覃文濤，胡陽，謝明凈，吉克以吉，薄占東

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，廣西 南寧 530022)

0 引言

骨肉瘤(osteosarcoma)是骨骼的主要的惡性腫瘤之一[1,2]，在兒童和青少年階段常見，其中15-19歲為高發(fā)年齡，發(fā)病率在每年800-1100萬[3]。骨肉瘤具有很強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者生存率降低，總體生存率僅為30%[4]。盡管目前術(shù)后化療作為治療骨肉瘤患者的主要方式之一，但是化療發(fā)生耐藥后的轉(zhuǎn)移患者預(yù)后極差，5年生存率僅有20%[5]。由于骨肉瘤存在基因異質(zhì)性，在同樣條件下的治療，患者會(huì)有不一樣的臨床療效，導(dǎo)致總體預(yù)后存在差別[6]。因此深入探索骨肉瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，來尋找到特異度高的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志，這對于提高骨肉瘤的臨床治療效果將是至關(guān)重要的。

線粒體核糖體蛋白L48(Mitochondrial Ribosomal Protein L48，MRPL48)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，又稱CGI-118，定位于染色體的11q13.4位置上，由核基因編碼，有助于線粒體內(nèi)合成蛋白質(zhì)。MRPL48可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體內(nèi)的代謝過程來維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)[7]，因此MRPL48基因表達(dá)的改變將會(huì)影響細(xì)胞代謝過程，造成疾病的發(fā)生。目前已經(jīng)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，MRPL48在多種腫瘤中存在差異表達(dá)，并且在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中有著重要的作用。

本研究擬對開放數(shù)據(jù)庫中大量數(shù)據(jù)的挖掘，旨在發(fā)現(xiàn)MRPL48在骨肉瘤中的預(yù)后情況和診斷價(jià)值，通過與臨床病理特征間的相關(guān)性分析，找到臨床上更適用于骨肉瘤治療的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

a、人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)檢索“MRPL48”基因，了解基因的基本信息；b、在人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org/)中分別選用“tissue”和“cell”選項(xiàng)卡，提取MRPL48在各個(gè)組織中的表達(dá)對比和定位情況；c、在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中檢索“Osteosarcoma”，挑選出兩個(gè)數(shù)據(jù)集GSE11416和GSE28424，利用在線分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)進(jìn)行差異分析；d、從加州大學(xué)圣克魯斯分校西納分校(UCSC Xena，https://xena.ucsc.edu/)中下載骨肉瘤患者的普通轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息文件，提取MRPL48基因的表達(dá)量并篩選出生存資料、性別、年齡和是否轉(zhuǎn)移等臨床信息，并對其基因表達(dá)量和這些臨床信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 分析方法

使用Perl軟件(版本5.24.3，https://www.perl.org/)對下載的骨肉瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用人類基因組注釋文件(ENSEMBL，http://asia.ensembl.org/index.html)進(jìn)行注釋，將Ensembl Gene ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol ID；用R軟件(版本3.6.3，https://www.r-project.org/)中的“l(fā)imma”包對重復(fù)基因取均值，最后提取MRPL48基因的表達(dá)矩陣和篩選出含有生存資料的臨床信息文件。

1.2.2 生存分析

a、以MRPL48表達(dá)的中位數(shù)作為劃分高、低表達(dá)組的界限，用R的“survival”包繪制生存曲線，Kaplan-Meir(K-M)法生存分析來鑒定高、低表達(dá)組的總體生存率，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。b、采用單因素Cox回歸分析法對MRPL48在骨肉瘤中的預(yù)后進(jìn)行研究?！皌imeROC”包繪制的受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC)用來檢驗(yàn)MRPL48在骨肉瘤患者1、3、5年的診斷效能。

1.2.3 獨(dú)立預(yù)后分析及臨床性狀的相關(guān)分析

使用R的“survival”包，將MRPL48與性別、年齡和是否轉(zhuǎn)移等臨床病理特征進(jìn)行單因素Cox和多因素Cox回歸分析，在多因素Cox的結(jié)果中，篩選出P＜0.05的因素作為具有獨(dú)立預(yù)后效應(yīng)的因子；用R的“ggpubr”包展示MRPL48在各個(gè)臨床性狀間的表達(dá)關(guān)系，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.4 高、低表達(dá)組的差異分析

用R的”limma”包對MRPL48高、低表達(dá)的兩組進(jìn)行差異分析，篩選出校正后的P值(FDR)小于0.05和差異倍數(shù)對數(shù)的絕對值(|logFC|)大于1的值，這些就是高、低表達(dá)組的差異基因，并用熱圖和火山圖展示差異基因在高、低兩組間表達(dá)的差異，用“corrplot”包繪制差異基因之間的相關(guān)性圖，其中紅色表示正相關(guān)性，綠色表示負(fù)相關(guān)性，點(diǎn)的大小代表相關(guān)性高低。

納米材料科學(xué)發(fā)展非常迅速,每年都會(huì)不斷涌現(xiàn)出新理論、新思路、新觀點(diǎn)、新方法,因此很多教材內(nèi)容極易過時(shí),教師需要及時(shí)更新知識(shí)儲(chǔ)備,篩選適用于研究生教學(xué)的內(nèi)容,保證研究生跟進(jìn)學(xué)科前沿發(fā)展且同時(shí)掌握基礎(chǔ)和有價(jià)值的知識(shí)。

1.2.5 差異基因的功能富集分析

基因本體(gene ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書 (kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路的功能富集分析可以用來描述差異基因的功能，R的“clusterProfiler”包可以實(shí)現(xiàn)差異基因的功能富集分析[8]，以矯正后的P＜0.05作為顯著富集的選擇條件。

1.2.6 基因組富集分析(GSEA)

使用GSEAv4.0.3軟件(http://www.broadinstitute.org/gsea)對高、低表達(dá)組進(jìn)行GSEA分析，并從分子特征數(shù)據(jù)庫(MSigDB，http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb)下載的c2.all.v7.1.symbols.gmt和c5.all.v7.1.symbols.gmt基因集文件，當(dāng)P＜0.05、絕對標(biāo)準(zhǔn)化富集得分(NES)≥1和校正后的P值(FDR)＜0.25時(shí)被認(rèn)為時(shí)顯著富集的基因集。

1.2.7 免疫細(xì)胞打分

a、基于單樣本基因集富集分析(ssGSEA)的免疫浸潤分析 根據(jù)各類免疫細(xì)胞特征標(biāo)志性基因的表達(dá)，在免疫相關(guān)的基因集文件中利用R的“GSVA”包對骨肉瘤的免疫浸潤程度進(jìn)行ssGSEA打分評估。b、利用反卷積的“CIBERSORT”算法估算骨肉瘤每一個(gè)患者的22種浸潤性免疫細(xì)胞的相對含量[9]，這是通過R的“CIBERSORT”包(CIBERSORT的R腳本v1.03，http://cibersort.stanford.edu/)完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用R(3.6.2版本)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kaplan-Meier法用來分析MRPL48表達(dá)與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系，Logrank檢驗(yàn)用于評價(jià)生存曲線；為了找出預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素，將連續(xù)性變量(如年齡)轉(zhuǎn)為二分類變量，方法采用單因素Cox和多因素Cox回歸分析；皮爾遜相關(guān)性分析中，以相關(guān)系數(shù)(Cor)＞0.2，P＜0.05認(rèn)為是具有相關(guān)性；兩組間的數(shù)據(jù)分析采用雙尾t檢驗(yàn)，適當(dāng)?shù)臅r(shí)候用Welcht檢驗(yàn)，所有分析均認(rèn)為P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRPL48及其蛋白在正常組織中的表達(dá)

HPA數(shù)據(jù)庫中，展示了MRPL48及其蛋白在頭、眼、肺和肝臟等16種正常組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MRPL48在頭和肌肉組織中的基因表達(dá)含量最高，而在腎臟和膀胱中其蛋白表達(dá)最多(圖1)。并且MRPL48的免疫熒光圖顯示，其只位于細(xì)胞內(nèi)的線粒體(圖2)。

圖1 MRPL48及其蛋白在正常組織中的表達(dá)情況

圖2 MRPL48蛋白主要分布在細(xì)胞中的線粒體中

2.2 MRPL48在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)

通過GEO2R在線分析工具對 GSE11416和GSE28424進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，MRPL48在各類型骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)有顯著差異，其中GSE11416(logFC=0.46，P＜0.05)，GSE28424(logFC=0.71，P＜0.05)(表1)。

表1 GEO數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞MRPL48的含量差異情況

2.3 MRPL48在骨肉瘤中的預(yù)后關(guān)系及效能評價(jià)

UCSC數(shù)據(jù)庫中，提取到包含完整臨床信息的骨肉瘤患者84例，按照MRPL48表達(dá)的中位數(shù)將其分成高表達(dá)組(n=42)和低表達(dá)組(n=42)，Kaplan Meier生存曲線顯示，MRPL48的表達(dá)水平與骨肉瘤患者生存率具有顯著相關(guān)性，MRPL48高表達(dá)組的生存率明顯低于低表達(dá)組(圖3A)。ROC分析表明，1、3和5年的曲線下面積(AUC)分別為0.831、0.715和0.667，表面MRPL48在骨肉瘤中具有較好的診斷效能(圖3B)。

圖3 MRPL48的預(yù)后及價(jià)值評估

2.4 MRPL48與臨床性狀的聯(lián)系

單因素和多因素Cox回歸分析顯示MRPL48的表達(dá)和腫瘤是否轉(zhuǎn)移是具有獨(dú)立預(yù)后作用的因素(表2)，MRPL48是危險(xiǎn)因素，高表達(dá)會(huì)降低患者生存率[風(fēng)險(xiǎn)比(HR)=2.30，95%的可信區(qū)間(95%CI)：1.02～5.15，P＜0.05]；而非轉(zhuǎn)移成為預(yù)后較好的因素，在對轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移的亞組研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)移的組別中，MRPL48的表達(dá)對預(yù)后有顯著的影響(HR=0.24，95%CI：0.11～0.54，P＜0.001)(圖3C)；而在轉(zhuǎn)移的組別中，對骨肉瘤預(yù)后并沒有顯著的影響(HR=1.19，95%CI：0.45～3.14，P=0.728)(圖3D)。此外MRPL48的表達(dá)在年齡和是否轉(zhuǎn)移組中有顯著差異(圖4)。

圖4 MRPL48在臨床特征值中的表達(dá)情況

表2 MRPL48與骨肉瘤患者臨床信息間的Cox回歸分析結(jié)果

2.5 高低表達(dá)組差異基因的GO和KEGG功能富集分析

符合|logFC|＞1和P＜0.05的差異基因共有26個(gè)，高表達(dá)基因5個(gè)，低表達(dá)的有21個(gè)(圖5A)；聚類分析顯示26個(gè)基因在高低組表達(dá)有顯著的差異(圖5B)。GO富集結(jié)果顯示，差異基因參與了骨骼生長、軟骨細(xì)胞發(fā)育、軟骨內(nèi)骨生長和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組成等生物學(xué)功能(BP)；在細(xì)胞成分(CC)上他們也有參與，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞外基質(zhì)組分和基底膜等；此外他們還參與了分子功能(MF)，包括細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、膠原結(jié)合和糖胺聚糖結(jié)合等(圖6A)。KEGG分析表明差異基因主要富集在PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM-受體相互作用和蛋白吸收等通路(圖6B)。

圖5 MRPL48高、低表達(dá)組的差異分析結(jié)果

圖6 差異基因的GO和KEGG功能富集結(jié)果

2.6 GSEAGSEA富集結(jié)果主要在MRPL48低表達(dá)組呈現(xiàn)，其中C2分子集主要富集在腫瘤微環(huán)境改善、CD28依賴PI3K AKT信號(hào)通路、凝血酶PAR1通路和IL3信號(hào)通道等，C5分子集主要在骨細(xì)胞發(fā)育、軟骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞分化負(fù)調(diào)控以及趨化因子合成等通路上(圖7)。提示MRPL48低表達(dá)組可能在對骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)上減緩骨肉瘤的發(fā)展。

圖7 MRPL48低表達(dá)組的GSEA富集結(jié)果

2.7 免疫浸潤分析

通過使用ssGSEA評分算法，我們估算了免疫細(xì)胞的30個(gè)亞群，在研究MRPL48高、低表達(dá)組中免疫細(xì)胞的差異性時(shí)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和中心粒細(xì)胞在高、低表達(dá)組中存在明顯差異(圖8A)，均表現(xiàn)出MRPL48低表達(dá)組中高表達(dá)，提示巨噬細(xì)胞和中心粒細(xì)胞在骨肉瘤的預(yù)后中起著保護(hù)作用。而在“CIBERSORT”算法對骨肉瘤浸潤的分析的結(jié)果顯示，26種免疫細(xì)胞中樹突狀細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞與MRPL48的表達(dá)有一定的相關(guān)性(圖8B、C、D))，其中樹突狀細(xì)胞(Cor=0.243，P=0.025)和T細(xì)胞(Cor=0.292，P=0.007)顯示成正相關(guān)，M2型巨噬細(xì)胞(Cor=-0.244，P=0.024)顯示呈負(fù)相關(guān)性，這與ssGSEA結(jié)果一致。

3 討論

骨肉瘤作為骨科常見的惡性骨腫瘤，其高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性是造成患者死亡的主要因素，而骨肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制復(fù)雜多樣，是多種原因共同影響的結(jié)果。目前有研究發(fā)現(xiàn)某些基因的表達(dá)異常與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移有很重要的聯(lián)系[10]，并根據(jù)這些異常表達(dá)的基因制定了一些免疫治療靶點(diǎn)，收到較好的臨床效果[11]。因此基因?qū)用鎸侨饬鲞M(jìn)行研究，對于治療骨肉瘤是一個(gè)積極有效的途徑。

MRPL48是位于細(xì)胞內(nèi)線粒體的關(guān)鍵蛋白，參與線粒體內(nèi)能量的代謝，維持機(jī)體許多重要的生命活動(dòng)。有研究表明，將ShMRPL48注入Hela細(xì)胞內(nèi)后發(fā)現(xiàn)熒光顆粒增加，Hela細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量下降，細(xì)胞生長受到明顯的抑制[7]。MRPL48由于維持正常的能量代謝，已被證實(shí)其與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有著十分緊密的聯(lián)系，不僅在代謝綜合征等非腫瘤中有著重要的治療價(jià)值，而且也成為了大腸癌、乳腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌等多種腫瘤的治療靶點(diǎn)。大腸癌中，MRPL48的高表達(dá)可以增加細(xì)胞的耐藥性，進(jìn)而影響患者的生存率[12]；腎上腺皮質(zhì)癌中，MRPL48在良性和惡性腫瘤之間差異也是非常顯著[13]。而目前MRPL48尚未在骨肉瘤中報(bào)道，本研究通過對網(wǎng)絡(luò)公開的大量測序數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)MRPL48與骨肉瘤預(yù)后密切相關(guān)，提示MRPL48有可能成為骨肉瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，MRPL48的高、低表達(dá)在骨肉瘤患者預(yù)后中存在顯著差異，MRPL48的高表達(dá)組患者總體生存率明顯低于低表達(dá)組。在兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中，我們驗(yàn)證了MRPL48在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，提示MRPL48在骨肉瘤病變過程中表達(dá)發(fā)生了改變。在與骨肉瘤臨床性狀的研究上，我們發(fā)現(xiàn)MRPL48和轉(zhuǎn)移是獨(dú)立的預(yù)后因子，且在對轉(zhuǎn)移與否的亞組研究中發(fā)現(xiàn)，MRPL48在轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移的組中的表達(dá)差異顯著，提示MRPL48可能參與了骨肉瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)生。鑒于MRPL48高、低表達(dá)組預(yù)后差異明顯，找到兩組差異基因，并進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示差異基因參與了骨骼生長、軟骨細(xì)胞發(fā)育、軟骨內(nèi)骨生長和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組成等生物功能，這與GSEA中C5基因集富集結(jié)果一致，參與了骨細(xì)胞發(fā)育和軟骨細(xì)胞分化分化，這提示MRPL48低表達(dá)組預(yù)后較好與骨細(xì)胞的發(fā)育和分化有一定的關(guān)系。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤免疫微環(huán)境息息相關(guān)，而腫瘤微環(huán)境中各類免疫細(xì)胞的相對含量決定著腫瘤的狀態(tài)，本研究通過兩種不同算法評估了MRPL48與各種免疫細(xì)胞的關(guān)系，最終發(fā)現(xiàn)，兩類算法結(jié)果均提示M2型巨噬細(xì)胞含量與MRPL48的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。有研究表明巨噬細(xì)胞可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]，而前面研究顯示MRPL48在非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著低于轉(zhuǎn)移組，由免疫浸潤分析可知，非轉(zhuǎn)移組的巨噬細(xì)胞含量是高于轉(zhuǎn)移組的，因此更加進(jìn)一步證實(shí)我們結(jié)論的準(zhǔn)確性，MRPL48在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。

綜上所述，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MRPL48在骨肉瘤中具有良好的預(yù)后以及評估骨肉瘤轉(zhuǎn)移的價(jià)值，可以成為骨肉瘤的潛在治療靶點(diǎn)。但是由于MRPL48在細(xì)胞中的具體作用機(jī)制還尚未清晰，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)揭示其分子間的作用方式，提供完整的理論依據(jù)，以便完善治療策略，以期達(dá)到臨床應(yīng)用。