黃佳麗 陳臻瑤 雷天瑤 王朝霞 程志祥

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210011

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對全世界人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]，約70%的肺癌為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。NSCLC 最常見的驅(qū)動基因是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）[3]，以這一驅(qū)動基因為靶點的表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），在臨床上取得了肯定的療效。然而，無論第1 代或第2 代EGFR-TKI，8～12 個月后，多數(shù)患者最終都獲得了耐藥性[4]，最主要的耐藥機制就是T790M突變[5]。為此，研究人員開發(fā)了針對T790M 突變的第3 代EGFR-TKI——奧希替尼，然而奧希替尼的獲得性耐藥仍不可避免的出現(xiàn)。EGFR-TKI 的獲得性耐藥是目前治療EGFR 突變NSCLC 面對的巨大難題，因此，克服EGFR-TKI 的獲得性耐藥尤為重要。本研究使用NSCLC 細胞株HCC827，通過濃度遞增法構(gòu)建奧希替尼耐藥細胞株HCC827OR，并探討其耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 HCC827 購自中科院細胞庫，HCC827OR細胞株由程志祥和王朝霞課題組構(gòu)建。

1.1.2 藥品與試劑 奧希替尼（HY-15772）購于MCE 公司；RPMI-1640（61870036）、FBS（16140071）、胰酶（25 200072）購于Gibco 公司；CCK8（K1018）購于APExBIO公司；兔 抗人EGFR（4267S）、p-EGFR（2220S）、AKT（9272S）、p-AKT（9611S）、ERK（4695S）、p-ERK（4370S）、E-cadherin（3195S）和Vimentin（5741S）購于CST 公司；鼠抗人GAPDH（HRP-60004）購于Proteintech 公司；上述抗體的稀釋比例為1∶1000。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐藥細胞株的建立 初始，給予10 nmol/L 奧希替尼處理細胞。初篩時，按10 nmol/L 的濃度差提升，直至細胞穩(wěn)定；濃度提升至親本細胞半抑制濃度（IC50）的10 倍時按100 nmol/L 的濃度差提升；直至細胞能在2 μmol/L 的含藥培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。

1.2.2 細胞對藥物敏感性的檢測 細胞經(jīng)奧希替尼孵育72 h，CCK8 孵育2 h，酶標儀（BioTek，ELx800）檢測吸光度（OD）值。計算IC50及RI。抑制率=[（對照組OD 值-實驗組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）]×100%，RI=IC50（耐藥細胞）/IC50（親本細胞）。

1.2.3 細胞增殖實驗 細胞于96 孔板培養(yǎng)0、1、2、3、4 d，CCK8 孵育2 h，檢測OD 值，計算細胞倍增時間（DT），DT=t×[lg2/（lgNt-lgNo）]。細胞于6 孔板培養(yǎng)約2 周，甲醇固定結(jié)晶紫染色。EdU 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，固定染色。

1.2.4 流式細胞實驗 細胞1000 r/min 離心5 min（離心半徑10 cm），PBS 清洗，F(xiàn)ITC-Annexin V 和PI 雙重染色，分析。

1.2.5 Western blot 分析細胞中相關(guān)蛋白 細胞加入不同濃度奧希替尼處理4 h，提取蛋白，10%SDSPAGE 膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育，化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

運用GraphPad 8.0 對數(shù)據(jù)進行分析作圖，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t 檢驗。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細胞株的建立及耐藥性檢測

同過藥物濃度遞增的方法，歷時10 個月，體外成功構(gòu)建了HCC827OR。CCK8 結(jié)果顯示，HCC827 的IC50為（15.07±0.43）nmol/L，HCC827OR 的IC50為（6.64±0.10）μmol/L，RI 為440.31。見圖1。

圖1 HCC827 和HCC827OR 的奧希替尼濃度-細胞抑制率曲線

2.2 HCC827 和HCC827OR 的形態(tài)學(xué)變化

在形態(tài)上，與HCC827 比較，HCC827OR 細胞輪廓明顯且表現(xiàn)出間充質(zhì)樣表型，包括梭形的外觀，細胞間的連接喪失和極性，部分細胞有片狀偽足伸出。見圖2。

圖2 HCC827 和HCC827OR 的形態(tài)學(xué)變化（100×）

2.3 HCC827 和HCC827OR 的細胞增殖能力差異

CCK8 增殖實驗中，第1 天，HCC827OR 的細胞活性高于HCC827（t=2.583，P ＜0.05），第2、3、4 天，HCC827OR 的細胞活性顯著高于HCC827（t=5.539、5.755、7.843，P ＜0.01）。HCC827OR 集落形成較HCC827增多（t=8.223，P ＜0.01）。見圖3。HCC827 和HCC827OR的倍增時間為（49.30±5.42）h 和（34.26±1.66）h。EdU結(jié)果顯示，HCC827OR 細胞EdU 染色陽性率高于HCC827（t=5.548，P ＜0.01）。見圖4（封三）。

圖3 HCC827 和HCC827OR 細胞增殖能力差異

2.4 HCC827 和HCC827OR 細胞凋亡差異

HCC827OR 的凋亡率低于HCC827（t=5.606，P ＜0.01），提示HCC827OR 的凋亡能力減弱。為進一步驗證，分別給予15 nmol/L 奧希替尼處理，結(jié)果顯示，HCC827 凋亡明顯增加（t=11.48，P ＜0.01），而HCC827OR凋亡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.868，P ＞0.05）。見圖5。

圖5 HCC827 和HCC827OR 細胞凋亡

2.5 HCC827 和HCC827OR 細胞蛋白質(zhì)表達差異

與HCC827 比 較，HCC827OR 的EGFR 和p-EGFR 表達下降（P ＜0.05），p-AKT 和Vimentin 表達上升（P ＜0.05）。兩株細胞p-EGFR、p-AKT 和p-ERK的表達隨著奧希替尼濃度的上升而下降（P ＜0.05）。見圖6。

圖6 HCC827 和HCC827OR 細胞中相關(guān)蛋白表達

3 討論

第三代選擇性EGFR-TKI——奧希替尼，在臨床上取得了重大效益。盡管奧希替尼的良好效果為治愈肺癌帶來了巨大希望，但獲得性耐藥的患者會產(chǎn)生[6]。研究顯示，奧希替尼獲得性耐藥的機制可概括如下幾點。①基因改變：繼發(fā)性突變[7-9]，基因融合[10-11]，基因重排[12-13]及基因擴增[14-15]；②信號通路改變[16-18]；③表型改變[19-22]；④其他相關(guān)機制：EGFR 膜/質(zhì)/核移位[23]，自噬增加[24]。此外，尼古丁也參與奧希替尼的耐藥[25]。

本研究耐藥細胞誘導(dǎo)時間為10 個月，接近于奧希替尼臨床耐藥出現(xiàn)的時間[1]，將更能從體外的角度探討奧希替尼耐藥的機制。與親本細胞比較，HCC827OR對奧希替尼高度耐受，具有間充質(zhì)樣表型，較強的增殖能力，凋亡能力減弱。此外，其與細胞生長相關(guān)的信號通路蛋白的表達存在差異。值得注意的是，HCC827OR 細胞的p-AKT 和p-ERK 的藥物作用效果沒有HCC827 細胞明顯，進一步提示HCC827OR對奧希替尼不敏感。HCC827OR 細胞Vimentin 的表達上調(diào)，提示HCC827OR 細胞呈上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本研究構(gòu)建并鑒定了奧希替尼耐藥細胞株HCC827OR，為后期對其耐藥機制的深度研究提供了研究基礎(chǔ)。