張立攀，趙夢(mèng)瑤，關(guān)炳峰，蔣碧偉，王法云，王 永

(河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450000)

糖尿病已成為現(xiàn)代社會(huì)的高發(fā)病種，糖尿病的可能病因較多[1-2]，治療較為麻煩，迫切需要人們?cè)谒幒褪?個(gè)領(lǐng)域?qū)ζ溥M(jìn)行防治[3]。經(jīng)過(guò)多年的經(jīng)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證，藥食同源物質(zhì)防治糖尿病及其并發(fā)癥具有安全和療效持久等化學(xué)藥物、生化制劑不具備的優(yōu)勢(shì)[1]。山茱萸是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材[4-6]，具有滋補(bǔ)、固精的作用，被明確記載在《本草綱目》《吳昔本草》《救荒本草》等典籍中[7-9]。現(xiàn)代研究表明，山茱萸具有防治糖尿病、增強(qiáng)免疫、延緩衰老等功效[1,6,10-11]，可用于臨床治療腰膝酸軟、小便頻多、體虛盜汗等癥[6,12]。山茱萸在我國(guó)主要分布于中原和西南地區(qū)[1,12-14]。山茱萸在產(chǎn)地有悠久的直接食用歷史[13]，其深加工產(chǎn)品也正在研發(fā)，主要有山茱萸果酒[15-16]、發(fā)酵酸乳和營(yíng)養(yǎng)果汁[16-17]等。2018年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布意見函，將山茱萸批準(zhǔn)按照藥食同源物質(zhì)進(jìn)行試生產(chǎn)。馬錢苷是山茱萸的重要活性成分，是一種主要以苷的形式存在的萜苷類化合物[18-19]，因含有極性官能團(tuán)而易溶于水和甲醇，主要存在于果肉中，果核中則很少[7]。馬錢苷具有增強(qiáng)免疫、防治心血管疾病、抗炎和鎮(zhèn)靜催眠等功效，具有提高抵抗力、預(yù)防治療心血管疾病和安神等作用[20]。從山茱萸中高效提取馬錢苷，在此基礎(chǔ)上發(fā)展山茱萸深加工產(chǎn)業(yè)，不僅可以推動(dòng)山茱萸的深度開發(fā)利用，還可以促進(jìn)山茱萸種植業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)對(duì)山茱萸資源的充分利用。

文獻(xiàn)報(bào)道的馬錢苷提取方法，以熱回流法[21-22]和微波法[23]為主。熱回流法因?yàn)椴僮靼踩?、熱能成本高等因素逐漸落后；微波法的過(guò)程溫度不易穩(wěn)定控制，應(yīng)用潛力較小，一般僅限于試驗(yàn)與研究。綜合目前的報(bào)道，從山茱萸中提取馬錢苷的得率普遍較低，只有0.8%[23]。鑒于此，本研究采用超聲波提取法，以經(jīng)過(guò)軟化處理的山茱萸為原料，結(jié)合高效液相法測(cè)定，以馬錢苷得率為考量指標(biāo)，獲得山茱萸馬錢苷的正交優(yōu)化提取工藝，得到較高的得率，為高附加值開發(fā)山茱萸資源奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

山茱萸采自洛陽(yáng)市欒川縣山區(qū)。馬錢苷對(duì)照品(HPLC≥99 %)購(gòu)自德思特生物公司；甲醇為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Mreda科技有限公司；乙腈為色譜純，購(gòu)自北京Dikma科技有限公司；其他為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備：DZ53T型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、QJ-08B型粉碎機(jī)(上海兆申粉碎機(jī)械有限公司)、FA2004型電子天平(上海衡際科學(xué)儀器有限公司)、AL204-ICF型分析天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]、DHG-9052A型臺(tái)式電熱干燥箱(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、SCIENTZ-IID型超聲細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、1290 Infinity Ⅱ型液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)、RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 樣品預(yù)處理

山茱萸的新鮮果實(shí)被采摘下來(lái)，用水沖洗后放在-5 ℃保存1 d，然后置于50 ℃的溫水中浸泡20 min，之后脫去果核；果肉置于干燥箱中于45 ℃烘制10 h，使用粉碎機(jī)將烘干的果肉磨碎，得到山茱萸干果粉。

1.4 馬錢苷含量的測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 使用甲醇和水配制成80%溶液，將馬錢苷對(duì)照品6.5 mg制成50 mL對(duì)照品母液。分別取1、2、4、6、8 mL對(duì)照品母液，用同樣的溶劑定容至10 mL，經(jīng)過(guò)濾后采用高效液相色譜法測(cè)定。得到標(biāo)準(zhǔn)方程：y=12.755x+1.935 8，R2=0.997 4。如圖1所示。

1.4.2 馬錢苷含量的測(cè)定 取10 mL樣品處理母液于燒杯中，置于95 ℃下蒸發(fā)除去揮發(fā)物，殘?jiān)褂皿w積分?jǐn)?shù)80%乙醇水溶液轉(zhuǎn)移、定容至10 mL容量瓶中，使用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，在線分析。

根據(jù)以下公式計(jì)算：

w=(c×0.025)/m

(1)

w：馬錢苷得率(%)；

c：測(cè)定液中馬錢苷的質(zhì)量濃度(mg/L)；

m：山茱萸干果粉質(zhì)量(g)。

1.4.3 色譜條件 色譜柱為L(zhǎng)una Omega C18柱子(長(zhǎng)度100 mm×內(nèi)徑2.1 mm×粒徑1.6 μm)，柱溫35 ℃；流動(dòng)相α：100%乙腈，β：0.35%甲酸的水溶液，流速：0.32 cm3/min，檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm，進(jìn)樣體積：2.5 μL。液相程序如表1所示。

表1 液相色譜條件Tab.1 The chromatographic condition

1.5 山茱萸中馬錢苷超聲細(xì)胞破碎提取工藝

將稱量好的山茱萸干果粉置于溶劑中，按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的提取工藝參數(shù)進(jìn)行提取。所得混合物經(jīng)過(guò)抽濾后，加熱抽真空濃縮，剩余紅色殘?jiān)?0%的乙醇轉(zhuǎn)移、定容至250 mL，作為樣品處理母液。

1.6 山茱萸中馬錢苷超聲細(xì)胞破碎提取單因素試驗(yàn)

1.6.1 超聲功率對(duì)得率的影響 乙醇含量為60%，固液比為1∶20，試驗(yàn)溫度為40 ℃，超聲時(shí)間為20 min，超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s，提取循環(huán)次數(shù)為1次，考察超聲功率為100～300 W的試驗(yàn)點(diǎn)，并且每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)間相差50 W對(duì)得率的影響。

1.6.2 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響 乙醇含量為60%，固液比為1∶20，試驗(yàn)溫度為40 ℃，超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s，提取循環(huán)次數(shù)為1次，超聲功率為200 W，考察超聲時(shí)間分別取10～35 min，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)間隔5 min對(duì)得率的影響。

1.6.3 固液比對(duì)得率的影響 乙醇含量為60%，試驗(yàn)溫度為40 ℃，超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s，提取循環(huán)次數(shù)為1次，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為25 min，考察固液比分別取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35時(shí)對(duì)得率的影響。

1.6.4 乙醇含量對(duì)得率的影響 試驗(yàn)溫度為40 ℃，超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s，提取循環(huán)次數(shù)為1次，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為25 min，固液比取1∶30，考察乙醇含量為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%對(duì)得率的影響。

1.6.5 試驗(yàn)溫度對(duì)得率的影響 乙醇含量為50%，超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s，提取循環(huán)次數(shù)為1次，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為25 min，固液比取1∶30，考察試驗(yàn)溫度為20～70 ℃的試驗(yàn)點(diǎn)，并且每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)相差10 ℃對(duì)得率的影響。

1.6.6 超聲開/關(guān)時(shí)間對(duì)得率的影響 乙醇含量為50%，提取循環(huán)次數(shù)為1次，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為25 min，固液比為1∶30，提取試驗(yàn)溫度為40 ℃，考察超聲開/關(guān)時(shí)間分別設(shè)為1 s/5 s、3 s/5 s、5 s/5 s、7 s/5 s、9 s/5 s對(duì)得率的影響。

1.6.7 提取循環(huán)次數(shù)對(duì)得率的影響 乙醇含量為50%，超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為25 min，固液比取1∶30，提取試驗(yàn)溫度為40 ℃，考察提取循環(huán)次數(shù)為1～4次對(duì)得率的影響。

1.7 山茱萸馬錢苷超聲細(xì)胞破碎提取的正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)：設(shè)置提取試驗(yàn)溫度40 ℃，超聲功率200 W，選取其他4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)因素水平表見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

2 結(jié)果與分析

2.1 山茱萸中馬錢苷提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)馬錢苷得率的影響 如圖2所示，超聲功率在200 W時(shí)，得率最高；提取結(jié)果隨著超聲功率的提高先升高后降低；超聲功率超過(guò)200 W時(shí)，由于細(xì)胞破碎程度過(guò)高，導(dǎo)致原本擴(kuò)散較慢的其他成分分子大幅提高速率，影響了馬錢苷分子本身的擴(kuò)散速率，反而不利于馬錢苷的提取。故選取超聲功率為200 W。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)馬錢苷得率的影響 如圖3所示，在溶液沒有飽和前，隨著工作時(shí)間增長(zhǎng)，溶出分子總量增加；當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，得率最好。馬錢苷分子在溶劑中的溶解存在一個(gè)飽和平衡，起初隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，進(jìn)入溶劑中的馬錢苷量逐漸增多，達(dá)到平衡之后馬錢苷溶解量不再增加，但隨著其他雜質(zhì)的溶解增加，導(dǎo)致馬錢苷的溶解平衡被打破，溶解量受到抑制，致使得率下降。故選擇超聲時(shí)間為25 min。

2.1.3 固液比對(duì)馬錢苷得率的影響 如圖4所示，當(dāng)固液比為1∶30時(shí)，得到較佳得率。當(dāng)固液比高于或者低于1∶30時(shí)，得率都會(huì)降低。在固液比為1∶30的基礎(chǔ)上，繼續(xù)增加溶劑用量，得率下降，是因目標(biāo)分子已經(jīng)基本提取完全，其他的雜質(zhì)分子繼續(xù)大量進(jìn)入溶劑中，對(duì)馬錢苷分子的溶解也產(chǎn)生了一定的抑制作用。故選擇固液比為1∶30。

2.1.4 乙醇含量對(duì)馬錢苷得率的影響 如圖5所示，當(dāng)乙醇含量達(dá)到50%時(shí)，得到較佳得率。可能原因是該提取溶液的極性與目的物相近，目標(biāo)分子由于相似相溶原理最容易由植物細(xì)胞中擴(kuò)散過(guò)來(lái)。而無(wú)論增大或者減小溶劑含量，提取溶液與目標(biāo)分子彼此極性相差越來(lái)越大；同時(shí)，其他非目標(biāo)物分子，如脂溶性化合物進(jìn)入溶劑的量增大，影響了目的物的擴(kuò)散。故選擇溶劑中乙醇的含量為50%。

2.1.5 試驗(yàn)溫度對(duì)馬錢苷得率的影響 如圖6所示，當(dāng)試驗(yàn)溫度為40 ℃時(shí)，得到較佳提取得率；溫度低于此時(shí)，隨著溫度的升高，目的物在溶劑中的溶解量增加；而高于40 ℃之后，可能原糖類或其他極性接近的物質(zhì)的溶出大幅增加，抑制了目的物的溶出。故選擇試驗(yàn)溫度為40 ℃。

2.1.6 超聲開/關(guān)時(shí)間對(duì)馬錢苷得率的影響 如圖7所示，當(dāng)超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s時(shí)，得率最好；增加或者降低每一次工作過(guò)程中的工作時(shí)間比例，都會(huì)降低得率；超聲開/關(guān)時(shí)間逐漸增大時(shí)，工作時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞破碎厲害，馬錢苷分子更加易于溶出。當(dāng)超聲開/關(guān)時(shí)間過(guò)大，間歇時(shí)間太短時(shí)，由于超聲產(chǎn)生的能量會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)溫度升高過(guò)快而來(lái)不及散熱降溫，導(dǎo)致溶劑逸失加快，所以馬錢苷得率變化不大或者略微變小。故選擇超聲開/關(guān)時(shí)間為5 s/5 s。

2.1.7 提取循環(huán)次數(shù)對(duì)馬錢苷得率的影響 如圖8所示，當(dāng)提取循環(huán)次數(shù)達(dá)到2次以上時(shí)，繼續(xù)增加次數(shù)，提取得率變化幅度較小。綜合操作與節(jié)約因素，取提取循環(huán)次數(shù)為2次。

2.2 山茱萸中馬錢苷提取的正交試驗(yàn)

通過(guò)研究單因素對(duì)提取得率的影響，試驗(yàn)溫度和超聲功率對(duì)山茱萸馬錢苷提取影響幅度較小，因此，選取超聲開/關(guān)時(shí)間、超聲時(shí)間、固液比、乙醇含量4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal test for extraction

由表3、表4可以得出結(jié)論，提取效果影響大小順序?yàn)椋撼曢_/關(guān)時(shí)間>固液比>乙醇含量>超聲時(shí)間；超聲開/關(guān)時(shí)間具有顯著性，說(shuō)明該因素對(duì)山茱萸中馬錢苷的提取影響最大；正交優(yōu)化試驗(yàn)得到的最優(yōu)結(jié)果為A2B2C2D3，即超聲開/關(guān)時(shí)間5 s/5 s、超聲時(shí)間25 min、固液比1∶30、乙醇含量55%。

優(yōu)化條件下的5次確證試驗(yàn)中得到1.513%的得率，驗(yàn)證結(jié)果相符性良好。

表4 正交試驗(yàn)方差分析Tab.4 Variance analysis of rthogonal test

3 結(jié)論與討論

山茱萸是河南省優(yōu)勢(shì)地方植物資源，在洛陽(yáng)、南陽(yáng)市山區(qū)有廣泛種植。山茱萸獲批為藥食同源物質(zhì)，拓寬山茱萸應(yīng)用范圍，對(duì)促進(jìn)其深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展有積極作用，繼而實(shí)現(xiàn)三產(chǎn)聯(lián)動(dòng)，帶動(dòng)當(dāng)?shù)厣杰镙欠N植業(yè)的發(fā)展。馬錢苷是山茱萸所含重要成分，提取馬錢苷作為組分進(jìn)行添加，能夠強(qiáng)化相應(yīng)食品產(chǎn)品的健康功能，實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)與健康并重。

本研究結(jié)果顯示，山茱萸馬錢苷得率隨著超聲功率的提高先升高后降低，其原因?yàn)槌暪β誓軌蛲瑫r(shí)促進(jìn)馬錢苷和其他活性物分子的擴(kuò)散，當(dāng)馬錢苷分子擴(kuò)散速率相對(duì)最高時(shí)得率最高；隨著超聲工作時(shí)間增長(zhǎng)，馬錢苷分子溶出總量增加，當(dāng)達(dá)到最大溶出量后，其他雜質(zhì)的溶解量仍在繼續(xù)增加，導(dǎo)致馬錢苷的飽和溶解量開始受到抑制，得率反而下降；根據(jù)極性相適原理，當(dāng)固液比達(dá)最佳值時(shí)，溶劑極性適宜，馬錢苷溶出量最高，增加或減小固液比，都會(huì)導(dǎo)致馬錢苷提取得率的降低；同理，溶劑中乙醇含量影響溶劑的極性，同樣影響馬錢苷得率；活性物分子的擴(kuò)散速率隨溫度變化，當(dāng)馬錢苷得率最高時(shí)，繼續(xù)升高溫度，其他雜質(zhì)分子的擴(kuò)散速率逐漸居上，反而導(dǎo)致馬錢苷得率降低；超聲開/關(guān)時(shí)間逐漸增大時(shí)，超聲實(shí)際工作時(shí)間相對(duì)提高，馬錢苷分子溶出加快，但當(dāng)超聲開/關(guān)時(shí)間過(guò)大時(shí)，超聲產(chǎn)生的熱量來(lái)不及散逸，導(dǎo)致溶劑揮發(fā)損失加快；提取次數(shù)增加到一定值以后，馬錢苷的溶出不再繼續(xù)增加，所以繼續(xù)增加提取次數(shù)對(duì)提高得率作用不明顯。

本研究以河南山茱萸為試驗(yàn)材料，采用超聲輔助提取的方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)山茱萸馬錢苷提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，各個(gè)因素對(duì)提取得率影響大小為超聲開/關(guān)時(shí)間>固液比>乙醇含量>超聲時(shí)間。優(yōu)化條件為超聲開/關(guān)時(shí)間5 s/5 s，超聲時(shí)間25 min，固液比1∶30，乙醇含量55%，提取循環(huán)次數(shù)2次，提取試驗(yàn)溫度40 ℃，超聲功率200 W。驗(yàn)證提取得率顯示，該優(yōu)化工藝的馬錢苷得率可達(dá)1.513%，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道[23]，與預(yù)期結(jié)果較為相符。

綜上所述，采用超聲輔助提取的方法，能夠有效提高山茱萸中馬錢苷得率，可為工業(yè)化提取山茱萸馬錢苷及其后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)提供技術(shù)理論支撐。