喬 木，周佳偉，吳俊靜，武華玉，梅書棋，彭先文

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064)

豬的產(chǎn)仔數(shù)包括總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)，是直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)收益的重要經(jīng)濟(jì)性狀，提高豬產(chǎn)仔數(shù)對(duì)提高養(yǎng)豬業(yè)的總體經(jīng)濟(jì)效益意義重大。影響豬產(chǎn)仔數(shù)的因素很多，如遺傳、環(huán)境以及品種等，遺傳是主要的影響因素。而豬產(chǎn)仔數(shù)性狀受多基因控制，并且其遺傳力較低(0.1左右)[1-2]，依靠傳統(tǒng)的育種方法，周期長(zhǎng)、進(jìn)展緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將分子標(biāo)記輔助選擇育種與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，可以有效加快豬繁殖性狀的選擇進(jìn)程。因此，尋找影響母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的候選基因及關(guān)鍵分子遺傳標(biāo)記，并將其用于標(biāo)記輔助選擇育種，對(duì)提高母豬的繁殖性能具有重要意義。

氧化型低密度脂蛋白受體1基因(Oxidized low-density lipoprotein receptor 1,OLR1)具有結(jié)合和氧化低密度脂蛋白的作用[3]，早期由于其與人類的心血管疾病有關(guān)，備受關(guān)注[4-6]。隨后有研究結(jié)果表明，OLR1基因與小鼠甘油三酯的形成和脂肪的分解有關(guān)[7-9]，然而在家畜中對(duì)于OLR1基因的研究較少，在牛中發(fā)現(xiàn)OLR1基因存在與牛的產(chǎn)奶量、乳脂成分和乳蛋白量相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)[10-13]，在豬中存在與胴體性狀和脂肪性狀相關(guān)的SNP[14-16]，但是未見與母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的報(bào)道。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豬育種團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)了OLR1基因在高產(chǎn)仔數(shù)和低產(chǎn)仔數(shù)母豬(發(fā)情期)卵巢組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)OLR1基因在高產(chǎn)仔數(shù)母豬卵巢中的表達(dá)量顯著(P<0.05)高于低產(chǎn)仔數(shù)母豬卵巢中的表達(dá)量，卵巢是母豬的重要生殖器官，對(duì)母豬的繁殖性能有著重要的影響?？梢?，OLR1基因可以作為影響產(chǎn)仔數(shù)的候選基因進(jìn)行研究。為此,篩選鑒定豬OLR1基因遺傳多態(tài)位點(diǎn)，并對(duì)硒都黑豬進(jìn)行基因型分布檢測(cè)，將不同基因型與母豬第一胎產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在為豬繁殖性狀標(biāo)記輔助選擇育種提供新的分子標(biāo)記。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本試驗(yàn)所用的500頭硒都黑母豬來(lái)自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所有合作關(guān)系的恩施來(lái)鳳縣種豬場(chǎng)，采集血液樣品，并記錄其總產(chǎn)仔數(shù)(Total number born,TNB)和產(chǎn)活仔數(shù)(Number born alive,NBA)。

基因組DNA的提?。翰捎帽本┨旄萍加邢薰镜难夯蚪MDNA提取試劑盒 (DP348)，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2 PCR擴(kuò)增、測(cè)序及SNP篩選

根據(jù)NCBI中豬OLR1基因序列(GenBank登錄號(hào)：NC_010447.5)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。上游引物OLF：5′-CCTCGGTGGAAGAGCATT-3′，下游引物OLR：5′-CCACAGAACCAAAGGGAT -3′，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

PCR總反應(yīng)體系(20 μL)：模板DNA 1 μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，滅菌雙蒸水7 μL。

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物于1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

將目的條帶用上海生工生物工程有限公司的膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件中MegAlign程序進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合測(cè)序峰型圖篩選SNP[17]。

1.3 多態(tài)性分布規(guī)律檢測(cè)

利用1.2中的引物OLF和OLR，采用PCR直接測(cè)序法在500頭硒都黑豬群體中進(jìn)行SNP不同基因型的分布規(guī)律檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件GLM程序分析OLR1基因多態(tài)位點(diǎn)的不同基因型與硒都黑豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)性狀的相關(guān)性。進(jìn)行不同SNP基因型組合的方差分析，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。采用模型：

Yij=μ+Gi+Fj+eij

式中，Yij為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(yīng)(i=AA、AC、CC、AT、TC)，F(xiàn)j為年份和季節(jié)效應(yīng)，eij為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒都黑豬OLR1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

選取8頭硒都黑豬基因組DNA為模板，采用1.2中的引物OLF和OLR，對(duì)OLR1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為175 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 硒都黑豬OLR1基因SNP位點(diǎn)鑒定

對(duì)2.1中獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收、純化、測(cè)序,用DNAStar軟件中MegAlign程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合測(cè)序峰型圖鑒定SNP。結(jié)果顯示，在OLR1基因的第122 bp處存在A>C、A>T和C>T 3種類型的SNP，與NCBI中豬的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)位于基因組g.61808357，產(chǎn)生AA、CC、AT、AC和TC 5種基因型(圖2)。

2.3 OLR1基因SNP位點(diǎn)在硒都黑豬群體中多態(tài)性檢測(cè)

在硒都黑豬群體中，OLR1基因g.61808357處SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型分布規(guī)律如表1所示。由表1可知，AA、AC、CC、AT和TC 5種基因型的頻率分別為0.638、0.284、0.040、0.028和0.010，AA基因型個(gè)體最多，TC基因型個(gè)體最少，A等位基因所占頻率最高。

2.4 OLR1基因g.61808357突變與硒都黑豬產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析

在500頭硒都黑豬群體中進(jìn)行不同基因型與總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)性狀間的關(guān)聯(lián)分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，在硒都黑豬中，g.61808357處A>C、A>T、C>T位點(diǎn)的AC、AA和CC基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均極顯著(P<0.01)高于TC和AT基因型個(gè)體，其中AC基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)最高，CC基因型個(gè)體的產(chǎn)活仔數(shù)最高，A和C等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因。

表2 OLR1基因g.61808357突變與硒都黑豬產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析Tab.2 Association analyses of the OLR1 geneg.61808357 variations with litter size traits in Xidu black pigs

3 結(jié)論與討論

母豬產(chǎn)仔數(shù)是影響母豬繁殖性能的重要性狀，其遺傳力只有0.1左右，采用常規(guī)的育種手段，周期長(zhǎng)，進(jìn)展緩慢，將分子標(biāo)記輔助選擇育種與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，大大加速了豬繁殖性狀的選擇進(jìn)程。用于標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記包括蛋白質(zhì)標(biāo)記、微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP標(biāo)記等。SNP標(biāo)記指由基因組單核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基轉(zhuǎn)換、顛換、單堿基插入或缺失等，被公認(rèn)為第3代DNA分子標(biāo)記。目前，國(guó)內(nèi)外豬育種學(xué)家已經(jīng)利用最新的生物技術(shù)如全基因組重測(cè)序、全基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)鑒定了一些豬產(chǎn)仔數(shù)候選基因及其分子標(biāo)記，如ESR、FSHβ、RBP4和PRLR等[18-20]；豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的SNP，如OPN基因第6 136 bp處C>A突變[21]，BMPR1B基因第6外顯子595 bp處的G>C和643 bp處的C>T突變[22]。相關(guān)基因數(shù)量較少，且主效基因以及主效基因相關(guān)SNP研究欠缺[23]。因此，挖掘豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)基因及其SNP，對(duì)于豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的標(biāo)記輔助選擇育種具有重要意義。

本研究鑒定獲得了硒都黑豬OLR1基因g.61808357同一位置存在3種不同類型的SNP(A>C、A>T和C >T)。這種在同源染色體上同一位置存在2個(gè)以上SNP的基因稱為復(fù)等位基因(Multiple allelism)[24]，可以用作分子標(biāo)記。復(fù)等位基因在植物中比較常見，但是在家畜中尚未見報(bào)道?？梢?OLR1基因在硒都黑豬中存在豐富的多態(tài)性。

上述5種不同的基因型與硒都黑豬產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，AC、AA和CC基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均極顯著高于TC和AT基因型個(gè)體。由此可以看出，A等位基因和C等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因，而TC和AT基因型個(gè)體雖然也含有A等位基因和C等位基因，由于T等位基因的存在，產(chǎn)仔數(shù)性狀低于不含T基因的個(gè)體。在育種中應(yīng)予以保留攜帶A和C優(yōu)勢(shì)等位基因的個(gè)體，淘汰攜帶有T等位基因的個(gè)體，從而有利于提高群體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)。