魏 倩， 周際海,2， 程雙懷， 黃永杰， 張 杰， 周守標

(1.安徽師范大學 生命科學學院 安徽省重要生物資源保護與利用研究重點實驗室, 安徽 蕪湖 241000;2.南昌工程學院 江西省退化生態(tài)系統(tǒng)修復與流域生態(tài)水文重點實驗室, 江西 南昌 330099)

科學技術和現(xiàn)代工業(yè)的飛速發(fā)展，致使人們對石油的需求量越來越高。隨著石油開采量的日益上升，在石油開采、運輸過程中產(chǎn)生了大量泄漏物和排出物，造成了嚴重的土壤石油污染。此外，工業(yè)生產(chǎn)過程中含重金屬的廢棄物排放使土壤中的重金屬含量增加，同時農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中化肥及農(nóng)藥的不當使用也會造成土壤污染[1-2]。石油、重金屬導致的土壤污染問題亟待解決?，F(xiàn)今對污染土壤的修復主要有3類方法，分別為物理修復、化學修復和生物修復。物理修復和化學修復雖然效果明顯，但容易造成二次污染，生物修復中的植物修復不僅成本低而且具有良好的生態(tài)效應因此獲得較多的應用[3-5]。植物修復是利用某些特殊植物的耐受作用，種植在受污染的土壤中，在其自身生長的過程中利用植物的根系，吸收、富集并移除土壤中的有機和無機污染物[6-8]。多年生黑麥草(Loliumperenne)作為水土保持的先鋒植物，其以生長快，根系發(fā)達，對外界的脅迫具有較好耐受適應性而被經(jīng)常用來研究在脅迫條件下的生理響應[9]。目前，有很多利用植物修復污染土壤的研究。比如，紫花苜蓿(Medicagosativa)在不同濃度重金屬污染的土壤中，隨著紫花苜蓿的生長，土壤中重金屬含量呈現(xiàn)逐步減少的趨勢；紅三葉草(Trifoliumpretense)在修復石油污染土壤的后期生物量增大，土壤中總石油烴含量(TPH)降低。證明植物對重金屬污染、石油污染土壤具有修復作用[10-11]。眾所周知，根系在植物生長過程中具有重要作用，其中根系形態(tài)特征與植物利用土壤養(yǎng)分的效率密切相關。有研究[12]表明，車前草在Cu，Ni污染條件下，根部重金屬的累積量大于葉片，生物量和葉綠素含量減小；也有研究[13]發(fā)現(xiàn)在石油污染土壤中種植牧草，牧草的發(fā)芽率和生物量均降低，但土壤中石油的的降解率提高。根系的吸收作用能夠使土壤中重金屬、石油等污染物的含量明顯減少[14-15]，這對于土壤污染的研究與修復具有重大意義。雖然利用植物修復污染土壤的研究較多，但是關于植物根系形態(tài)及生長變化在污染土壤修復的研究中報道較少。基于此，本研究模擬重金屬、石油及重金屬—石油復合污染，通過室內(nèi)盆栽試驗，種植黑麥草，分別對不同類型土壤污染下黑麥草的根系形態(tài)、生物量及色素含量的變化進行分析，旨在探討黑麥草在不同類型污染下的生理生化響應，為植物修復單一污染及復合污染土壤提供初步的植物生理生化機理研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

①供試土壤。2019年3月10日在長江南岸沖積地潮土采集土樣(南京雨花臺區(qū)橋板鎮(zhèn))。用取土器取樣，取0—20 cm的土壤，裝進自封袋中帶回實驗室，去除砂石及大顆粒物后過2 mm篩，貯存在4 ℃的冰箱內(nèi)備用。供試土壤質(zhì)地為砂質(zhì)壤土。土壤基本理化性質(zhì)為：pH值為6.43，有機碳10.87 g/kg，全氮0.89 g/kg，硝態(tài)氮27.17 mg/kg，銨態(tài)氮5.42 mg/kg，鎘0.196 mg/kg，鉛為4.52 mg/kg。 ②供試植物。多年生黑麥草(Loliumperenne)，黑麥草種子采購自江蘇省農(nóng)科院。 ③化學試劑。石油來源于中國石化金南油田。PbCl2，CdCl2·4H2O等其他所用試劑均為分析純，純度>99.5%。

1.2 試驗設計

本研究共設置4個處理： ①未污染土壤，種植黑麥草(未污染處理，SH)； ②土壤中添加鉛、鎘并種植黑麥草(SGH)； ③土壤中添加石油并種植黑麥草(SPH)； ④土壤中添加鉛、鎘及石油并種植黑麥草(SPGH)。土壤污染物濃度設定依據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量—建設用地土壤污染風險管控標準試行》[16]?？紤]到土壤污染的實際問題，石油污染物依據(jù)建設用地的篩選值第一類做參考，石油污染物濃度設為1 000 mg/kg干土；鉛、鎘污染嚴重，鉛、鎘的污染濃度依據(jù)管控值的第一類用地標準設置，鎘為50 mg/kg干土，鉛為500 mg/kg干土。石油、重金屬污染土壤的制備參考程坤等人的方法[17]。

盆栽試驗：依據(jù)試驗設計，于2019年3月20日將不同類型污染土壤過2 mm篩后，分裝到塑料花盆(高12 cm，上下直徑為10 cm和8 cm)中，每盆200 g土壤(干土重)，共4個處理，每個處理12盆，放于光照試驗臺上培養(yǎng)；放置2 d后，播種黑麥草種子。播種前對黑麥草種子進行表面消毒(浸泡在10%的過氧化氫中20 min)，消毒后用蒸餾水漂洗3次。每盆播種80粒黑麥草種子，待種子萌發(fā)后間苗至50株。植物生長期間通過每天稱重來保持含水量為田間最大持水量的60%。培養(yǎng)期間保持室內(nèi)溫度25～30 ℃，每天間歇光照14 h，黑暗10 h，光照強度為4 500～7 300 lx，定期隨機更換盆栽的位置以減少試驗誤差。并于播種后10，20，40和80 d進行破壞性采樣。每次采樣隨機選取每個處理的3盆作為3個重復。

1.3 測定方法

1.3.1 植物根系形態(tài)與生物量測定 在培養(yǎng)期的10，20，40，80 d時采樣，采樣時剪掉塑料花盆，直接用自來水淋洗30 min，淋洗至黑麥草根系無土壤，再充分清洗干凈后用蒸餾水沖洗2～3次，用吸水紙吸干水分，將植物地上部與根部分開，黑麥草根部采用根系分析系統(tǒng)(WINRHIZO)，對根系的根長、根表面積、根直徑和根體積等進行掃描分析(掃描圖片色彩為黑白，分辨率為12 800×12 800 dpi)。根系分析完成后，對地上部和根部于105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重，分別稱量地上部和根部的重量(精確值0.000 1 g)。

1.3.2 色素含量測定 在80 d破壞性采樣時，對黑麥草的葉片進行色素含量的測定。用丙酮—乙醇混合(1∶1)浸提法[18]測定光合色素含量，并計算出葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素及葉綠素a+b的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性檢驗用LSD法(p<0.05)；對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與作圖。

2 結果與分析

2.1 不同類型土壤污染對黑麥草根系形態(tài)的影響

黑麥草生長期間，各處理的根系根長呈現(xiàn)增長的趨勢，石油污染處理的根系根長一直大于未污染處理，重金屬污染處理與未污染處理相比呈現(xiàn)出先減小后增加再減小，石油及重金屬復合污染處理與未污染處理相比呈現(xiàn)出先增加后減小(圖1)。10 d時，重金屬污染處理與未污染處理間無顯著差異(p>0.05)，石油污染處理、石油及重金屬復合污染與未污染處理間差異顯著，石油污染處理、石油及重金屬污染處理顯著增加了約50.70%，33.50%。20 d時，培養(yǎng)時間增加根系增長，其中石油及重金屬復合污染根長顯著增加，與未污染處理相比，顯著增長了約88.10%，石油及重金屬污染物的復合作用促進了黑麥草根系根長的伸長。40 d時，根長在污染條件下增加，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的根長均大于未污染處理，3個污染處理組分別增加了約26.50%，26.20%，5.20%。80 d時，石油污染處理的根系根長顯著大于未污染處理，顯著增加了約26.20%；其他兩個處理的根長低于未污染處理。

黑麥草生長期間，未污染處理的根表面積呈現(xiàn)增加的趨勢，石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的根系表面積均大于未污染處理；重金屬污染處理與未污染處理相比，呈現(xiàn)出先減少后增加再減少的趨勢(圖1)。10 d時，各污染處理與未污染處理間差異顯著(p<0.05)，石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理顯著大于未污染處理，分別顯著增加了約52.40%，29.50%，重金屬污染顯著減少了約16.50%。20 d時，石油及重金屬復合污染與其他處理間差異顯著，與未污染處理相比，顯著增加了約148.60%，約是未污染處理的1.5倍，黑麥草的根系表面積在石油及重金屬復合污染條件下增加。40 d時，3個污染處理均大于未污染處理，而重金屬污染處理與未污染處理間差異顯著，顯著增加了約37.80%。80 d時，石油污染處理與各處理間差異顯著，且顯著大于未污染處理，顯著增加了約24.40%。黑麥草生長期間，各處理的根系體積呈現(xiàn)出增加的趨勢，未污染處理的根系體積呈增加的趨勢，石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的根系體積一直大于未污染處理，重金屬污染處理的根系表面積與未污染處理相比呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(圖1)。10 d時，石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理與未污染處理和重金屬污染處理間差異顯著，與未污染處理相比，石油污染處理、石油及重金屬污染處理顯著增加了約52.50%，24.30%。20 d時，石油及重金屬污染處理與未污染處理間差異顯著，顯著增加了約221.90%，是未污染處理的2.2倍；而石油污染處理和重金屬污染處理均低于未污染處理。40 d時，重金屬污染處理的根系體積顯著增加，大于其他3個處理，與未污染處理相比，顯著增加了約51.90%，其他兩個污染處理的根系體積也均大于未污染處理。80 d時，3個污染處理的根系體積均大于未污染處理，其中石油污染處理組根系體積最大，增長了約24.30%。黑麥草生長期間，未污染處理的根系直徑呈現(xiàn)出增加的趨勢，重金屬污染處理、石油及重金屬復合污染處理與未污染處理相比，呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢，石油污染處理呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(圖1)。10 d時，各處理間的根系直徑間無顯著差異，4個處理間根系直徑生長指標大致相同。20 d時，石油及重金屬污染處理的根系直徑顯著大于其他三組處理；與未污染處理相比，石油及重金屬污染處理的根系直徑顯著增加了約32.20%，石油污染處理與重金屬污染處理減少了約9.20%和10.40%。40 d時，重金屬污染處理的根系直徑與石油污染處理間差異顯著，且重金屬污染處理的根系直徑大于其他三組處理。80 d時，各處理間無顯著差異，重金屬污染處理、石油及重金屬復合污染處理大于未污染處理，增加了約11.34%和4.0%，石油污染處理小于未污染處理，減少了約1.80%。

注：SH表示未污染土壤+黑麥草，SGH表示重金屬污染土壤+黑麥草，SPH表示石油污染土壤+黑麥草，SPGH表示石油重金屬混合污染土壤+黑麥草；不同小寫字母表示同一采樣時間內(nèi)不同處理間存在顯著差異(p<0.05)。下同。

2.2 不同類型土壤污染條件下黑麥草生物量(干重)的變化

隨著黑麥草生長時間的增加，各處理的地下生物量呈現(xiàn)出增加的趨勢(表1)。10 d時，石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理均顯著大于未污染處理，顯著增加了約73.79%和89.00%。20 d時，石油及重金屬復合處理顯著大于其他三組處理，與未污染處理相比，顯著增加了約169.37%，石油及重金屬復合處理的地下生物量約是未污染處理的3倍。40 d時，各處理間無顯著差異，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的地下生物量均小于未污染處理，分別減少了約13.43%，12.45%和2.0%。80 d時，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的地下生物量均顯著小于未污染處理，分別顯著減少約了25.46%，50.76%和34.69%。

表1 不同土壤污染條件下黑麥草地下生物量、地上生物量和總生物量的變化

隨著黑麥草生長時間的增加，各處理的地上生物量呈現(xiàn)出增加的趨勢，且不同污染類型處理的地上生物量均小于未污染處理(表1)。10 d時，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理間的地上生物量均顯著低于未污染處理，分別顯著減少了約33.85%，25.78%和34.68%；生長前10 d，各處理的地上生物量表現(xiàn)為：SH >SPH >SPGH >SGH。20 d時，未污染處理與重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理間無顯著差異，但重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的地上生物量均低于未污染處理，分別減少了約10.79%，44.64%和20.89%。40 d時，各處理間的地上生物量差異顯著，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理與未污染處理相比分別顯著減少了約43.29%，27.97%和45.42%。80 d時，各處理間的地上生物量差異顯著，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理與未污染處理相比分別顯著減少了約28.08%，39.51%和58.02%。在生長的20 d后，各處理的地上生物量表現(xiàn)為：SH>SGH>SPH>SPGH。由表1可以看出，各處理的黑麥草的總生物量隨生長時間的變化呈現(xiàn)增加的趨勢。10 d時，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的黑麥草總生物量與未污染處理間無顯著差異，各處理間總生物量表現(xiàn)為：SPGH>SPH>SH>SGH。20 d時，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的黑麥草總生物量與未污染處理間無顯著差異，各處理間總生物量表現(xiàn)為：SGH>SH>SPGH>SPH。40 d時，重金屬污染處理、石油及重金屬復合污染處理與未污染處理間差異顯著，與未污染處理相比，重金屬污染處理、石油及重金屬復合污染處理的黑麥草的總生物量分別顯著降低了約31.98%和28.96%。80 d時，重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理與未污染處理相比分別顯著減少了約26.85%，44.84%和47.00%，各處理的總生物量表現(xiàn)為：SH>SGH>SPH>SPGH。

2.3 不同類型土壤污染條件下黑麥草葉片色素含量的變化

圖2顯示的是不同類型土壤污染條件下黑麥草葉綠素及其他色素含量的變化。由圖2可知，各處理的葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素及葉綠素a+b的含量均低于未污染處理。與未污染處理相比，石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的葉綠素a含量分別顯著減少了約41.22%和37.09%，重金屬污染處理減少了約10.54%。重金屬污染處理、石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的葉綠素b含量與未污染處理相比，分別減少了約16.46%，34.52%和44.56%，其中石油及重金屬復合污染處理與未污染處理間差異顯著，石油及重金屬復合污染對黑麥草葉綠素b含量的影響最大。石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的類胡蘿卜素含量與未污染處理相比，分別顯著減少了約43.97%和46.72%。石油污染處理、石油及重金屬復合污染處理的葉綠素a+b含量與未污染處理相比，分別顯著減少了約39.16%和39.22%，且石油污染處理和石油及重金屬復合污染處理間無顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)石油及重金屬復合污染對類胡蘿卜素和葉綠素a+b影響最大，石油污染處理次之。

圖2 不同土壤污染條件下黑麥草葉綠素及色素含量的變化情況

2.4 黑麥草根系、生物量及葉片色素含量間相關性

表2為黑麥草根系各指標、生物量、葉片色素含量的相關性。由表2可知，黑麥草根系根長與葉綠素b含量呈極顯著負相關(p<0.01)，與葉綠素a、類胡蘿卜素、葉綠素總和呈顯著負相關(p<0.05)，根系表面積與根系體積呈極顯著正相關(p<0.01)，與根系直徑呈顯著正相關(p<0.05)，根系直徑與根系體積呈極顯著正相關(p<0.01)；黑麥草地上生物量與類胡蘿卜素呈顯著正相關，地下生物量與總生物量呈顯著正相關(p<0.05)；葉綠素a與葉綠素b含量呈顯著正相關(p<0.05)，與類胡蘿卜素、葉綠素總量呈極顯著正相關(p<0.01)；葉綠素b與類胡蘿卜素、葉綠素總量呈極顯著正相關，類胡蘿卜素與葉綠素總量呈極顯著正相關(p<0.01)。

表2 黑麥草根系各指標、生物量、葉片色素含量間的相關性

3 討論與結論

一般認為，植物根系的變化，是判斷植物自身生長的一個重要指標。本研究通過黑麥草根系的根長、根表面積、根直徑和根體積來探究重金屬污染、石油污染、石油及重金屬復合污染對植物生長的影響。隨著生長時間的增加，各處理的黑麥草植株根系變化趨勢大致相同。20 d時，石油及重金屬復合污染處理各個根系指標均大于其他處理，主要是由于石油特殊的物理性質(zhì)—疏水性，導致石油污染物進入土壤后，在根系的土壤中形成乳濁液[19-20]，不利于根系吸收水分，抑制了植物根系對養(yǎng)分的吸收。在石油污染物的脅迫作用下，黑麥草根系為了吸收營養(yǎng)物質(zhì)而促進了根系的伸長、增生，最終使石油污染處理的根系生長大于其他處理。石油、重金屬單一污染處理的黑麥草根系變化與石油及重金屬復合污染條件下的變化不完全相同，是因為石油、重金屬污染性質(zhì)存在差異，對黑麥草根系形態(tài)的影響也會出現(xiàn)不同。整體來看，石油重金屬復合污染大于未污染處理，根系各指標在生長前期大于未污染處理，在生長后期，與未污染處理間差異減小。由于污染物的脅迫作用，影響了黑麥草對營養(yǎng)物質(zhì)和水分的吸收，黑麥草為了維持生長，導致根系出現(xiàn)代償性增生，使黑麥草的根系根長、根系表面積、根系直徑、根系體積增加，促進對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，以維持黑麥草的生長。有研究發(fā)現(xiàn)蠶豆(Viciafaba)、續(xù)斷菊(Sonchusasper)等耐受植物根系在重金屬脅迫下根系根長減小，根系表面積增大[21-24]。這與我們的研究有些不同，主要是不同的植物本身的生長特性，以及對污染物的敏感度不同造成的。本研究發(fā)現(xiàn)，石油污染與重金屬污染對黑麥草根系的影響差異較大，石油及重金屬復合污染與石油污染對黑麥草根系的影響也不同，是因為石油和重金屬污染的性質(zhì)不同，對黑麥草生長的影響也就出現(xiàn)差異，同時石油還會影響黑麥草根系對土壤水分的吸收，進而對黑麥草的生長影響更大。

植物生物量的變化也是判斷植物生長情況的一個重要指標。植物在石油和重金屬脅迫作用下，生長會受到抑制，使其生物量下降[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，在黑麥草生長前期，由于石油及重金屬的脅迫作用，阻礙了黑麥草對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，植物根系在脅迫作用下代償性增生，促使黑麥草地下生物量增加；黑麥草生長后期，由于脅迫時間增加，阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與運輸，導致黑麥草的生長逐漸減弱，黑麥草的生長受到抑制，地下生物量降低。在整個培養(yǎng)期內(nèi)，3個污染處理的地上生物量均低于未污染處理，主要可歸因為根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收降低，抑制了根系向地上部分運輸營養(yǎng)物質(zhì)，限制了黑麥草地上部的正常生長，使地上生物量減少[27]。隨著時間增加，污染土壤的黑麥草總生物量小于未污染處理，可歸因為重金屬污染、石油污染及石油—重金屬復合污染的毒害作用抑制了黑麥草根部對水分及其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與運輸而使植物的生長減弱，導致黑麥草生物量減少。

植物葉綠素含量的變化，是反映植物生長的一個重要因素。葉綠素含量的多少可以間接反映出植物受脅迫的程度[28]。本研究表明，重金屬污染、石油污染、石油及重金屬復合污染處理的葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量及葉綠素a+b含量均顯著低于未污染處理，說明重金屬、石油及其復合污染都影響植物色素的合成，這和前人的研究結果一致[29-30]。有研究表明，在重金屬脅迫下，葉綠素的含量先上升后下降[31]，也有研究顯示在鎘含量增加的情況下，植物體內(nèi)的光合色素含量減少[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在各污染處理條件下的黑麥草葉綠素及其他色素含量均降低，可歸因為重金屬污染處理可使葉綠素合成過程中的金屬離子形態(tài)發(fā)生變化，影響葉綠素的合成，使葉綠素含量減少[32-33]。石油污染處理的黑麥草的葉綠素含量小于重金屬污染處理的葉綠素含量，可能是由于石油的疏水性，使黑麥草根系吸水困難，吸收水分減少而導致葉綠素的合成減弱，色素合成量降低。本研究發(fā)現(xiàn)，單一污染會使黑麥草的葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量及葉綠素a+b含量降低，石油與重金屬復合污染存在協(xié)同作用，進一步加劇了對黑麥草的脅迫作用，從而影響了黑麥草的葉綠素的合成，使色素含量降低。黑麥草根系根長與色素含量間呈顯著負相關(表2)，表明污染脅迫增加了根系的根長，但污染脅迫還是影響了黑麥草對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導致色素的合成減少。黑麥草類胡蘿卜素含量與地上生物量呈顯著正相關，各色素含量間也存在顯著正相關，表明在不同污染物脅迫影響下，黑麥草各生長指標間也存在著相互影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)石油、重金屬及石油—重金屬復合污染處理促進了黑麥草根系的根長、根表面積、根體積、根直徑的增加。污染條件下黑麥草地下部生物量增長速度在培養(yǎng)期內(nèi)呈現(xiàn)先快后慢的趨勢，對地上部分生物量的增加起到抑制作用，同時使黑麥草葉片的色素含量降低?？傮w來看，石油—重金屬復合污染對黑麥草的根系形態(tài)、生長影響最顯著，石油污染次之，重金屬污染最小?；诖?，可通過監(jiān)測黑麥草的生物量及色素含量來推測土壤是否污染，也可在污染土壤修復過程中，針對不同污染類型，采取相應措施，如添加調(diào)理劑、施用營養(yǎng)素等來緩解污染物對植物的脅迫，調(diào)節(jié)植物的生長，促進植物對土壤污染的修復能力，為植物修復污染土壤提供了新的視角。