李路廣 朱立國(guó) 高景華，2 高春雨 王寶劍 魏 戌 尹遜路 李 輝

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院脊柱二科，北京 100102；2.中醫(yī)正骨技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102

退行性腰椎管狹窄癥(DLSS)是指由于黃韌帶增生退變等因素造成椎管、椎間孔或側(cè)隱窩狹窄，壓迫神經(jīng)根或硬膜囊，從而引起以腰腿痛、間歇性跛行為主要臨床癥狀的綜合征[1]。DLSS 好發(fā)于中老年人群，現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響中老年人生活質(zhì)量的公共健康問題[2]。DLSS 治療主要分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療，然而DLSS 患者往往年齡大，全身情況差，手術(shù)耐受力低，因此手術(shù)通常不作為首選治療方案[3]。明確DLSS發(fā)病機(jī)制，采用針對(duì)性藥物治療改善患者的臨床癥狀和延緩腰椎管退變的進(jìn)程，減少患者對(duì)手術(shù)的需求已成為當(dāng)前治療DLSS 的生物學(xué)研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)腰湯出自清代陳士鐸《辨證錄·腰痛門》，該方是治療腰痛病的經(jīng)典古方，以溫腎健脾為本，祛瘀化痰為標(biāo)，治療DLSS效果顯著[4]，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析轉(zhuǎn)腰湯中各成分與DLSS 之間的相互作用關(guān)系，并挖掘網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，系統(tǒng)闡述轉(zhuǎn)腰湯的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，為后續(xù)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 轉(zhuǎn)腰湯活性成分及靶點(diǎn)篩選

使用TCMSP 和BATMAN 中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)[5-6]獲取轉(zhuǎn)腰湯所含化學(xué)成分，以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18 的藥物動(dòng)力學(xué)屬性值對(duì)化合物進(jìn)行篩選，另外根據(jù)文獻(xiàn)[7-9]補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性成分。使用Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)將活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 轉(zhuǎn)腰湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建轉(zhuǎn)腰湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點(diǎn)(node)表示活性成分或靶點(diǎn)，邊(edge)表示兩者之間的關(guān)系。通過Cytoscape 3.7.2 內(nèi)置“network analyzer”功能分析網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)，以研究轉(zhuǎn)腰湯中重要活性成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.3 DLSS 靶點(diǎn)篩選

以“Degenerative Lumbar Stenosis”“Degenerative Lumbar Spinal Stenosis”為檢索詞，通過DisGeNET(https：//www.disgenet.org)、GeneCards(https：//www.genecards.org)和OMIM(http：//www.omim.org)3 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫檢索DLSS 的潛在致病靶點(diǎn)。

1.4 轉(zhuǎn)腰湯治療DLSS 共同靶點(diǎn)篩選

通過Bioinformatics(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制轉(zhuǎn)腰湯活性成分靶點(diǎn)和DLSS 致病靶點(diǎn)的韋恩圖。

1.5 轉(zhuǎn)腰湯成分-DLSS 致病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將轉(zhuǎn)腰湯與DLSS 的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“highest confidence：0.9”，并隱藏游離點(diǎn)，其余均為默認(rèn)設(shè)置，獲得轉(zhuǎn)腰湯治療DLSS 的PPI 網(wǎng)絡(luò)。將“string_interactions.tsv”文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，運(yùn)用“network analyzer”功能進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觥?/p>

1.6 轉(zhuǎn)腰湯成分-DLSS 靶點(diǎn)的GO 富集分析和KEGG分析

借助Metascape(http：//metascape.org)對(duì)轉(zhuǎn)腰湯治療DLSS 的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 分析。GO 詮釋關(guān)鍵靶點(diǎn)治療DLSS 的生物進(jìn)程，包括生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)3 個(gè)部分。KEGG 分析詮釋關(guān)鍵靶點(diǎn)治療DLSS 的主要信號(hào)通路。篩選具有顯著差異的GO 和KEGG，借助ImageGP 平臺(tái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)腰湯活性成分篩選

篩選出轉(zhuǎn)腰湯有效活性成分108 個(gè)，其中白術(shù)7 個(gè)、杜仲28 個(gè)、巴戟天20 個(gè)、防己2 個(gè)、肉桂2 個(gè)、蒼術(shù)9 個(gè)、羌活17 個(gè)、桃仁23 個(gè)。另外文獻(xiàn)補(bǔ)充有效活性成分8 個(gè)(白術(shù)：蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，防己：漢防己甲素、漢防己乙素，肉桂：肉桂醛、肉桂酸)。去掉其中無蛋白靶點(diǎn)的成分和重復(fù)成分，共篩出有效活性成分86 個(gè)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)腰湯主要活性成分

2.2 轉(zhuǎn)腰湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過Cytoscape 3.7.2 對(duì)轉(zhuǎn)腰湯活性成分和作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，獲得271 個(gè)節(jié)點(diǎn)(185 個(gè)靶點(diǎn)和86 個(gè)活性成分)和908 條邊，圖中節(jié)點(diǎn)的大小代表相應(yīng)的Degree 值，節(jié)點(diǎn)越大則Degree 值越大，說明其生物功能越多，重要性越高，見圖1。圖中Degree 值最大的前3 個(gè)化合物包括杜仲中的槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol)，巴戟天、杜仲、防己、桃仁和羌活的共有成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)；Degree 值最大的前3 個(gè)基因PTGS2、PTGS1、NCOA2 是杜仲、巴戟天、防己、肉桂、羌活、桃仁的共同靶點(diǎn)，PTGS2 還是白術(shù)和蒼術(shù)的共同靶點(diǎn)，PTGS1 是蒼術(shù)的靶點(diǎn)，NCOA2是白術(shù)的靶點(diǎn)。

圖1 轉(zhuǎn)腰湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 DLSS 靶點(diǎn)篩選

從DisGeNET、GeneCards 和OMIM 中分別檢索到1 個(gè)、1068 個(gè)和114 個(gè)與DLSS 相關(guān)的致病靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，共納入1168 個(gè)與DLSS 相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

韋恩圖顯示，轉(zhuǎn)腰湯和DLSS 有84 個(gè)共同作用靶點(diǎn)，見圖2。把84 個(gè)交集靶點(diǎn)提交至String，剔除11 個(gè)游離節(jié)點(diǎn)，通過Cytoscape 3.7.2 對(duì)“string_interactions.tsv”文件進(jìn)行分析，圖中節(jié)點(diǎn)顏色深淺、大小和邊顏色深淺、粗細(xì)均與Degree 值相關(guān)，Degree 值大小與生物功能和生物重要性呈正相關(guān)。其中JUN、TNF、AKT1、MAPK1、白介素(IL)-6 等存在較多的交互關(guān)系，見圖3。

圖2 轉(zhuǎn)腰湯成分-退行性腰椎管狹窄癥靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 轉(zhuǎn)腰湯成分-退行性腰椎管狹窄癥靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 富集分析和KEGG 分析

將轉(zhuǎn)腰湯治療DLSS 的靶點(diǎn)上傳至Metascape 進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 分析。根據(jù)-Log10(Qvalue)值排序，選擇具有顯著性差異的GO 生物進(jìn)程和KEGG通路繪制氣泡圖，見圖4(封三)。GO 共有1987 個(gè)富集結(jié)果，其中BP 有1805 個(gè)，主要涉及細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、活性氧代謝過程、細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正調(diào)節(jié)等，見圖4A(封三)；CC 有57 個(gè)，主要涉及膜筏、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、囊腔等，見圖4B(封三)；MF 有125 個(gè)，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等，見圖4C(封三)；KEGG通路142 條，主要有IL-17 信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等，見圖4D(封三)。

圖4 轉(zhuǎn)腰湯主要成分潛在靶點(diǎn)的富集分析(見內(nèi)文第14 頁)

3 討論

DLSS 屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”“腰痛病”的范疇，基于“陽化氣，陰成形”理論，現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為DLSS 多因久病耗傷脾腎陽氣，陽虛則推動(dòng)、溫煦等“陽化氣”功能不足；陽消陰長(zhǎng)，久則水濕、痰瘀之邪積聚，則見黃韌帶肥厚、關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)增生內(nèi)聚等“陰成形”功能失調(diào)；故以溫腎健脾、祛瘀化痰為治法[10]。黃韌帶附著于椎管后壁和外側(cè)壁，其增生退變導(dǎo)致椎管直徑減小是DLSS 發(fā)病的重要原因[3]。近年來中藥復(fù)方治療組織纖維化疾病已展現(xiàn)出較為廣闊的前景，在前期臨床研究中轉(zhuǎn)腰湯治療黃韌帶肥厚型DLSS 取得較好的效果[4，11]。采用現(xiàn)代科學(xué)手段挖掘經(jīng)典古方的科學(xué)內(nèi)涵，明確轉(zhuǎn)腰湯抗纖維化作用的有效成分，通過延緩或抑制黃韌帶纖維化進(jìn)程將成為治療DLSS 的重要手段。

活性成分篩選結(jié)果提示槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚是轉(zhuǎn)腰湯的關(guān)鍵活性成分。Park 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃韌帶纖維化退變與韌帶組織中成纖維細(xì)胞異常增殖和凋亡抑制密切相關(guān)。Ren 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過聯(lián)合抑制mTOR、β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制成纖維細(xì)胞活化。而β-谷甾醇具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，在清除受損細(xì)胞和維持組織器官完整上發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)組織纖維化是導(dǎo)致黃韌帶肥厚的主要病理機(jī)制。研究表明山奈酚可通過MAPK、AKT 等通路途徑抑制IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥因子的表達(dá)[15-16]。

PPI 結(jié)果提示JUN、TNF、AKT1、MAPK1、IL-6 等靶點(diǎn)可能是轉(zhuǎn)腰湯治療DLSS 的關(guān)鍵作用點(diǎn)。Nakama等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在退變的黃韌帶組織中存在細(xì)胞低凋亡率的現(xiàn)象，而激活的c-JUN 可參與誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[18]。腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6 等炎癥細(xì)胞因子刺激是造成黃韌帶肥厚的主要病理誘因，且IL-6 對(duì)TNF-α 的炎癥作用具有放大效應(yīng)[19]。AKT1 作為PI3K/AKT 信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子參與多種組織器官的纖維化進(jìn)程，因此推測(cè)轉(zhuǎn)腰湯可能通過調(diào)控AKT1抑制DLSS 患者黃韌帶的纖維化[20]。盧昌懷等[21]研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK 在肥厚的黃韌帶組織中高度表達(dá)，而MAPK1 是MAPK 通路中的重要蛋白激酶與調(diào)控因子，因此通過調(diào)控MAPK 信號(hào)通路將為黃韌帶肥厚引起的DLSS 提供新的治療思路。

轉(zhuǎn)腰湯治療DLSS 的GO 功能富集分析提示，GO的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、膜筏、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物學(xué)過程。從KEGG 通路結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)腰湯可通過IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控DLSS 的退變進(jìn)程。T 細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子IL-17 可以刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子等多種細(xì)胞因子，從而介導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生[22]。L?hr 等[23]在人肥厚的黃韌帶彈力基質(zhì)區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的存在。另外，當(dāng)IL-17 與受體結(jié)合后，可通過NF-κB、MAPK 等信號(hào)途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[24]。HIF-1 廣泛存在于人體組織器官中。研究表明，HIF-1 信號(hào)通路可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)沉積等發(fā)揮抗纖維化作用[25]。Nayak 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K、AKT 的活性可以降低下游HIF-1α 的表達(dá)，進(jìn)而延緩小鼠腎纖維化進(jìn)程。NF-κB 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種生理病理過程，當(dāng)該通路被持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡異常，另外TNF 作為NF-κB 通路上游的主要刺激信號(hào)，可參與NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的促進(jìn)纖維化進(jìn)程[27]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡釋了轉(zhuǎn)腰湯治療DLSS的藥理機(jī)制，揭示轉(zhuǎn)腰湯可以通過多靶點(diǎn)、多途徑治療DLSS，同時(shí)也為下一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。