴結(jié)，但并不能排除D區(qū)、E區(qū)出現(xiàn)藍染淋巴結(jié)的可能，腋窩5個區(qū)域均有可能找到ARM示蹤的淋巴結(jié)，但是A區(qū)域探及到ARM示蹤淋巴結(jié)的幾率最大，手術(shù)操作時需格外注意。SLN多數(shù)位于腋窩淋巴結(jié)中央?yún)^(qū)，少數(shù)情況下ARM示蹤淋巴結(jié)也可在此區(qū)域，需盡量精細化操作，避免活檢SLN時切除范圍過大而連帶切除了ARM示蹤的淋巴結(jié)。

本研究也存在一些局限性。首先，結(jié)合發(fā)展中國家經(jīng)濟、政策特點，亞甲藍用于ARM是可行的，但是ARM研究的人群樣本量極其有限且單一染色法行ARM的成功率并不理想。其次，ARM示蹤的淋巴結(jié)被腫瘤累及的風(fēng)險缺乏大樣本數(shù)據(jù)，保留ARM示蹤的淋巴結(jié)和淋巴管的最關(guān)鍵問題是其腫瘤安全性和保留適應(yīng)證，這也直接影響ARM是否可應(yīng)用于實際。一些臨床研究已證實ARM示蹤的淋巴結(jié)有腫瘤侵襲的可能[11-12, 17-20]。第三，對于ARM示蹤的淋巴結(jié)有腫瘤轉(zhuǎn)移或ARM示蹤淋巴結(jié)與SLN淋巴結(jié)為同一淋巴結(jié)的情況下，術(shù)者難以接受保留ARM示蹤的淋巴管道和淋巴結(jié)，因此患者不能從ARM技術(shù)中獲益。保留ARM示蹤的淋巴管道和淋巴結(jié)的標準尚不明確。ARM可施行的前提是基于上肢淋巴通路不會受原發(fā)乳腺癌侵襲這一假設(shè)，所以我們需要擴大研究樣本量并結(jié)合腫瘤模型去評估ARM示蹤淋巴結(jié)受腫瘤侵襲的風(fēng)險性。最后，目前沒有關(guān)于ARM術(shù)后的長期隨訪，ARM技術(shù)運用的價值尚未得以肯定。

綜上所述，ARM技術(shù)是可行的，但是進行ALND或者SLN活檢時ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN淋巴結(jié)重疊的患者難以從ARM中獲益。上肢的淋巴管道匯聚成幾條較粗的淋巴管進入腋靜脈，在進行卡納琳聯(lián)合核素或熒光染料進行SLN活檢術(shù)時，可通過在上臂內(nèi)側(cè)肌間溝的皮下注射亞甲藍染料進行ARM，操作保護上肢淋巴引流通路。在動物研究中，ARM示蹤的淋巴結(jié)與淋巴管的分布情況與臨床結(jié)果相近，同時也存在ARM示蹤淋巴結(jié)與SLN的交匯。ARM示蹤淋巴結(jié)與淋巴管的保留條件和保留后能否改善上肢淋巴水腫的發(fā)生有待進一步研究。