李淵，顧守美，劉小虎，周雯，周玥*，畢玉洮，郭太兵

(1.大理護(hù)理職業(yè)學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，云南 大理 671000；3.大理大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，云南省細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000)

0 引言

急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia，AML)是一種起源于AML干細(xì)胞的以髓細(xì)胞失控性增殖為特征的危及生命的惡性克隆性疾病，急性髓系白血病克隆中的白血病細(xì)胞增值失控、分化障礙、凋亡受阻，而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段，發(fā)病時(shí)骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞(白血病細(xì)胞)大量增殖并浸潤(rùn)肝、脾、淋巴結(jié)等各種臟器，抑制正常造血，具有高度異質(zhì)性[1]。AML的臨床進(jìn)展和預(yù)后與侵襲細(xì)胞類型、遺傳學(xué)改變以及克隆的生物學(xué)特性緊密相關(guān)。盡管隨著化療方案的不斷改進(jìn)，患者的治療效果已有明顯改善，但復(fù)發(fā)及大劑量化療的毒副作用仍是影響療效進(jìn)一步提高的主要障礙[2]。本研究通過(guò)免疫磁珠分選法分離純化出CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞，移植入NSG小鼠體內(nèi)，復(fù)制急性髓系白血病小鼠模型，為進(jìn)一步研究白血病的發(fā)生機(jī)制及治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雌性NSG小鼠24只，10-12周齡，體質(zhì)量25～30g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。在符合SPF標(biāo)準(zhǔn)的層流室中飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞株

KG-1a細(xì)胞為重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室饋贈(zèng)。

1.3 藥品與試劑

IMDM1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Human anti-CD38 MicroBead Kit(APC)(Miltenyi公司)；Human anti-CD34 MicroBead Kit(FITC)(Miltenyi公司)；環(huán)磷酰胺水合物試劑(Sigma公司)；CCK-8試劑盒(Sigma公司)；瑞氏染液試劑一、二(南京建成公司)；Anti CD34抗體(abcam公司)；無(wú)水乙醇(國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)；免疫熒光一、二抗稀釋液(碧云天公司)；山羊血清(上海生工公司)；Dapi染色液、蘇木素染液、伊紅染液、抗熒光淬滅劑(碧云天公司)；臺(tái)盼藍(lán)染料(Sigma公司)。

1.4 儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；MC-6500血常規(guī)儀(庫(kù)貝爾生物科技有限公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋公司)；切片機(jī)、烤片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；電子分析天平(瑞士Precisa12A公司)；激光共聚焦熒光顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司)；移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精儀器公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)。

2 方法

2.1 CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞的分離純化及鑒定

2.1.1 CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞的分離純化

通過(guò)免疫磁珠分選法對(duì)KG-1a細(xì)胞進(jìn)行分離純化，洗下的細(xì)胞即為CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞。

2.1.2 CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞活性檢測(cè)

將適量的CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液混合均勻，滴加至載玻片上，顯微鏡下進(jìn)行觀察及計(jì)數(shù)。

2.1.3 CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞純度檢測(cè)

分別取分選前的KG-1a細(xì)胞和分選后的CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞1×106個(gè)，加入單克隆抗體human anti-CD34-FITC和human anti-CD38-APC，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)APC和FITC的熒光信號(hào)。細(xì)胞純度(%)=(CD34+CD38-細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將NSG小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組12只。在細(xì)胞移植前給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺2 mg/只，連續(xù)2天；環(huán)磷酰胺注射后第3天，實(shí)驗(yàn)組：在無(wú)菌條件下通過(guò)尾靜脈移植CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞，細(xì)胞量為3×107個(gè)/只；對(duì)照組：相同條件下尾靜脈注入等量等時(shí)的無(wú)菌PBS。

2.3 NSG小鼠的一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)期間按照4次/周觀察小鼠的精神狀況、食欲狀態(tài)、活動(dòng)能力、毛發(fā)狀況、腹部腫塊、體質(zhì)量等情況，并做好實(shí)驗(yàn)記錄。

2.4 NSG小鼠血涂片分析

制備血涂片，瑞氏-吉姆薩染色，待干后即可鏡檢，中性樹膠封固。

2.5 NSG小鼠骨髓象分析

取NSG小鼠雙側(cè)股骨分離出骨髓并制備骨髓涂片。瑞氏-吉姆薩染色，待干后即可鏡檢，中性樹膠封固。

2.6 肝臟、脾臟病理學(xué)檢測(cè)

第40天處死小鼠后取新鮮肝臟及脾臟，甲醛固定后，進(jìn)行組織石蠟包埋，冷凍切片后染色，95%乙醇依次脫水后二甲苯依次透明，晾干后即可鏡檢和封片。

2.7 CCK-8檢測(cè)兩組骨髓細(xì)胞的增值能力

提取的各組模型骨髓細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL。分別接種于96孔板中，每孔100 μL，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5% CO2)，培養(yǎng)24h、48h、96h。每孔加入10μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度值。同時(shí)設(shè)置空白孔(只加培養(yǎng)基和CCK溶液)，對(duì)照孔(未經(jīng)處理的細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK溶液)。依據(jù)下列公式計(jì)算骨髓細(xì)胞的活力。

細(xì)胞增殖活力(%)=[OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組]/[OD對(duì)照組-OD空白組] ×100%

2.8 免疫熒光染色鑒定腫瘤細(xì)胞來(lái)源

在培養(yǎng)板中將已制備完成的細(xì)胞爬片用PBS浸洗3次，4%的多聚甲醛常溫固定15min，PBS浸洗后用0.5%的Triton x-100通透細(xì)胞15min，滴加6%正常山羊血清室溫封閉30min，滴加一抗Anti CD34(稀釋比例為1:500)濕盒中4℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫后滴加熒光二抗Anti Alexa Fluor 647(稀釋比例：1:800)濕盒中37℃孵育30min；PBS浸洗后滴加DAPI避光孵育5min對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS浸洗后用含抗熒光淬滅劑封片，激光掃描聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用析因設(shè)計(jì)、單因素方差分析方法，數(shù)據(jù)均以表示，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞的純度與活性

測(cè)定結(jié)果顯示，分選前細(xì)胞中CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞群百分比為(8.25±1.55)%，免疫磁珠分選后CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞群純度可達(dá)(92.45±2.80)%。臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定結(jié)果顯示，免疫磁珠分選后細(xì)胞活性為(93.68±1.97)%。提示通過(guò)免疫磁珠分選法分選得到的CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞有較高的純度和活性。

3.2 NSG小鼠一般情況觀察

與對(duì)照組小鼠比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠神態(tài)萎靡不振、行走不穩(wěn)、毛發(fā)雜亂，皮膚粗糙，4只小鼠腹部有明顯腫塊，體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)；對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常，均未出現(xiàn)白血病征象。見表1。

表1 兩組小鼠平均體質(zhì)量(n=12，

表1 兩組小鼠平均體質(zhì)量(n=12，

注：與對(duì)照組相比: *P＜0.05(表2同)。

組別 平均體質(zhì)量(g)對(duì)照組 26.85±1.96實(shí)驗(yàn)組 18.45±2.65*

3.3 兩組小鼠血涂片分析

血涂片結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組可見白血病細(xì)胞。見圖1。

圖1 兩組小鼠血涂片分析（Wright-Giemsa染色）

3.4 兩組小鼠骨髓象分析

骨髓涂片結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓異常增生活躍，可見大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，胞質(zhì)染色呈嗜堿性。見圖2。

圖2 兩組小鼠骨髓象分析（Wright-Giemsa染色）

3.5 兩組小鼠肝臟、脾臟病理學(xué)檢測(cè)

與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，邊界不清，肝臟組織中大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞出現(xiàn)水樣變性；脾臟中的淋巴濾泡擴(kuò)大并融合成片，脾臟組織中有大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組結(jié)構(gòu)正常。見圖3、4。

圖3 兩組小鼠肝臟病理學(xué)檢測(cè)（HE染色）

3.6 兩組小鼠骨髓細(xì)胞增值能力檢測(cè)

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓細(xì)胞的增值活力明顯增高(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠骨髓細(xì)胞增值能力的檢測(cè)(n=12，

表2 兩組小鼠骨髓細(xì)胞增值能力的檢測(cè)(n=12，

組別 細(xì)胞活力(%)對(duì)照組 92.15±2.58實(shí)驗(yàn)組 129.12±1.45*

3.7 免疫熒光鑒定骨髓腫瘤細(xì)胞來(lái)源

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組骨髓細(xì)胞熒光明亮且清晰，出現(xiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)，提示實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓細(xì)胞中大量人源白血病細(xì)胞。見圖5。

圖5 免疫熒光鑒定兩組小鼠骨髓中白血病細(xì)胞

4 討論

圖4 兩組小鼠脾臟病理學(xué)檢測(cè)（HE染色）

急性髓系白血病是一種高發(fā)死亡性的惡性血液腫瘤，目前治療白血病的方法主要有化學(xué)藥物治療、放射治療、骨髓移植治療、免疫治療以及靶向性藥物治療等[3]。雖然取得了較好的效果，但是由于機(jī)制研究方面的缺乏，失敗的案例也不在少數(shù)。“探其根源，尋其究竟”，只有從根本上研究白血病的發(fā)病機(jī)制，才能更好的治療白血病。在動(dòng)物模型基礎(chǔ)上研究白血病的發(fā)病機(jī)制和治療方案的優(yōu)化選擇是治療白血病的前提。

急性髓系白血病在人體內(nèi)的機(jī)制十分復(fù)雜，若以人為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，受到多層因素的限制。建立急性髓系白血病動(dòng)物模型，能夠迅速挖掘其發(fā)生機(jī)制，為臨床治療白血病提供新思路。目前多數(shù)研究表明，急性髓系白血病的反復(fù)發(fā)作，是由于患者體內(nèi)的白血病干細(xì)胞未被清除徹底而引起的，采用免疫磁珠分選法將KG-1a細(xì)胞的CD34+CD38-亞群分離出來(lái)，移植入動(dòng)物體內(nèi)可構(gòu)建模型已被逐步證實(shí)[4]。本研究結(jié)果顯示，采用免疫磁珠分選后CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞群純度可高達(dá)(92.45±2.80)%，活性高達(dá)(93.68±1.97)%。

NSG是在NOD-SCID小鼠(非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)基礎(chǔ)上利用對(duì)Rag2和IL2rg雙基因敲除，獲得嚴(yán)重免疫缺陷小鼠，是異種移植的重要載體，對(duì)于研究人類造血干細(xì)胞、腫瘤發(fā)生與治療、免疫缺陷疾病與體內(nèi)免疫機(jī)制研究都具有重要意義；與 NOD/SCID小鼠相比，NSG小鼠的人體細(xì)胞和組織移植存活率顯著提高，同時(shí)能夠植入更高比例的正?；虬┳?nèi)祟惣?xì)胞和組織[5-8]。

本研究通過(guò)尾靜脈移植CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞來(lái)構(gòu)建NSG小鼠急性髓系白血病模型，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠神態(tài)萎靡不振、行走不穩(wěn)、毛發(fā)雜亂，皮膚粗糙，體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組；小鼠骨髓異常增生活躍，可見大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)；肝、脾臟結(jié)構(gòu)被破壞；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)提示小鼠骨髓細(xì)胞中大量人源白血病細(xì)胞。據(jù)此，通過(guò)尾靜脈移植CD34+CD38-KG-1a細(xì)胞可成功構(gòu)建KG-1a/NSG急性髓系白血病小鼠模型，為進(jìn)一步研究白血病提供了有力的支持。