劉 娟 謝成彬 蘇 喆 王頻佳

1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川成都 610500；2.四川省婦幼保健院 成都醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610045

蠟樣芽胞桿菌是一種革蘭陽(yáng)性桿菌，可以產(chǎn)生大量能形成孔和破壞膜的毒素和酶[1-2]，與腹瀉有關(guān)的毒素主要包括溶血素BL(HBL)、非溶血性腸毒素(NHE)、細(xì)胞毒素K(cytK)、腸毒素FM(entFM)和腸毒素T(bceT)等，而與嘔吐相關(guān)的毒素則主要是致嘔吐毒素cereulide[3]，相關(guān)的基因有EM1 等[4]。該菌是食物中毒(food poisoning，F(xiàn)P)的常見(jiàn)病原菌，也是血流感染(bloodstream infection，BSI)[5-6]、肺炎[7]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[8]等的重要致病菌。已有研究報(bào)告分析了該菌血流感染的危險(xiǎn)因素[9-12]，但關(guān)于BSI 來(lái)源菌株的分子生物學(xué)特征卻鮮有報(bào)道。本研究分析了兒童BSI 來(lái)源菌株的分子生物學(xué)特征，并與FP 來(lái)源菌株進(jìn)行比較，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該菌的生物學(xué)特征，為該菌血流感染的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

2015 年1 月—2019 年6 月從四川省婦幼保健院住院患兒血培養(yǎng)中分離到18 株蠟樣芽胞桿菌，從食物中毒患者糞便中分離到21 株(15 株來(lái)自四川省婦幼保健院，6 株由四川省疾控中心惠贈(zèng))。所有菌株經(jīng)生化鑒定和質(zhì)譜檢測(cè)確定為蠟樣芽胞桿菌。BSI 來(lái)源菌株的納入標(biāo)準(zhǔn)：1 d 內(nèi)采集的兩瓶血培養(yǎng)均為陽(yáng)性或者連續(xù)兩次血培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果一致。

1.2 主要儀器和試劑

全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；PCR 儀、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)；芽胞桿菌檢測(cè)試劑盒(105-007620-00，湖南長(zhǎng)沙天地人生物科技有限公司)；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒[DP302，天根生化科技(北京)有限公司]；PCR 試劑(TP001，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗(yàn) 使用芽胞桿菌檢測(cè)試劑盒，采用微量肉湯稀釋法對(duì)14 種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)《不常見(jiàn)或苛養(yǎng)菌藥敏試驗(yàn)(M45-A3)》[13]。

1.3.2 毒力基因檢測(cè) 各菌株用LB 肉湯復(fù)蘇后，按照試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA。參照文獻(xiàn)[14]合成10 種毒力基因的引物。PCR 反應(yīng)體系20 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)1 μL，2×PCR Mix 10 μL，滅菌ddH2O2補(bǔ)足體積。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性2 min，98℃10 s，60℃15 s，72℃15 s，30 個(gè)循環(huán)，72℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。

1.3.3 ERIC-PCR 分型引物：F：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，R：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。PCR 擴(kuò)增條件參照本實(shí)驗(yàn)室既往條件[15]，反應(yīng)體系25 μL：DNA 模板2 μL，引物(10 μmol/L)2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O2補(bǔ)足體積。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。使用Quantity One 4.6.2 軟件對(duì)電泳圖進(jìn)行聚類分析，選擇非加權(quán)對(duì)數(shù)算術(shù)平均法(UPMGA)，繪制遺傳關(guān)系圖。以0.8 相似度為界限，將相似系數(shù)＞0.8 的歸為同一基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用雙側(cè)Fisher確切概率法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)

藥敏結(jié)果顯示，39 株蠟樣芽胞桿菌對(duì)青霉素G和氨芐西林的耐藥率達(dá)到95%以上，而對(duì)其他大部分抗菌藥物均具有較好的敏感性，見(jiàn)圖1。兩類來(lái)源菌株的藥敏結(jié)果基本一致，而BSI 來(lái)源菌株對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為66.7%，高于FP 來(lái)源菌株的23.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)，見(jiàn)圖2。

圖1 39 株蠟樣芽胞桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖2 兩種來(lái)源的蠟樣芽胞桿菌耐藥情況比較

2.2 兩種來(lái)源菌株毒力基因攜帶情況

毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有菌株均不攜帶HBL 基因(hbl A、hbl C 和hbl D)和NHE 基因nhe A，而NHE 基因nhe B 和nhe C 的攜帶率均為100%。嘔吐毒素基因EM1 的總攜帶率為15.4%(6/39)，陽(yáng)性株均來(lái)自FP 標(biāo)本；BSI 來(lái)源菌株與FP 來(lái)源菌株嘔吐毒素基因EM1攜帶率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩種來(lái)源菌株毒力基因攜帶情況[株數(shù)(%)]

2.3 39 株蠟樣芽胞桿菌毒力基因譜

根據(jù)毒力基因的攜帶情況可將39 株蠟樣芽胞桿菌分為6 個(gè)毒力基因型。Ⅲ型毒力基因中，BSI 來(lái)源菌株與FP 來(lái)源菌株毒力基因譜比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 39 株蠟樣芽胞桿菌毒力基因譜

2.4 ERIC-PCR 基因分型

ERIC-PCR 分型發(fā)現(xiàn)，39 株蠟樣芽胞桿菌分為31 個(gè)基因型。13、23、26、28 和31 型都存在2 株以上菌株；26 和31 型菌株為不同來(lái)源，其他3 個(gè)菌株均為相同來(lái)源。對(duì)上述5 個(gè)分型的菌株進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，除28 型的2 株具有相同耐藥譜和毒力譜外，其余同一分型內(nèi)菌株的耐藥譜和/或毒力譜不同。

3 討論

蠟樣芽胞桿菌是一種常見(jiàn)的食源性條件致病菌[16-18]。由該菌引起的血流感染通常被認(rèn)為是植入物或?qū)Ч芟嚓P(guān)性感染，近年來(lái)國(guó)外也有該菌引起嚴(yán)重BSI和院內(nèi)感染[19-20]的報(bào)道。本研究收集到的18 株BSI來(lái)源菌株均分離自兒科患者，可能是這些患兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，再加上長(zhǎng)期機(jī)械通氣或靜脈置管等，容易出現(xiàn)如蠟樣芽胞桿菌等環(huán)境微生物導(dǎo)致的播散性感染[21]。

蠟樣芽胞桿菌通常對(duì)青霉素和頭孢菌素產(chǎn)生耐藥性，這與細(xì)菌產(chǎn)生的廣譜β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)[22-23]。本研究結(jié)果顯示，BSI 菌株對(duì)青霉素G 和氨芐西林幾乎均耐藥，對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率達(dá)到66.7%，但對(duì)其他抗菌藥物均表現(xiàn)出很好的敏感性。而Ikeda 等[24]對(duì)29 株BSI 來(lái)源的菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)65.5%的菌株對(duì)克林霉素耐藥，10.3%的菌株對(duì)左氧氟沙星耐藥。這些結(jié)果的差異可能與地域等因素有關(guān)。另外，值得注意的是，BSI 來(lái)源菌株的耐藥率高于FP 來(lái)源菌株，這其中的原因值得進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，兩種來(lái)源菌株與腹瀉相關(guān)的毒素基因攜帶情況大致相同，其中nhe 攜帶率最高，其次是ent FM，與Yu 等[25]研究結(jié)果一致；兩種來(lái)源菌株的嘔吐相關(guān)基因EM1 的攜帶情況則有所不同，EM1基因主要存在于FP 來(lái)源菌株中。39 株蠟樣芽胞桿菌根據(jù)毒力基因譜可分為6 個(gè)型別，所有菌株均至少攜帶3 種毒力基因，53.8%(21/39)的菌株具有nheBnheC-cytK-entFM 的毒力譜；BSI 來(lái)源菌株的毒力譜分布相對(duì)集中，72.2%(13/18)的菌株具有nheB-nheCcytK-entFM 的毒力基因譜；而FP 來(lái)源菌株的毒力譜分布則相對(duì)分散，21 株菌中具有第Ⅰ～Ⅳ型毒力譜的菌株分別占38.1%、19.0%、28.6%、4.8%、4.8%和4.8%。另外，具有nheB-nheC-cytK-entFM-EM1 毒力譜的6 株菌均來(lái)自于FP 標(biāo)本，這種差異是特例還是共性還需進(jìn)一步研究。

ERIC-PCR 分型結(jié)果顯示，兩種來(lái)源菌株的基因型表現(xiàn)出明顯的多樣性，大多數(shù)型別只含有1 株蠟樣芽胞桿菌，擁有2 株以上菌株的型別中菌株的來(lái)源、耐藥譜和毒力譜也不相同。對(duì)耐藥譜和毒力譜完全一致的第28 型的2 株BSI 來(lái)源菌株進(jìn)行進(jìn)一步追蹤，發(fā)現(xiàn)兩例患者住院時(shí)間相近，且均使用過(guò)靜脈插管術(shù)，可疑為院內(nèi)感染菌株。Akamatsu 等[26]對(duì)從醫(yī)院感染標(biāo)本中分離到的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型，發(fā)現(xiàn)在2006、2013 和2016 年日本3 個(gè)地點(diǎn)發(fā)生的醫(yī)院感染病例中，以新登記的蠟樣芽孢桿菌ST1420 序列型為主。那么在BSI 來(lái)源菌株是否存在流行序列，以及與其他來(lái)源菌株是否存在差異將是今后研究的重要問(wèn)題。當(dāng)?shù)乜梢越⒃摼舅財(cái)y帶情況和基因分型的數(shù)據(jù)庫(kù)，為研究不同來(lái)源菌株的分子流行病學(xué)提供依據(jù)，從而有助于該菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)和溯源。