光敏色素互作因子OsPIL15基因?qū)λ玖?、氮吸收利用的影?/h1>
2021-06-25 06:47:14李丹陽(yáng)張曉花劉靈芝孫紅正李俊周杜彥修趙全志
河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年5期
李丹陽(yáng),張曉花,劉靈芝,孫紅正，李俊周，彭 廷，張 靜，杜彥修,趙全志
(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)
水稻(Oryzasativa)是我國(guó)重要的糧食作物，60%的人口以稻米為口糧。因此，水稻的穩(wěn)產(chǎn)和增產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)糧食安全具有重要意義。水稻的穩(wěn)產(chǎn)和增產(chǎn)主要靠“良種良法”，而化肥的合理使用是“良法”的必然措施。我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在化肥施用過量的問題，導(dǎo)致資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，尋找作物營(yíng)養(yǎng)元素高效吸收利用基因以降低化肥施用量，一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。
磷在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用，是生物膜、核酸和蛋白質(zhì)的重要成分，參與能量代謝、物質(zhì)合成、信號(hào)響應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[1]。我國(guó)近2/3 的耕地缺磷，需要施用磷肥維持和提高作物產(chǎn)量[2-3]。我國(guó)水稻生產(chǎn)上磷肥施用量較高且利用率低，地表徑流損失是稻田磷素流失的主要途徑[4]。鑒定磷高效吸收利用相關(guān)基因，提高水稻對(duì)磷的吸收利用率是解決磷肥浪費(fèi)的重要手段。目前，已從水稻中鑒定了多個(gè)磷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控相關(guān)基因[5-7]。植物從土壤吸收無機(jī)磷主要由PHT1 (Phosphate transporter 1)家族負(fù)責(zé)[5]。水稻中有 13 個(gè)PHT1成員(OsPHT1;1—OsPHT1;13)[6]，除了具有吸收磷的功能外,部分PHT1成員還具有磷的運(yùn)輸功能，例如OsPHT1;2、OsPHT1;3、OsPHT1;6和OsPHT1;8都具有將磷從根向莖運(yùn)輸?shù)墓δ躘7]。磷從根向莖的長(zhǎng)距離運(yùn)輸主要由含SPX結(jié)構(gòu)域的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族負(fù)責(zé)，在水稻中有6個(gè)SPX亞家族蛋白OsSPX1—OsSPX6和3個(gè)SPX-EMS家族蛋白OsPHO1;1、OsPHO1;2和OsPHO1;3[8-9]。植物對(duì)缺磷信號(hào)的響應(yīng)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，包括PHR(Phosphate response)、WRKY、MYB (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)和bHLH(Basic helix-loop-helix protein)家族等[10-12]。其中,OsPHR1和OsPHR2通過調(diào)節(jié)磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)而參與磷饑餓信號(hào)通路[10]。研究發(fā)現(xiàn)，光敏色素感知紅光和遠(yuǎn)紅光，通過其下游的光敏色素互作因子(Phytochrome interacting factor,PIF)調(diào)控種子萌發(fā)、形態(tài)建成、避蔭反應(yīng)、誘導(dǎo)開花和生物節(jié)律等生命活動(dòng)[13-15]。擬南芥中有5個(gè)光敏色素基因(PHYA—PHYE)、至少8個(gè)PIF基因(PIF1—PIF8)[16-19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥phyB突變體磷吸收降低，并揭示了PHYB通過PIF4/PIF5 和HY5(Long hypocotyl 5)調(diào)節(jié)磷饑餓響應(yīng)基因PHT1和PHL1(PHR1-like 1)，進(jìn)而調(diào)控磷吸收[20]。水稻中有6個(gè)PIL(Phytochrome interacting factors-like)基因(OsPIL11—OsPIL16)，調(diào)控水稻抽穗、籽粒大小、葉綠素合成、衰老、鹽和冷脅迫響應(yīng)等[21-26]，但水稻PIL對(duì)磷吸收利用的影響研究還未見報(bào)道。另外，植物對(duì)氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饑餓時(shí)會(huì)影響植物對(duì)氮的吸收[28]。為此，以O(shè)spil15突變體為材料，研究正常磷和低磷條件下OsPIL15基因?qū)α孜绽玫挠绊?，并進(jìn)一步分析OsPIL15基因?qū)Φ绽玫挠绊?，以期為解析OsPIL15基因調(diào)節(jié)磷、氮吸收利用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 水稻材料
本研究使用的水稻材料為日本晴(Nipponbare,Nip)和Ospil15突變體。Ospil15突變體是以日本晴為背景，利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的敲除突變體的T8材料。
1.2 OsPIL15基因在低磷脅迫下的表達(dá)分析
登錄Transcriptome ENcyclopedia of Rice數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)，輸入OsPIL15轉(zhuǎn)錄本號(hào)進(jìn)行查詢，獲得在正常和低磷脅迫下的OsPIL15基因表達(dá)量并進(jìn)行分析。
1.3 材料培養(yǎng)及低磷脅迫處理
水稻材料在人工氣候室(光照2 000 lx、16 h、28 ℃/黑暗8 h、22 ℃)培養(yǎng)。挑選飽滿的水稻種子，用9%NaClO消毒10 min，自來水沖洗6次，蒸餾水洗5～6次，然后在28 ℃黑暗條件下置于無菌水中浸泡催芽2～3 d。將萌發(fā)一致的種子移到96孔板中，先用清水在人工氣候室培養(yǎng)7 d，然后采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行磷處理，正常磷(Normal P，CK)處理濃度為300 μmol/L NaH2PO4，低磷(Low P，LP)脅迫處理濃度為10 μmol/L NaH2PO4。前3 d分別配制1/4、1/3、1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，此后采用Hoagland全濃度營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換一次，培養(yǎng)至四葉一心時(shí)測(cè)定生物量和磷、氮含量。
1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法
1.4.1 生物量 分別挑選正常磷與低磷脅迫處理的水稻植株各10株，用去離子水反復(fù)清洗根及葉表面，吸水紙吸干其表面水分，使用直尺測(cè)量地上部與根長(zhǎng)度，隨后置于烘箱中，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量。
1.4.2 磷、氮含量 將材料剪碎至粉末狀，混合均勻后稱取0.2 g樣品置于消煮管中，采用H2SO4-H2O2消煮法進(jìn)行消煮，用去離子水將消煮液定容至50 mL，再用10 mm定量濾紙將其過濾至10 mL離心管中，使用AA3流動(dòng)注射分析儀進(jìn)行氮、磷含量測(cè)定，并計(jì)算磷和氮吸收效率、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、利用率。
吸收效率=單株磷或氮含量/單株根干質(zhì)量×100%；
轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=地上部磷或氮含量/根磷或氮含量；
利用率=單株氮或磷含量/單株干質(zhì)量×100%。
2 結(jié)果與分析
2.1 低磷脅迫條件下OsPIL15基因表達(dá)分析
已報(bào)道擬南芥PHYB通過PIF4/PIF5 和HY5調(diào)節(jié)磷饑餓響應(yīng)基因來調(diào)控磷的吸收[20]。為了研究水稻光敏色素互作因子基因OsPIL15在水稻中是否能夠調(diào)控磷的吸收，利用已有基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)Transcriptome ENcyclopedia of Rice(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)提取OsPIL15基因在低磷脅迫(0 μmol/L NaH2PO4)下的表達(dá)量，然后進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫下，OsPIL15基因在水稻地上部的表達(dá)量下降，而在根中的表達(dá)量基本不變(圖1)，這表明OsPIL15基因響應(yīng)磷脅迫，可能具有調(diào)節(jié)水稻磷吸收的功能。
2.2 OsPIL15基因?qū)λ旧L(zhǎng)的影響
由于OsPIL15基因受低磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，故利用前期構(gòu)建的敲除突變體材料Ospil15[26,29]，以野生型Nip為對(duì)照，設(shè)置正常磷(300 μmol/L)和低磷(10 μmol/L)2種磷濃度，研究低磷脅迫對(duì)Ospil15突變體和Nip生物量的影響。結(jié)果表明，低磷脅迫后Nip和Ospil15突變體的地上部長(zhǎng)均降低，但是Nip降幅大于Ospil15突變體；低磷脅迫后，Nip根長(zhǎng)變短，Ospil15突變體根長(zhǎng)基本沒有變化(圖2a)。低磷脅迫后，Ospil15突變體和Nip的根、地上部干質(zhì)量均降低，根干質(zhì)量降低幅度小于地上部干質(zhì)量(圖2b)。2個(gè)材料相比，低磷脅迫后Ospil15突變體與Nip地上部干質(zhì)量降低幅度基本一樣，但Nip根干質(zhì)量降低幅度(72.2%)大于Ospil15突變體(68.1%)。這表明低磷脅迫后Ospil15突變體的生長(zhǎng)受影響較野生型小，特別是Ospil15突變體的根。
對(duì)低磷脅迫后的2個(gè)材料根長(zhǎng)與地上部長(zhǎng)的比值以及根干質(zhì)量與地上部干質(zhì)量的比值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低磷脅迫后根長(zhǎng)/莖長(zhǎng)、根干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量均增大(圖2c、d)，這表明在低磷脅迫條件下水稻通過自身協(xié)調(diào)后更加側(cè)重了根的生長(zhǎng)。
2.3 OsPIL15基因?qū)λ玖孜辙D(zhuǎn)運(yùn)的影響
本研究測(cè)定了Ospil15突變體和Nip 2個(gè)材料中的磷含量來分析OsPIL15基因?qū)λ玖姿匚盏挠绊?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常磷條件下，Ospil15突變體根中磷含量顯著大于Nip，Ospil15突變體地上部中磷含量大于Nip但不顯著(圖3a)。低磷脅迫條件下，2個(gè)材料單株磷含量均比正常磷條件下降低(圖3a、b)。低磷脅迫條件下，Ospil15突變體根中磷含量顯著高于Nip，地上部中磷含量顯著高于Nip(圖3b)。分析二者磷吸收效率發(fā)現(xiàn)，正常磷和低磷脅迫條件下Ospil15突變體磷吸收效率均大于Nip，低磷脅迫條件下增幅更大(圖3c)。綜上，無論是正常磷還是低磷脅迫條件下，Ospil15突變體磷含量和磷吸收效率均大于Nip，說明OsPIL15基因負(fù)調(diào)控水稻磷吸收，并且在低磷脅迫條件下OsPIL15基因?qū)λ玖孜盏呢?fù)調(diào)控作用更強(qiáng)。
對(duì)Ospil15突變體和Nip的磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在正常磷條件下，Nip的磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)高于Ospil15突變體；在低磷脅迫條件下，Ospil15突變體的磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)大于Nip(圖3d)。這表明OsPIL15基因不僅影響水稻磷吸收，也調(diào)控磷從根向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。
2.4 OsPIL15基因?qū)λ镜辙D(zhuǎn)運(yùn)的影響
氮是植物吸收的大量元素之一，植物對(duì)氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饑餓時(shí)會(huì)影響植物對(duì)氮的吸收[28]。因此，本研究分析了Ospil15突變體和Nip中的氮含量來研究OsPIL15基因是否調(diào)控氮吸收。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫條件下，Ospil15突變體和Nip氮含量均比正常磷條件下降低(圖4a、b)。Ospil15突變體在正常磷條件下，地上部中氮含量顯著大于Nip，根中氮含量無顯著差異；低磷脅迫條件下，根中氮含量顯著大于Nip，地上部中氮含量無差異(圖4a、b)。分析Ospil15突變體和Nip在正常磷和低磷脅迫條件下氮吸收效率，發(fā)現(xiàn)Ospil15突變體在正常磷和低磷脅迫條件下的氮吸收效率均高于Nip(圖4c)。另外，分析正常磷和低磷脅迫條件下Ospil15突變體和Nip的氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)磷濃度降低后Ospil15突變體和Nip的氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均降低。在正常磷條件下，Ospil15突變體氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)與Nip基本一致；低磷脅迫條件下，Ospil15突變體氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)小于Nip(圖4d)。綜上，Ospil15突變體提高了水稻氮吸收；在低磷脅迫條件下，Ospil15突變體提高了根中氮含量，但減少了氮從根向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。上述結(jié)果表明，OsPIL15基因負(fù)調(diào)控水稻氮吸收，且正調(diào)控氮從根向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。
2.5 OsPIL15基因?qū)λ玖?、氮利用率的影?/h3>
本研究不僅分析了Ospil15突變體對(duì)氮、磷吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，還分析了其對(duì)磷、氮利用率的影響。對(duì)Ospil15突變體和Nip的磷、氮利用率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ospil15突變體在正常磷和低磷脅迫條件下磷、氮利用率均大于Nip(圖5a、b)。這表明OsPIL15基因?qū)λ镜?、磷利用率亦有?fù)調(diào)控作用。
3 結(jié)論與討論
磷是植物吸收利用的大量元素之一，我國(guó)有2/3的耕地缺磷，同時(shí)我國(guó)存在磷肥施用量大而利用率低的浪費(fèi)情況。磷礦是不可再生資源，且磷礦資源的消耗加劇[30]。因此，必須改良栽培技術(shù)和培育高效吸收利用磷的作物品種。本研究以基因編輯技術(shù)獲得的Ospil15突變體為研究材料，發(fā)現(xiàn)Ospil15突變體能提高對(duì)磷的吸收利用，這為培育高效吸收利用磷水稻品種和解析水稻磷吸收機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
本研究發(fā)現(xiàn)，OsPIL15基因?qū)Φ土酌{迫有響應(yīng)，推測(cè)OsPIL15基因可能調(diào)控水稻磷吸收。在低磷脅迫條件下，Nip和Ospil15突變體單株磷含量均較正常磷條件下降低，這與郭再華等[31]的結(jié)論一致。Nip和Ospil15突變體在低磷脅迫條件下根長(zhǎng)/地上部長(zhǎng)和根干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量均增加，這與劉文菊等[32]研究結(jié)果一致。低磷脅迫條件下，Ospil15突變體根長(zhǎng)和地上部長(zhǎng)降低幅度小于Nip，根干質(zhì)量降幅小于Nip，地上部干質(zhì)量降幅與Nip相近，說明其比野生型耐低磷。
Ospil15突變體無論在正常磷還是在低磷脅迫條件下均表現(xiàn)出較高的磷含量和磷吸收效率，這表明OsPIL15基因負(fù)調(diào)控水稻對(duì)磷的吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，Ospil15突變體較野生型磷含量增加，說明OsPIL15基因負(fù)調(diào)控磷素吸收，與SAKURABA等[20]報(bào)道的光敏色素互作因子負(fù)調(diào)控磷吸收一致。
植物對(duì)氮、磷吸收存在互作現(xiàn)象[33-35]，低磷脅迫條件下水稻、煙草、大麥、玉米和大豆等作物氮吸收均減少[36-39]。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Ospil15突變體在正常磷條件下顯著提高了地上部中氮含量，低磷脅迫條件下顯著提高了根中氮含量；氮吸收系數(shù)在正常磷與低磷脅迫條件下均大于野生型。這表明OsPIL15基因在磷、氮互作下負(fù)調(diào)控氮素吸收。OsPIL15基因除調(diào)控磷、氮吸收外，對(duì)磷、氮的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用亦有調(diào)控。與野生型相比，Ospil15突變體在正常磷條件下降低磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，在低磷脅迫條件下提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、降低氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，在正常磷和低磷脅迫條件下均提高了磷、氮利用率。這表明OsPIL15基因在調(diào)控水稻磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及氮、磷互作方面的機(jī)制十分復(fù)雜。
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磷在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用，是生物膜、核酸和蛋白質(zhì)的重要成分，參與能量代謝、物質(zhì)合成、信號(hào)響應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[1]。我國(guó)近2/3 的耕地缺磷，需要施用磷肥維持和提高作物產(chǎn)量[2-3]。我國(guó)水稻生產(chǎn)上磷肥施用量較高且利用率低，地表徑流損失是稻田磷素流失的主要途徑[4]。鑒定磷高效吸收利用相關(guān)基因，提高水稻對(duì)磷的吸收利用率是解決磷肥浪費(fèi)的重要手段。目前，已從水稻中鑒定了多個(gè)磷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控相關(guān)基因[5-7]。植物從土壤吸收無機(jī)磷主要由PHT1 (Phosphate transporter 1)家族負(fù)責(zé)[5]。水稻中有 13 個(gè)PHT1成員(OsPHT1;1—OsPHT1;13)[6]，除了具有吸收磷的功能外,部分PHT1成員還具有磷的運(yùn)輸功能，例如OsPHT1;2、OsPHT1;3、OsPHT1;6和OsPHT1;8都具有將磷從根向莖運(yùn)輸?shù)墓δ躘7]。磷從根向莖的長(zhǎng)距離運(yùn)輸主要由含SPX結(jié)構(gòu)域的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族負(fù)責(zé)，在水稻中有6個(gè)SPX亞家族蛋白OsSPX1—OsSPX6和3個(gè)SPX-EMS家族蛋白OsPHO1;1、OsPHO1;2和OsPHO1;3[8-9]。植物對(duì)缺磷信號(hào)的響應(yīng)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，包括PHR(Phosphate response)、WRKY、MYB (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)和bHLH(Basic helix-loop-helix protein)家族等[10-12]。其中,OsPHR1和OsPHR2通過調(diào)節(jié)磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)而參與磷饑餓信號(hào)通路[10]。研究發(fā)現(xiàn)，光敏色素感知紅光和遠(yuǎn)紅光，通過其下游的光敏色素互作因子(Phytochrome interacting factor,PIF)調(diào)控種子萌發(fā)、形態(tài)建成、避蔭反應(yīng)、誘導(dǎo)開花和生物節(jié)律等生命活動(dòng)[13-15]。擬南芥中有5個(gè)光敏色素基因(PHYA—PHYE)、至少8個(gè)PIF基因(PIF1—PIF8)[16-19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥phyB突變體磷吸收降低，并揭示了PHYB通過PIF4/PIF5 和HY5(Long hypocotyl 5)調(diào)節(jié)磷饑餓響應(yīng)基因PHT1和PHL1(PHR1-like 1)，進(jìn)而調(diào)控磷吸收[20]。水稻中有6個(gè)PIL(Phytochrome interacting factors-like)基因(OsPIL11—OsPIL16)，調(diào)控水稻抽穗、籽粒大小、葉綠素合成、衰老、鹽和冷脅迫響應(yīng)等[21-26]，但水稻PIL對(duì)磷吸收利用的影響研究還未見報(bào)道。另外，植物對(duì)氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饑餓時(shí)會(huì)影響植物對(duì)氮的吸收[28]。為此，以O(shè)spil15突變體為材料，研究正常磷和低磷條件下OsPIL15基因?qū)α孜绽玫挠绊?，并進(jìn)一步分析OsPIL15基因?qū)Φ绽玫挠绊?，以期為解析OsPIL15基因調(diào)節(jié)磷、氮吸收利用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 水稻材料
本研究使用的水稻材料為日本晴(Nipponbare,Nip)和Ospil15突變體。Ospil15突變體是以日本晴為背景，利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的敲除突變體的T8材料。
1.2 OsPIL15基因在低磷脅迫下的表達(dá)分析
登錄Transcriptome ENcyclopedia of Rice數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)，輸入OsPIL15轉(zhuǎn)錄本號(hào)進(jìn)行查詢，獲得在正常和低磷脅迫下的OsPIL15基因表達(dá)量并進(jìn)行分析。
1.3 材料培養(yǎng)及低磷脅迫處理
水稻材料在人工氣候室(光照2 000 lx、16 h、28 ℃/黑暗8 h、22 ℃)培養(yǎng)。挑選飽滿的水稻種子，用9%NaClO消毒10 min，自來水沖洗6次，蒸餾水洗5～6次，然后在28 ℃黑暗條件下置于無菌水中浸泡催芽2～3 d。將萌發(fā)一致的種子移到96孔板中，先用清水在人工氣候室培養(yǎng)7 d，然后采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行磷處理，正常磷(Normal P，CK)處理濃度為300 μmol/L NaH2PO4，低磷(Low P，LP)脅迫處理濃度為10 μmol/L NaH2PO4。前3 d分別配制1/4、1/3、1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，此后采用Hoagland全濃度營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換一次，培養(yǎng)至四葉一心時(shí)測(cè)定生物量和磷、氮含量。
1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法
1.4.1 生物量 分別挑選正常磷與低磷脅迫處理的水稻植株各10株，用去離子水反復(fù)清洗根及葉表面，吸水紙吸干其表面水分，使用直尺測(cè)量地上部與根長(zhǎng)度，隨后置于烘箱中，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量。
1.4.2 磷、氮含量 將材料剪碎至粉末狀，混合均勻后稱取0.2 g樣品置于消煮管中，采用H2SO4-H2O2消煮法進(jìn)行消煮，用去離子水將消煮液定容至50 mL，再用10 mm定量濾紙將其過濾至10 mL離心管中，使用AA3流動(dòng)注射分析儀進(jìn)行氮、磷含量測(cè)定，并計(jì)算磷和氮吸收效率、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、利用率。
吸收效率=單株磷或氮含量/單株根干質(zhì)量×100%；
轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=地上部磷或氮含量/根磷或氮含量；
利用率=單株氮或磷含量/單株干質(zhì)量×100%。
2 結(jié)果與分析
2.1 低磷脅迫條件下OsPIL15基因表達(dá)分析
已報(bào)道擬南芥PHYB通過PIF4/PIF5 和HY5調(diào)節(jié)磷饑餓響應(yīng)基因來調(diào)控磷的吸收[20]。為了研究水稻光敏色素互作因子基因OsPIL15在水稻中是否能夠調(diào)控磷的吸收，利用已有基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)Transcriptome ENcyclopedia of Rice(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)提取OsPIL15基因在低磷脅迫(0 μmol/L NaH2PO4)下的表達(dá)量，然后進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫下，OsPIL15基因在水稻地上部的表達(dá)量下降，而在根中的表達(dá)量基本不變(圖1)，這表明OsPIL15基因響應(yīng)磷脅迫，可能具有調(diào)節(jié)水稻磷吸收的功能。
2.2 OsPIL15基因?qū)λ旧L(zhǎng)的影響
由于OsPIL15基因受低磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，故利用前期構(gòu)建的敲除突變體材料Ospil15[26,29]，以野生型Nip為對(duì)照，設(shè)置正常磷(300 μmol/L)和低磷(10 μmol/L)2種磷濃度，研究低磷脅迫對(duì)Ospil15突變體和Nip生物量的影響。結(jié)果表明，低磷脅迫后Nip和Ospil15突變體的地上部長(zhǎng)均降低，但是Nip降幅大于Ospil15突變體；低磷脅迫后，Nip根長(zhǎng)變短，Ospil15突變體根長(zhǎng)基本沒有變化(圖2a)。低磷脅迫后，Ospil15突變體和Nip的根、地上部干質(zhì)量均降低，根干質(zhì)量降低幅度小于地上部干質(zhì)量(圖2b)。2個(gè)材料相比，低磷脅迫后Ospil15突變體與Nip地上部干質(zhì)量降低幅度基本一樣，但Nip根干質(zhì)量降低幅度(72.2%)大于Ospil15突變體(68.1%)。這表明低磷脅迫后Ospil15突變體的生長(zhǎng)受影響較野生型小，特別是Ospil15突變體的根。
對(duì)低磷脅迫后的2個(gè)材料根長(zhǎng)與地上部長(zhǎng)的比值以及根干質(zhì)量與地上部干質(zhì)量的比值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低磷脅迫后根長(zhǎng)/莖長(zhǎng)、根干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量均增大(圖2c、d)，這表明在低磷脅迫條件下水稻通過自身協(xié)調(diào)后更加側(cè)重了根的生長(zhǎng)。
2.3 OsPIL15基因?qū)λ玖孜辙D(zhuǎn)運(yùn)的影響
本研究測(cè)定了Ospil15突變體和Nip 2個(gè)材料中的磷含量來分析OsPIL15基因?qū)λ玖姿匚盏挠绊?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常磷條件下，Ospil15突變體根中磷含量顯著大于Nip，Ospil15突變體地上部中磷含量大于Nip但不顯著(圖3a)。低磷脅迫條件下，2個(gè)材料單株磷含量均比正常磷條件下降低(圖3a、b)。低磷脅迫條件下，Ospil15突變體根中磷含量顯著高于Nip，地上部中磷含量顯著高于Nip(圖3b)。分析二者磷吸收效率發(fā)現(xiàn)，正常磷和低磷脅迫條件下Ospil15突變體磷吸收效率均大于Nip，低磷脅迫條件下增幅更大(圖3c)。綜上，無論是正常磷還是低磷脅迫條件下，Ospil15突變體磷含量和磷吸收效率均大于Nip，說明OsPIL15基因負(fù)調(diào)控水稻磷吸收，并且在低磷脅迫條件下OsPIL15基因?qū)λ玖孜盏呢?fù)調(diào)控作用更強(qiáng)。
對(duì)Ospil15突變體和Nip的磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在正常磷條件下，Nip的磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)高于Ospil15突變體；在低磷脅迫條件下，Ospil15突變體的磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)大于Nip(圖3d)。這表明OsPIL15基因不僅影響水稻磷吸收，也調(diào)控磷從根向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。
2.4 OsPIL15基因?qū)λ镜辙D(zhuǎn)運(yùn)的影響
氮是植物吸收的大量元素之一，植物對(duì)氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饑餓時(shí)會(huì)影響植物對(duì)氮的吸收[28]。因此，本研究分析了Ospil15突變體和Nip中的氮含量來研究OsPIL15基因是否調(diào)控氮吸收。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫條件下，Ospil15突變體和Nip氮含量均比正常磷條件下降低(圖4a、b)。Ospil15突變體在正常磷條件下，地上部中氮含量顯著大于Nip，根中氮含量無顯著差異；低磷脅迫條件下，根中氮含量顯著大于Nip，地上部中氮含量無差異(圖4a、b)。分析Ospil15突變體和Nip在正常磷和低磷脅迫條件下氮吸收效率，發(fā)現(xiàn)Ospil15突變體在正常磷和低磷脅迫條件下的氮吸收效率均高于Nip(圖4c)。另外，分析正常磷和低磷脅迫條件下Ospil15突變體和Nip的氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)磷濃度降低后Ospil15突變體和Nip的氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均降低。在正常磷條件下，Ospil15突變體氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)與Nip基本一致；低磷脅迫條件下，Ospil15突變體氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)小于Nip(圖4d)。綜上，Ospil15突變體提高了水稻氮吸收；在低磷脅迫條件下，Ospil15突變體提高了根中氮含量，但減少了氮從根向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。上述結(jié)果表明，OsPIL15基因負(fù)調(diào)控水稻氮吸收，且正調(diào)控氮從根向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。
2.5 OsPIL15基因?qū)λ玖?、氮利用率的影?/h3>
本研究不僅分析了Ospil15突變體對(duì)氮、磷吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，還分析了其對(duì)磷、氮利用率的影響。對(duì)Ospil15突變體和Nip的磷、氮利用率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ospil15突變體在正常磷和低磷脅迫條件下磷、氮利用率均大于Nip(圖5a、b)。這表明OsPIL15基因?qū)λ镜?、磷利用率亦有?fù)調(diào)控作用。
3 結(jié)論與討論
磷是植物吸收利用的大量元素之一，我國(guó)有2/3的耕地缺磷，同時(shí)我國(guó)存在磷肥施用量大而利用率低的浪費(fèi)情況。磷礦是不可再生資源，且磷礦資源的消耗加劇[30]。因此，必須改良栽培技術(shù)和培育高效吸收利用磷的作物品種。本研究以基因編輯技術(shù)獲得的Ospil15突變體為研究材料，發(fā)現(xiàn)Ospil15突變體能提高對(duì)磷的吸收利用，這為培育高效吸收利用磷水稻品種和解析水稻磷吸收機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
本研究發(fā)現(xiàn)，OsPIL15基因?qū)Φ土酌{迫有響應(yīng)，推測(cè)OsPIL15基因可能調(diào)控水稻磷吸收。在低磷脅迫條件下，Nip和Ospil15突變體單株磷含量均較正常磷條件下降低，這與郭再華等[31]的結(jié)論一致。Nip和Ospil15突變體在低磷脅迫條件下根長(zhǎng)/地上部長(zhǎng)和根干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量均增加，這與劉文菊等[32]研究結(jié)果一致。低磷脅迫條件下，Ospil15突變體根長(zhǎng)和地上部長(zhǎng)降低幅度小于Nip，根干質(zhì)量降幅小于Nip，地上部干質(zhì)量降幅與Nip相近，說明其比野生型耐低磷。
Ospil15突變體無論在正常磷還是在低磷脅迫條件下均表現(xiàn)出較高的磷含量和磷吸收效率，這表明OsPIL15基因負(fù)調(diào)控水稻對(duì)磷的吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，Ospil15突變體較野生型磷含量增加，說明OsPIL15基因負(fù)調(diào)控磷素吸收，與SAKURABA等[20]報(bào)道的光敏色素互作因子負(fù)調(diào)控磷吸收一致。
植物對(duì)氮、磷吸收存在互作現(xiàn)象[33-35]，低磷脅迫條件下水稻、煙草、大麥、玉米和大豆等作物氮吸收均減少[36-39]。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Ospil15突變體在正常磷條件下顯著提高了地上部中氮含量，低磷脅迫條件下顯著提高了根中氮含量；氮吸收系數(shù)在正常磷與低磷脅迫條件下均大于野生型。這表明OsPIL15基因在磷、氮互作下負(fù)調(diào)控氮素吸收。OsPIL15基因除調(diào)控磷、氮吸收外，對(duì)磷、氮的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用亦有調(diào)控。與野生型相比，Ospil15突變體在正常磷條件下降低磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，在低磷脅迫條件下提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、降低氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，在正常磷和低磷脅迫條件下均提高了磷、氮利用率。這表明OsPIL15基因在調(diào)控水稻磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及氮、磷互作方面的機(jī)制十分復(fù)雜。
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