孫禮林, 李佳眉

(安徽師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

引言

銅作為一種人體重要的微量元素，在人體生理過程中起著重要的作用，例如它是許多金屬酶的輔助因子，在能量的產(chǎn)生、二氧化碳的運(yùn)輸和活化、信號的傳導(dǎo)中都起著重要作用[1]。然而當(dāng)銅離子的濃度超過細(xì)胞的需求就會(huì)對生物體有毒，誘導(dǎo)胃腸道和肝腎的系統(tǒng)疾病，以及神經(jīng)退化病如Menkes病和Wilson病等[2-7]。另外，銅離子為重金屬離子，其污染會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境問題和衛(wèi)生問題。因此，銅離子的檢測對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。

到目前為止，已經(jīng)發(fā)展了許多銅離子檢測方法，包括原子吸收光譜法、電感耦合等離子質(zhì)譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[8-10]、有機(jī)熒光染料探針法[11-12]和電化學(xué)分析法等[13-14]。

熒光共軛聚合物在化學(xué)和生物傳感器中的應(yīng)用是近幾十年來人們深入探討和研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。熒光共軛聚合物具有“分子導(dǎo)線”的性質(zhì)，電子和能量能夠在聚合物的共軛主鏈上快速遷移，對環(huán)境中極微量的淬滅劑顯示出更迅速的響應(yīng)，表現(xiàn)出“淬滅放大”效應(yīng)。與小分子傳感器相比，具有更高的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

非水溶性共軛聚合物在水中溶解性差，將不利于生物環(huán)境中實(shí)樣的檢測。為了更有效地進(jìn)行生物分子或離子的熒光檢測，人們在非水溶性共軛聚合物的基礎(chǔ)上通過在疏水性的主鏈上添加離子型官能團(tuán)[15-16]合成了水溶性共軛聚合物，帶有離子化側(cè)鏈和帶有特定選擇性官能團(tuán)的水溶性共軛聚合物更有利于傳感應(yīng)用，更加具有重要的研究價(jià)值。水溶性熒光共軛聚合物與中性聚合物分子相比，與目標(biāo)離子結(jié)合的親和力更強(qiáng)。例如，許多水溶性共軛聚合物的在傳感應(yīng)用中就利用了聚合物帶電荷的側(cè)鏈基團(tuán)和分析目標(biāo)物如金屬陽離子、磷酸陰離子、蛋白質(zhì)、多電解質(zhì)及多核酸電荷之間的靜電相互作用提高其分析檢測的靈敏度。

目前報(bào)道的水溶性共軛聚合物大多數(shù)主鏈中的單體是在苯環(huán)的對位、噻吩的2,5位或芴的2,7位進(jìn)行偶聯(lián)聚合的，因而聚合物主鏈通常都是直線型的。這一類聚合物合成和應(yīng)用已被充分研究，其聚集狀態(tài)和構(gòu)象變化對熒光性質(zhì)的影響也被充分討論。與之相比，非直線型主鏈結(jié)構(gòu)的水溶性共軛聚合物合成和應(yīng)用、構(gòu)象變化和熒光性能相互關(guān)系的研究報(bào)道還較為欠缺。為了在熒光傳感應(yīng)用中適應(yīng)多種檢測對象，合成和制備具有多樣結(jié)構(gòu)的熒光傳感材料也是十分必要的。

Tan等人在2004年報(bào)道了一種水溶性PPE類共軛聚電解質(zhì)，其鏈節(jié)中的單體是在苯環(huán)的間位連接(meta-linked)聚合的，故而整個(gè)聚合物主鏈呈折線型結(jié)構(gòu)。他們對該折線型聚合物的光學(xué)性質(zhì)和構(gòu)象變化進(jìn)行了進(jìn)一步研究[17]。目前報(bào)道的折線型共軛聚電解質(zhì)從鏈節(jié)組成來看主要有聚苯撐乙炔撐(PPE)、聚苯撐乙烯撐(PPV)、聚芴(PF)等類型。這一類折線型聚合物存在著溶劑誘導(dǎo)的自組裝行為，聚合物疏水性的主鏈在水溶液中避開水相發(fā)生分子內(nèi)折疊形成螺旋形構(gòu)象，而在甲醇、四氫呋喃等良溶劑中聚合物主鏈則伸展開來，從而轉(zhuǎn)變成伸展的無規(guī)線團(tuán)構(gòu)象。這兩種構(gòu)象在水和良溶劑構(gòu)成的混合溶劑中隨溶劑組成的變化和溶液pH值的變化而相互轉(zhuǎn)變，進(jìn)而影響聚合物的紫外吸收和熒光發(fā)射等光學(xué)性質(zhì)。主鏈螺旋形構(gòu)象有效地減少了水溶液中聚合物疏水主鏈之間的鏈間聚集，并且表現(xiàn)出放大的熒光淬滅效應(yīng)，熒光被淬滅的效率不同程度地高于無規(guī)線團(tuán)構(gòu)象的聚合物，可望進(jìn)一步提高聚合物的熒光傳感性能。折線型聚合物的螺旋構(gòu)象能夠通過靜電結(jié)合作用和嵌插作用與一些客體分子相互作用(這一特點(diǎn)與DNA大致相同)，這可能導(dǎo)致其與生物分子之間的結(jié)合更為牢固，使其在生物分子傳感檢測中更為有利[17-19]。

折線型水溶性熒光共軛聚合物的合成及其在離子、無機(jī)及有機(jī)小分子、DNA等生物大分子的熒光傳感檢測上的應(yīng)用已有了不少報(bào)道，但仍有許多空間(如進(jìn)一步提升其熒光傳感靈敏度與選擇性等)有待科研工作者進(jìn)一步研究和探索。最近我們在工作中制備了一種新的折線型水溶性熒光共軛聚合物m-PPEASO3Na(結(jié)構(gòu)見圖1)，該聚合物長波激發(fā)和近紅外發(fā)射的特點(diǎn)能夠有效地減少紫外光激發(fā)時(shí)生物體自體熒光和光散射的干擾。利用Cu2+對m-PPEASO3Na的熒光淬滅效應(yīng)，建立了一種高靈敏度的近紅外熒光檢測Cu2+的方法。該方法被成功用于合成樣品和實(shí)際樣品銅的檢測，并取得了較好的效果。

圖1 聚合物m-PPEASO3Na的結(jié)構(gòu)(A)及其水溶液中的螺旋構(gòu)象和銅離子對其熒光的動(dòng)態(tài)猝滅(B)Fig.1 Structure of m-PPEASO3Na(A)；the helix conformation of m-PPEASO3Na in aqueous solution and dynamic quenching of its fluorescence by copper ions(B)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：UV-3010紫外-可見分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)；FS5全功能穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡公司)；DUG-9360電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SV-1200T超聲波清洗機(jī)(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)；FA2004電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；PHS-3C酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)；熒光比色皿；紫外比色皿等。

試劑：聚合物m-PPEASO3Na參考文獻(xiàn)方法設(shè)計(jì)合成[20]。測試中所用的Cu(NO3)2，NaCl，AgNO3，Hg2Cl2，CaCl2，MgSO4，K2CO3，Pb(NO3)2，AlCl3，F(xiàn)eSO4及其它常規(guī)化學(xué)試劑購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。所有化合物或聚合物水溶液均用二次水配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

聚合物m-PPEASO3Na溶于二次水配成濃度為0.5mM的工作溶液，熒光測定時(shí)在2mL帶刻度的離心管中放入適當(dāng)體積的m-PPEASO3Na溶液和100μL 50mM Tris-HCl緩沖溶液，并且依次加入不同量的金屬離子溶液。混合物用二次水稀釋至刻度，充分混勻。室溫下放置6min后，在熒光儀上測定635nm處的熒光。所有熒光檢測實(shí)驗(yàn)中，狹縫寬度為2nm，激發(fā)波長為520nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅離子對m-PPEASO3Na熒光的淬滅及其淬滅機(jī)制

實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)了一些常見的金屬離子包括生理相關(guān)金屬離子(Ag+，Al3+，Ca2+，Cu2+，K+，Ni2+，Pb2+，Na+，F(xiàn)e2+，Pr2+，Cr3+，Hg+)對聚合物m-PPEASO3Na水溶液熒光強(qiáng)度的影響。分別移取120μL的聚合物溶液至2mL的刻度離心管中，然后再依次加入100μL 1.0mM的硝酸銅水溶液以及其它含相應(yīng)金屬離子的化合物的水溶液，最后用二次水定容至2mL，然后和空白試樣一起在同樣條件下測定其熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)表明大多數(shù)金屬離子對聚合物水溶液的熒光強(qiáng)度影響不大，只有銅離子和鎳離子使聚合物的熒光強(qiáng)度顯著下降，而銅離子對聚合物的熒光淬滅效率最大。

熒光測定所用的激發(fā)波長為520nm，m-PPEASO3Na水溶液的最大發(fā)射波長為635nm，當(dāng)Cu2+加到m-PPEASO3Na水溶液中，其熒光發(fā)射波長幾乎不變，熒光強(qiáng)度則隨著銅離子的濃度增加而逐漸減弱。在優(yōu)化條件下，熒光淬滅程度與銅離子在2.3～65μM濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，這構(gòu)成了利用m-PPEASO3Na熒光傳感測定Cu2+的基礎(chǔ)。

在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)F0/F相對于銅離子的濃度作圖所得圖形符合Stern-Volmer方程。但無論是動(dòng)態(tài)淬滅還是靜態(tài)淬滅，F(xiàn)0/F與Cu2+濃度之間均存在著線性關(guān)系[21-22]。為了考察銅離子對聚合物熒光的淬滅機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中分別測定了聚合物水溶液加入淬滅劑銅離子前后的紫外-可見吸收光譜(圖2A)和熒光壽命(圖2B)。

圖2 (A)m-PPEASO3Na在銅離子缺乏和存在時(shí)的紫外-可見吸收光譜，(B)m-PPEASO3Na在銅離子缺乏和存在時(shí)的熒光衰減曲線(銅離子的濃度為50μM)

從圖2A可以看出在50μM Cu2+存在下，m-PPEASO3Na水溶液(濃度：54μM)的紫外-可見吸收光譜中最大吸收峰位置和加入銅離子之前相比幾乎不變，說明聚合物與Cu2+沒有形成基態(tài)絡(luò)合物。繼而考察熒光發(fā)射最大處所測的聚合物熒光衰減情況，m-PPEASO3Na水溶液在加入Cu2+之前和之后，熒光壽命分別是1.992ns和1.399ns(圖2B)，淬滅劑Cu2+的存在明顯降低了聚合物的熒光壽命。再進(jìn)行變溫實(shí)驗(yàn)(室溫20℃和50℃)，在較高的實(shí)驗(yàn)溫度下Cu2+對聚合物水溶液的熒光淬滅效率明顯較高。這些都說明Cu2+對聚合物熒光的淬滅過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)淬滅過程。

在水溶液中折線型水溶性共軛聚合物m-PPEASO3Na的主鏈呈螺旋形構(gòu)象(圖1B)[17,23-24]，主鏈上極性的磺酸基帶負(fù)電荷，當(dāng)聚合物的激發(fā)態(tài)分子與帶正電荷的金屬陽離子Cu2+相互碰撞時(shí)，兩者相互碰撞和吸引的結(jié)果，Cu2+和激發(fā)態(tài)的聚合物負(fù)離子可能形成了某種激態(tài)復(fù)合物(exciplex)，這就阻止了電子沿螺旋形的共聚物主鏈的轉(zhuǎn)移，或者誘導(dǎo)了電子向電子受體的快速光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移。Cu2+具有缺電子的d軌道電子構(gòu)型，再加上靜電相互作用，可以充當(dāng)陽離子電子受體，電子轉(zhuǎn)移的結(jié)果使聚合物的激發(fā)態(tài)分子失去其激發(fā)能，從而導(dǎo)致了Cu2+對m-PPEASO3Na熒光的高效動(dòng)態(tài)淬滅。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1m-PPEASO3Na濃度優(yōu)化 在2mL離心管中加入濃度為0.5mM的聚合物m-PPEASO3Na水溶液10μL然后用二次水定容至2mL，得到濃度為2.7μM的聚合物溶液。同樣方法可分別得到濃度分別為5.4，10.8，18.9，21.6，27，37.8，45.9，48.6，54，81，91.8，102.6μM的聚合物水溶液。

按同樣的順序和用量在不同離心管中依次加入濃度為0.5mM的m-PPEASO3Na水溶液，再分別加入120μL Cu(NO3)2(濃度為1.0mM)溶液，然后再用二次水定容至2mL得到含60μM Cu2+的不同濃度的聚合物水溶液。

依次測定Cu2+缺乏(Fo)和存在(F)時(shí)，不同濃度的m-PPEASO3Na對熒光強(qiáng)度的影響(圖3A)，結(jié)果顯示當(dāng)聚合物m-PPEASO3Na的濃度為81μM，銅離子的淬滅程度達(dá)到最佳，因而選用濃度為81μM的m-PPEASO3Na溶液，以達(dá)到較高的分析靈敏度。

2.2.2 溶液pH值優(yōu)化 取7個(gè)2mL離心管，加入不同pH的Na2HPO4-KH2PO4和Tris-HCl緩沖溶液及300μL濃度為0.5mM的聚合物m-PPEASO3Na水溶液，定容至2mL。另取7個(gè)相同的離心管加入同量的不同pH的Na2HPO4-KH2PO4和Tris-HCl緩沖溶液及300μL聚合物m-PPEASO3Na溶液，混勻之后加入60μL Cu(NO3)2溶液(0.1mM)并定容至2mL。靜置10分鐘后進(jìn)行熒光檢測。

由聚合物熒光發(fā)射強(qiáng)度隨pH的變化(圖3B)可以看出，聚合物m-PPEASO3Na在沒有加入銅離子時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著pH的增大(溶液由酸性到堿性)而增大，加入銅離子后，熒光被部分淬滅，隨著pH的增大熒光強(qiáng)度也出現(xiàn)了慢慢增加的趨勢。而在pH=7.60處加入銅離子后聚合物熒光淬滅的程度最大。因此檢測銅離子時(shí)皆在Tris-HCl緩沖介質(zhì)中進(jìn)行，最佳pH值為7.60。

2.2.3 測定時(shí)間優(yōu)化 取2個(gè)2mL離心刻度試管，分別加入300μL濃度為0.54mM的m-PPEASO3Na水溶液，其中一個(gè)管中加入130μL濃度為1.0mM的Cu(NO3)2溶液，再分別用pH=7.60的50mM Tris-HCl緩沖溶液定容至2mL，此時(shí)離心管中Cu2+的濃度為65μM，m-PPEASO3Na的濃度為81μM。分別測定熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)m-PPEASO3Na溶液在室溫下加入Cu2+6分鐘之后，熒光淬滅程度和熒光強(qiáng)度基本保持不變(圖3C)，因而本實(shí)驗(yàn)選擇加入銅離子6分鐘之后進(jìn)行熒光測定。

圖3 在Cu2+缺乏(Fo)和存在(F)時(shí)，m-PPEASO3Na水溶液濃度對熒光強(qiáng)度的影響(60μM Cu2+)(A);pH對m-PPEASO3Na熒光強(qiáng)度的影響(3.0μM Cu2+)(B);m-PPEASO3Na的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化(65μM Cu2+，81μM m-PPEASO3Na)(C)。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

為了評估所提方法的選擇性，實(shí)驗(yàn)中還試驗(yàn)了該方法對一些潛在干擾物質(zhì)的耐受水平。用5.0μM銅離子和不同濃度的潛在干擾離子(K+、Na+濃度為500μM，其它離子濃度均為65μM)預(yù)先混合再進(jìn)行試驗(yàn)，并與未加干擾離子的銅離子測試結(jié)果相對比。由圖4可知，大多數(shù)潛在的干擾離子對銅離子的測定僅產(chǎn)生微小的影響(信號改變均小于5%)，這表明m-PPEASO3Na作為近紅外探針可以用于實(shí)際樣品中銅的檢測。

圖4 其它離子的干擾實(shí)驗(yàn)Fig.4 Interference from some potential interfering ions

2.4 聚合物m-PPEASO3Na熒光傳感檢測銅離子

在2mL帶刻度的離心管中分別加入300μL 0.54mM聚合物m-PPEASO3Na的水溶液、100μL pH=7.60 Tris-HCl緩沖溶液、0.1mM的硝酸銅水溶液46μL，然后用二次水定容至2mL，得到銅離子濃度為2.3μM的聚合物銅離子溶液。同樣方法還可以分別得到銅離子濃度分別為5,9,10,13.5,19,30,40,50,65μM的聚合物銅離子溶液。使其混勻，6分鐘之后進(jìn)行檢測。

如圖5A所示，隨著銅離子的濃度增加，聚合物熒光強(qiáng)度逐漸下降，但是波長移動(dòng)不明顯。當(dāng)銅離子的濃度范圍在2.3～65μM時(shí)，F(xiàn)o/F相對于銅離子的濃度作圖符合線性關(guān)系(圖5B)，相關(guān)線性方程為Fo/F=1.1852+0.0236[Cu2+](r=0.99051)，檢測限為0.07μM。

圖5 (A)不同濃度銅離子(0,2.3,5,9,10,13.5,19,30,40,50,65μM)存在下,81μM m-PPEASO3Na的熒光光譜圖；(B)Stern-Volmer曲線。

我們將本實(shí)驗(yàn)方法和近年文獻(xiàn)報(bào)道的一些銅離子檢測熒光方法[21-22,25-29]進(jìn)行了對比，從表1可以看出，我們的實(shí)驗(yàn)方法展現(xiàn)出良好的分析靈敏度和線性范圍，此外還具有長波激發(fā)、近紅外發(fā)射和低背景干擾的優(yōu)點(diǎn)。

表1 本實(shí)驗(yàn)方法和其他一些檢測銅離子熒光測定方法的分析參數(shù)對比

2.5 分析應(yīng)用

為了評估m(xù)-PPEASO3Na作為近紅外探針測定銅的實(shí)用性，我們在優(yōu)化條件下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行了兩種合成樣品和兩種實(shí)際樣品的測定。合成樣品1的組成如下：6.0μM K+，6.0μM Na+，6.0μM Ca2+，6.0μM Mg2+，6.0μM Al3+。合成樣品2的組成如下：2.0μM K+，2.0μM Na+，2.0μM Zn2+，2.0μM Co2+，2.0μM Fe3+。實(shí)際樣品自來水和無機(jī)廢液來源于合成實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，表明本方法的可行性和實(shí)用性都可以滿足實(shí)際樣品的檢測。

表2 合成樣品和實(shí)際樣品中銅離子的檢測

3 結(jié)論

利用Cu2+對折線型水溶性共軛聚合物m-PPEASO3Na增強(qiáng)的熒光淬滅效應(yīng)建立了一種高靈敏度的近紅外熒光檢測Cu2+的方法，并用此方法檢測了合成樣品和實(shí)際樣品中的銅離子。m-PPEASO3Na探針具有長波激發(fā)和近紅外發(fā)射的特點(diǎn)，可望在生物樣品檢測中能夠有效地減少紫外光激發(fā)時(shí)生物體自體熒光和光散射的干擾。