楊波若，李華健，蘇婭寧，李 霞，瞿 靜，陳 韜

(云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南昆明650201)

持水性(water-holding capacity，WHC)是肉類生產(chǎn)行業(yè)和消費者共同關(guān)注的問題，常用汁液流失率高低(drip loss)衡量持水性[1-2]。汁液流失率的大小不僅受pH影響，也受鈣激活酶(calpains)活性[3]和關(guān)鍵細胞骨架蛋白降解程度的影響[4]。

研究表明，宰后豬肉的pH下降會抑制μ-calpain的自溶和骨架蛋白降解[5]，從而導致較高的汁液流失[3]。μ-calpain是肌肉向食用肉轉(zhuǎn)化過程中重要的鈣激活酶，宰后μ-calpain被激活，其80 kDa亞基經(jīng)78 kDa亞基形式降解為76 kDa的亞基[6]。常用76 kDa亞基表達量來衡量μ-calpain的活性，76 kDa亞基的表達量越高，酶的自溶程度和活性越高[7]，降解關(guān)鍵骨架蛋白——肌間線蛋白(desmin)的能力就越強。desmin纏繞在肌原纖維的Z盤上并與肌細胞膜直接相連，是維持肌纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有序性和肌細胞穩(wěn)定性的重要骨架蛋白[8]。整聯(lián)蛋白(integrin)是橫貫于細胞膜內(nèi)外的粘附性蛋白[9]，在維持細胞形態(tài)、細胞膜與細胞體彼此附著中起關(guān)鍵作用[10-11]。有報道顯示，宰后肌肉中μ-calpain活性[6]、desmin和integrin的表達量均會影響持水性[12]。Bee等[5]觀察到μ-calpain 80、78 kDa的亞基表達量均與汁液流失率呈顯著正相關(guān)，76 kDa與汁液流失呈顯著負相關(guān)，而張冬怡[13]等報道78 kDa亞基的表達量與汁液流失率呈顯著負相關(guān)，80、76 kDa亞基表達量與汁液流失無顯著性相關(guān)。Zuo等[14]發(fā)現(xiàn)牦牛宰后高汁液流失組中desmin表達量顯著高于低汁液流失組，Zhang等[15]在鵝肉中也發(fā)現(xiàn)desmin降解有利于提高持水性，但Schafer等[16]認為desmin的降解與汁液流失率無關(guān)。Qian等[17]在觀察豬肉持水能力實驗中發(fā)現(xiàn)integrin降解量大持水能力高。但Lawson[12]認為高汁液流失組中，integrin降解量大?？梢姡蘡alpain、desmin和integrin與持水性的關(guān)系還存在爭議。目前，國內(nèi)外學者[18-19]主要通過相關(guān)性分析來解釋pH、μ-calpain及骨架蛋白等自變量與持水性的關(guān)系，并不能完全反映出各變量對持水性的相對重要性。

偏最小二乘回歸分析(Partial least squares regression analysis，PLSR)可排除不顯著變量，篩選出對因變量解釋能力強的自變量[20]。因此，本研究運用PLSR和相關(guān)性分析對μ-calpain、desmin、integrin和pH變化與持水性之間的關(guān)系進行分析，為宰后肉類汁液流失率變化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉樣品 在曲靖市東恒經(jīng)貿(mào)集團食品有限公司屠宰場選取同一批次平均體重在105 kg左右的三元雜交商品肉豬(大河烏豬×夏約克×長白豬)，依照生豬屠宰規(guī)范(GB/T17236-2008)進行宰殺。取右側(cè)第七腰椎段至最后腰椎段背最長肌用塑封袋包裹。依據(jù)背最長肌45 min時的pH和肉色，分別選取疑似蒼白發(fā)軟表面有汁液滲出的肉(Pale，soft exudative，PSE)樣品和正常肉的樣品各10條，依次編號，放置于4 ℃恒溫冷庫內(nèi)，分別于各時間點(45 min，3、9、12、24 h)測定pH和溫度。將各時間點樣品存于-30 ℃冷凍庫保存，后轉(zhuǎn)移置實驗室-80 ℃冰箱中凍藏保存，用于Western blotting蛋白定量分析；脫脂奶粉 武漢博士德生物；牛血清蛋白 分析純，北京索萊寶科技術(shù)公司；十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecylsulfonate，SDS)(分析純)、甘油(分析純)、吐溫-20(分 析 純)、N',N',N',N'-四 甲 基 乙 二 胺(N',N',N',N'-tetramethylethylenediamine，TEMED)(分析純)、β-巰基乙醇(分析純)、N',N'-雙-亞甲叉雙丙烯酰胺(超級純)、乙二胺四乙酸(分析純)、丙烯酰胺(超級純) Amresco公司；超特敏發(fā)光試劑盒碧云天生物有限公司；0.45 μm疏水性轉(zhuǎn)印膜(poly vinylidene fluoride，PVDF)、desmin一 抗(Antidesmin，No.MAB3430)、integrin一抗(Anti-integrin β1D， No.MAB1900)、二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L) Antibody， No.AP181P) Millpore公司；μcalpain一抗(Anti-μ-calpain，No.MA3940) Thermo Scientific公司。

CR-10Plus便攜式色差儀 美能達；Bio Rad Power通用垂直電泳儀電源、轉(zhuǎn)印槽、ChemiDoc化學成像儀系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學有限公司；HI9025C便攜式pH計 意大利哈他；HBMB-96PLUS紫外光酶標儀 北京北方浩博科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 pH、肉色及汁液流率的測定 在4 ℃的冷藏環(huán)境中，將矯正好的便攜式pH計探頭插入待檢測樣品的內(nèi)部，測定宰后45 min，3、9、12和24 h的背最長肌的pH。將肉片平攤于干凈的桌面，用色差儀測定宰后45 min和24 h亮度值L*、紅度值a*和黃度值b*。

參照Honikel等[21]的方法測定汁液流失，具體操作如下：將準備好的樣品切成2.5 cm厚的肉片，用精度為萬分之一的天平稱重，記做W1，稱重后用細鐵絲穿過肉片進行固定，使肌纖維始終保持垂直向下，放置在清潔干燥的聚乙烯薄膜袋中(肉片與袋壁要保持距離，不能接觸袋壁)，扎緊袋口后吊掛于4 ℃冷庫中，24 h后取出肉片再次稱重，記做W2，依據(jù)公式計算汁液流失率。

1.2.2 肌肉中μ-calpain、desmin和integrin表達量測定 全肌肉蛋白提取：參照Lonergan等[22]的方法，稱取切成碎末狀的樣品0.8 g，將其置于裝有10 mL磷酸鈉全肌肉蛋白提取液(2% (w/v) SDS；pH7.0)的離心管內(nèi)進行15 s的低溫勻漿(6500 r/min)后室溫離心20 min取上清液并用酶標儀測定濃度。使用雙蒸水將所有樣品測得蛋白濃度，統(tǒng)一調(diào)至6.4 mg/mL。將調(diào)整好濃度的樣品、上樣緩沖液(25 mmol/L Tris-HC1，3 mmol/L 乙二胺四乙酸，3% (w/v) SDS，30%(v/v) 甘油，0.001% (w/v) 溴酚藍，pH8.0)和β-巰基乙醇按體積比10∶5∶1混合得到全肌肉蛋白溶液。用50 ℃水浴鍋將全肌肉蛋白溶液加熱20 min至變性，待冷卻至室溫將其分裝凍存于-80 ℃冰箱中備用。

SDS-PAGE凝膠制備：參照Zhao[3]等的方法并做修改。μ-calpain使用8%的分離膠(丙烯酰胺：N',N'-雙交叉甲基丙烯酰胺=1∶100， 1% (w/v) SDS，0.1% (v/v) TEMED，0.05% (w/v) APS) 和125 mmol/L Tris·HCl，pH8.8。desmin和integrin均使用10%的分離膠(丙烯酰胺：N，N'-雙交叉甲基丙烯酰胺=1∶100，1% (w/v) SDS，0.1% (v/v) TEMED，0.05% (w/v) APS和500 mmol/L Tris· HCl pH8.8)。μ-calpain、desmin和integrin濃縮膠統(tǒng)一使用5%的濃縮凝膠(丙烯酰胺：N',N'-雙-亞甲基丙烯酰胺=100∶1，1% (w/v) SDS，0.1% (v/v) TEMED，0.1% (w/v) APS和 0.125 mmol/L Tris·HCl pH6.8)。凝膠完成后，用保鮮膜包裹存放于4 ℃冰箱備用。

電泳及轉(zhuǎn)膜：將固定好凝膠板放入電泳緩沖液，從左至右依次向泳道加入預染蛋白Marker 7.5 μL、內(nèi)部標準蛋白(選取本次實驗宰后45 min，L組汁液流失率最低的樣品制備)和不同樣品在各時間點(依次為宰后45 min，3、9、12、24 h)的全肌肉蛋白樣品。μ-calpain和desmin的 上 樣 量 均 為80 μg，integrin為120 μg。設(shè)定濃縮電壓60 V，50 min，分離電壓100 V，1.5 h，進行電泳。電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法在200 mA下進行為時1.5 h的轉(zhuǎn)膜操作，全程在冰浴中進行。

Western blotting：轉(zhuǎn)印完成后，將轉(zhuǎn)印膜放置在用TBST溶液(25 mmol / L Tris pH7.0，0.1%(w/v)吐溫-20，80 mmol / L NaCl)配制的5%的脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉2 h。將封閉好的蛋白膜分別置于對應(yīng)的一抗(用含3%牛血清白蛋白的TBST稀釋)中4 ℃孵育過夜。一抗孵育過夜后，將蛋白膜置于TBST沖洗3×10 min，洗去未結(jié)合的抗體，后轉(zhuǎn)至二抗(用含3%牛血清白蛋白的TBST稀釋)中室溫孵育2 h。二抗孵育完成，后用TBST沖洗3×10 min，洗去未結(jié)合的抗體，完成后將膜放置在ECL化學發(fā)光試劑下顯影并在凝膠成像系統(tǒng)掃描(BIO RAD Chemical XRS++)中曝光，得到蛋白灰度值圖片。用Image J圖像分析軟件測定樣品各個時間點目標蛋白的灰度值，按照Bee等[5]的方法用各個時間的相對灰度值比上標準蛋白樣品的灰度值，得到目標蛋白的相對灰度值，用目標蛋白的相對灰度值來表示肌肉中目標蛋白表達量。其中，μ-calpain的一抗釋比例為1∶2000；desmin的一抗釋比例為1∶1000；integrin的一抗釋比例為1∶800。μ-calpain和desmin的二抗釋比例均為1∶5000，integrin的二抗釋比例為1∶8000。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0進行系統(tǒng)聚類分析、平均值和標準誤計算、獨立樣本t檢驗、單因素ANOVA分析和多重比較。由于宰后各時間點的pH不成正態(tài)分布，因此與pH有關(guān)的相關(guān)性分析均采用Spearman相關(guān)系分析[23]。鑒于PLSR適用于樣本量小且變量可以不符合正太分布的數(shù)據(jù)[24-25]，故使用Unscrambler 10.4軟件進行PLS1回歸分析。使用Microsoft office 2019和Origin 2018進行圖片及表格繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 汁液流失率及肉色

依據(jù)宰后24 h的汁液流失率高低，對樣品進行聚類，當歐氏距離增至10時，可以將樣品分為高汁液流失組(High drip loss；H組，drip loss ≥ 5.01%，n=10)和低汁液流失組(Low drip loss；L組，drip loss ≤4.00%，n=10)(圖1)。H組平均汁液流失率是L組的2.625倍(表1)，極顯著高于L組(P<0.01)。H組宰后45 min的L*極顯著高于L組(P<0.01)，但兩組間的L*、a*、b*值在宰后24 h時均無顯著差異(P>0.05)。

圖1 宰后24 h樣品的汁液流失率聚類分析的樹狀圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis for drip loss of samples at 24 h post-mortem

表1 高低汁液流失率組肉樣的肉質(zhì)指標Table 1 Meat quality index of L-group and H-group

2.2 pH和μ-calpain、desmin、integrin的變化

圖2為 宰 后μ-calpain、desmin和integrin的Western blot的條帶圖。由圖2A可以看出宰后各時間點H組的desmin蛋白條帶均比L組粗、顏色深；在45 min～12 h時，H組的desmin蛋白條帶隨著宰后時間的增加幾乎沒有變化，在24 h時出現(xiàn)明顯降解，而L組的desmin條帶隨著宰后時間的延長而逐漸變淺變細。如圖2B所示，在宰后各時間點，L組的integrin蛋白條帶明顯比H組粗、顏色深，且H組和L組的integrin條帶均會隨著宰后時間的延長逐漸變淺、變小。μ-calpain的Western blot蛋白條帶如圖2C所示，宰后各時間點H組的80 kDa和78 kDa亞基比L組條帶顏色深，76 kDa條帶比L組顏色淺。

圖2 骨架蛋白Western blot結(jié)果Fig.2 Western blot results of cytoskeleton protein

如圖3A所示，宰后45 min～12 h, 兩組的pH均呈直線下降，12～24 h有所回升。宰后45 min～12 h時H組的pH都顯著低于L組(P<0.05)，表明汁液流失率高的樣品pH低。隨時間延長，desmin和integrin出現(xiàn)不同程度的降解。由圖3B所示，相對于宰后9 h，H組desmin在宰后24 h出現(xiàn)顯著降解(P<0.05)但L組在12 h就出現(xiàn)顯著降解(P<0.05)。3～24 h時H組desmin的表達量顯著高于L組(P<0.05)，說明在desmin表達量大的組內(nèi)汁液流失率高，持水性差；45 min、3 h和24 h時H組integrin的表達量顯著低于L組(P<0.05)(圖3C)，表明L組細胞內(nèi)integrin表達量大，肌肉汁液流失率低，持水能力強。宰后μ-calpain發(fā)生自溶，其80 kDa的亞基經(jīng)78 kDa亞基形式降解為76 kDa，76 kDa亞基表達量越高，μ-calpain的活性就越高。如圖3的D、E、F所示，宰后各時間點，兩組的80 kDa亞基表達量差異不顯著(P>0.05)；45 min時H組78 kDa亞基表達量顯著大于L組(P<0.05)；12～24 h時，L組的76 kDa亞基表達量極顯著大于H組(P<0.01)；由此可知宰后12 h和24 h時H組的μcalpain活性低于L組。

2.3 相關(guān)性分析

如表2所示，在各個時間點，desmin的表達量與pH呈負相關(guān)但不顯著(P>0.05)。integrin與pH整體呈正相關(guān)，其中在45 min時integrin的表達量與宰后9 h和12 h的pH呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；在12 h時，與宰后9 h和24 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；在24 h時，與宰后9 h和12 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。μ-calpain80、78 kDa亞基的表達量與pH整體呈負相關(guān)，而76 kDa與之相反。在45 min時μ-calpain 76 kDa亞基的表達量與宰后9 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；在3 h時，與宰后12 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；在9 h時，與宰后12 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。μ-calpain 76 kDa亞基表達量越高，μcalpain的活性就越高。因μ-calpain76 kDa表達量整體與pH呈正相關(guān)，故μ-calpain活性整體與pH呈正相關(guān)。

宰后汁液流失率與24 h時desmin的表達量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與45 min、12 h和24 h時的integrin表達量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與9 h時μ-calpain 80 kDa亞基表達量、45 min和12 h時μcalpain 78 kDa亞基表達量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與45 min和9 h時μ-calpain 76 kDa亞基表達量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。表明宰后肌肉內(nèi)desmin表達量越多，汁液流失率越高；integrin的表達量越高，汁液流失率越低；μ-calpain76 kDa亞基表達量越高，μcalpain活性越高，汁液流失率越低。

2.4 最小偏二乘回歸分析模型構(gòu)建

通過建立PLS1回歸模型，分析μ-calpain、desmin、integrin和pH變化對汁液流失率的影響。如圖4所示，汁液流失率與宰后各時間點的pH呈現(xiàn)顯著負相關(guān)(P<0.05)；與45 min、3 h和12 h的integrin表達量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；與24 h的desmin表達量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；與45 min～12 h的μ-calpain 80 kDa、45 min的μ-calpain 78 kDa亞基的表達量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；與45 min的76 kDa亞基呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)。說明宰后低pH會導致較高的汁液流失率；肌肉中desmin表達量越多，汁液流失率越高，與之相反的是與肌肉中integrin和μ-calpain 76 kDa亞基(μ-calpain活性)的表達量越高，汁液流失率越低。

圖3 宰后不同汁液流失組pH(A)、desmin(B)、integrin(C)、μ-calpain 80 kDa(D)、78 kDa(E)、76kDa(F)的表達量變化Fig.3 Changes in pH (A)，desmin (B)，integrin (C) and μ-calpain 80 kDa (D), 78 kDa (E), 76 kDa (F) expression levels in different drip loss groups post-mortem

表2 μ-calpain、desmin和integrin與pH和汁液流失率的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of μ-calpain, desmin and integrin with pH and drip loss

續(xù)表2

圖4 pH、desmin(D)、integrin(I)、μ-calpain 80 kDa(80 k)、μ-calpain 78 kDa(78 k)、μ-calpain 76 kDa(76 k)與汁液流失率的PLS1模型分析Fig.4 PLS1 model of explained variance for drip loss by pH，desmin (D)，integrin (I)，μ-calpain 80 kDa (80 k),μ-calpain 78 kDa (78 k), μ-calpain76 kDa(76 k)

表3為宰后μ-calpain、demsin、integrin和pH的變化對汁液流失率解釋能力的PLS1模型。結(jié)果顯示：pH作為單變量時對汁液流失的解釋能力最強，主要受宰后3 h的pH控制，解釋了78.1%的汁液流失變異；μ-calpain、desmin和integrin的表達量分別解釋了42.4%、70.3%和71.7%的汁液流失變異。為明確宰后μ-calpain、desmin和integrin三者共同對汁液流失率的影響，將這三個自變量與汁液流失率構(gòu)建PLS1回歸模型(見表3中模型5)，該模型主要由宰后9 h和24 h時的desmin和45 min、12 h和24 h 時integrin的表達量控制，解釋了88.1%的汁液流失變異率。隨后排除不顯著變量得到模型6，該模型主要受宰后45 min的desmin和integrin的表達量控制。與模型5相比，模型6的解釋能力下降了7.2%說明宰后12 h的μ-calpain76 kDa表達量對汁液流失的影響也十分重要。

3 討論

宰后45 min～12 h，H組樣品的pH顯著低于L組(P<0.05)(圖3A)且與汁液流失呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)(P<0.01)(表2)，說明pH越低，汁液流失越高，持水性越差，這與Bowker[26]等的報道一致。同時PLS1模型顯示pH的變化解釋了汁液流失變異的78.1%，進一步證實pH是影響豬肉汁液流失率的關(guān)鍵因素。

宰后H組的desmin(3～24 h)表達量高于低L組(P<0.05)，μ-calpain的活性(12 h和24 h)和pH(45 min～12 h)顯 著 低 于L組(P<0.05)，且desmin的表達量與汁液流失呈正相關(guān)(P<0.05)，pH與μ-calpain活性呈正相關(guān)(P<0.05)。這表明宰后H組的低pH抑制了μ-calpain活性，使μ-calpain對desmin的降解能力減弱[27]。僵直期，大量的desmin可以使肌原纖維橫向收縮的力傳遞至整個肌細胞，導致肌細胞橫向收縮，使肌細胞間間隙增加，導致高汁液流失[28]。H組的integrin(45 min、3 h和24 h)表達量低于L組(P<0.05)，且integrin的表達量與pH呈正相關(guān)，與汁液流失率呈負相關(guān)。這可能是因為宰后較低的pH會促使integrin發(fā)生降解，從而導致高汁液流失[6]。如果細胞內(nèi)integrin大量降解則會導致細胞膜的黏附結(jié)構(gòu)被破壞[29]，細胞膜剝離細胞體，在細胞膜與細胞體之間形成間隙，造成汁液流失[12]。從μ-calpain、desmin和integrin與汁液流失的PLS1模型(表3模型5)中發(fā)現(xiàn)，宰后汁液流失率主要受到宰后μ-calpain76 kDa12h、desmin9h+24h和integrin45min+12h+24h的表達量控制，這可能是因為宰后μ-calpain活性低，降解desmin的能力低，細胞內(nèi)desmin表達量高可能在細胞間形成較大的間隙，促使汁液流失形成；完整的integrin在維持細胞膜黏附結(jié)構(gòu)完整性上起重要作用，如果integrin的表達量低，細胞膜與細胞體之間就形成間隙且汁液流失增加。

表3 測量參數(shù)(μ-calpain76 kDa、pH、desmin、integrin)(X-變量)對汁液流失率(Y-變量)解釋能力的PLS1模型Table 3 PLS1 models of explained variance for drip loss (Y-variable) by the measurement traits(μ-calpain76 kDa, pH, desmin, integrin) (X-variable)

4 結(jié)論

宰后pH變化可能通過影響μ-calpain活性、desmin和integrin的表達量，從而對汁液流失產(chǎn)生影響。宰后肌細胞內(nèi)的demsin表達量高可能在細胞間形成較大的間隙，促使高汁液流失形成；integrin表達量低可能在細胞膜與細胞體之間形成較大的間隙，造成更高的汁液流失。鑒于本次實驗只觀測到宰后24 h內(nèi)的變化，24 h后的變化需要進一步研究。