孫耀華，王瀚，李雪瑩，楊慧玲，白辰光

根據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心于2018年發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌(colorectal cancer)在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第3位和第5位[1]，且表現(xiàn)出城市發(fā)病率高于農(nóng)村、出現(xiàn)低齡化趨勢(shì)等特點(diǎn)[2]，嚴(yán)重威脅人民身體健康。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的多步驟復(fù)雜過(guò)程，其中抑制癌基因TP53突變是結(jié)直腸癌最常見分子事件之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療等各個(gè)環(huán)節(jié)均有明顯的相關(guān)性[3]。盡管TP53基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌致瘤作用已得到廣泛證實(shí)，但接近半數(shù)腫瘤的TP53基因?yàn)橐吧停琓P53基因突變型和野生型結(jié)直腸癌之間的差異意義尚未完全明確。為此，本研究采用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中的癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas)公共數(shù)據(jù)集，在明確2種亞型臨床病理特征差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析基因突變譜的差異，為結(jié)直腸癌精準(zhǔn)分型和靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料下載 本研究從cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cbioportal.org/)下載TCGA結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)資料(GDAC firehose)。該數(shù)據(jù)資料包括640例結(jié)直腸癌樣本，其中220例有完整的基因突變信息和對(duì)應(yīng)的臨床病理信息。

1.2 TP53基因突變信息和臨床病理特征提取 應(yīng)用Gene選項(xiàng)分析設(shè)置“Mutation”為篩選條件，輸入查詢基因：“TP53”，下載TP53基因突變信息，包括突變類型、外顯子分布、蛋白改變等。根據(jù)TP53基因突變狀態(tài)將220例具有完整基因突變信息的腫瘤分為TP53突變型和野生型2種亞型。下載2種亞型腫瘤的臨床病理信息，包括年齡、性別、部位、TNM分期、淋巴管侵犯、血管侵犯、腫瘤突變計(jì)數(shù)(tumor mutation count)和基因組變異片段(fraction genome altered, FGA)等。腫瘤突變計(jì)數(shù)，即每例腫瘤的突變個(gè)數(shù)，以192為界值分為高突變負(fù)荷和低突變負(fù)荷[4]。FGA以5%為界值分為染色體穩(wěn)定性和染色體不穩(wěn)定性[5]。

1.3 基因突變譜差異數(shù)據(jù)提取 應(yīng)用Gene選項(xiàng)分析設(shè)置“Mutation”為篩選條件，輸入查詢基因，篩選條件為突變頻率(該基因在本組所有病例中的突變發(fā)生率)≥5%的基因：TP53、APC、KRAS、NRAS、BRAF、LRP1B、FAT4、FBXW7、PIK3CA、SMAD4、ATM、AMER1、RELN、ARID1A、CREBBP、MYH11、ERBB4、GRIN2A、PCLO、LRRK2、LIFR、CHD4、DNMT1、MTOR、MKI67、ROBO1、TRRAP、TET1、EPHA3、POLE、TCF7L2、EP400、ARID2、ACVR1B、ZFHX3、CDH11、ERBB3、LRP6、SMAD2、NOTCH3、PTPRT、RNF213、ALK、EPHA5、FAT1、KMT2A、PIK3CG、PRKD1、PRKDC、ROS1、TPR、KMT2D、SPEN、SETD2、EP300、AFF3、NOTCH2、IRS4、STAG1、MGA、ZNF521、KMT2C、ATR、CTNNA1、CTNNB1、ESR1、FLT1、MYH9、PDGFRA、PTPRC、PTPRD、RANBP2、MAP2K4、VAV1、KAT6A、KMT2B、MED12、GPHN、LARP4B、SETBP1、RNF43、PREX2。病例選擇“samples with mutation and CNA data (220)”。下載TP53突變型和野生型2種亞型結(jié)腸癌的基因突變數(shù)據(jù)。

1.4 差異基因蛋白的相互作用及生物功能及信號(hào)通路分析 采用String(https://string-db.org/)在線工具分析差異基因蛋白的相互作用，物種屬性設(shè)置為“homo sapiens”，灰色連線代表蛋白相互作用的強(qiáng)度，連線越粗代表相互作用越強(qiáng)。預(yù)測(cè)信息來(lái)自實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)、共表達(dá)、相鄰基因和共存。聚類分析采用Kmeans clustering分析，將差異基因蛋白分為3個(gè)亞簇。采用Funrich軟件進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋以及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，標(biāo)注基因數(shù)排列在前10位的項(xiàng)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphd軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 220例結(jié)直腸癌患者的臨床病理和基因突變特征 220例結(jié)直腸癌患者年齡為(69.09±11.71)歲，其中男性114例(51.8%)，女性106例(48.2%)。77例(35.0%)腫瘤位于右半結(jié)腸、76例(34.5%)腫瘤位于左半結(jié)腸、65例(29.5%)腫瘤位于直腸，另有2例結(jié)腸腫瘤未明確標(biāo)注具體位置。基因突變分析表明排在前10位的突變基因分別是APC(160/220, 72.7%)、TP53(120/220, 54.5%)、KRAS(96/220, 46.6%)、LRP1B(42/220, 19.1%)、FAT4(39/220, 17.7%)、FBXW7(39/220, 17.7%)、SMAD4(33/220, 15.0%)、PIK3CA(32/220, 14.5%)、ATM(27/220, 12.3%)、AMER1(26/220, 11.8%)。

2.2 結(jié)直腸癌TP53基因突變類型及外顯子分布特征 120例結(jié)直腸癌存在TP53基因突變，突變率為54.5%。TP53基因突變類型為缺失突變82例(68%)，無(wú)義突變20例(17%)、移碼缺失突變10例(8%)、移碼插入突變6例(5%)、剪切突變1例(0.8%)、框內(nèi)缺失1例(0.8%)。除1例未標(biāo)注外，119例TP53突變型結(jié)腸癌的TP53基因突變分布分別位于外顯子3(1/120, 0.8%)、外顯子4(10/120, 8%)、外顯子5(35/120, 29%)、外顯子6(15/120, 12.5%)、外顯子7(21/120, 17.5%)、外顯子8(28/120, 23.3%)、外顯子9(5/120, 4%)、外顯子10(4/120, 3%)。

2.3 TP53突變型和野生型結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征分析 根據(jù)TP53突變狀態(tài)，將220例結(jié)直腸癌分為TP53突變型(120例)和野生型(100例)2種亞型。2種亞型患者的臨床理特征相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TP53基因突變多發(fā)于左半結(jié)腸和直腸(P<0.05)。TP53突變型結(jié)直腸癌中，F(xiàn)GA≥5%的例數(shù)顯著增多(P<0.01)，而高突變負(fù)荷的腫瘤比例顯著減少(P<0.01)。2組腫瘤在年齡、性別、TNM分期、淋巴管和血管侵犯方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.4 TP53突變型和野生型結(jié)直腸癌的基因突變譜分析 進(jìn)一步比較TP53突變型和野生型結(jié)直腸癌的基因突變譜差異，選用突變例數(shù)≥10例的基因，共81個(gè)，其中突變率≥10%的基因突變瀑布圖和熱圖見圖1。如表2所示，包括APC、KRAS、NRAS、SMAD4在內(nèi)的56個(gè)基因在2種亞型結(jié)直腸癌中的突變率無(wú)明顯差異。但是，基因LRP1B、FAT4、FBXW7、PIK3CA、ATM、RELN、CREBBP、ROBO1、BRAF、AMER1、MYH11、POLE、ZFHX3、SETD2、TET1、EP400、NOTCH3、RNF43、PTPRC、LARP4B、PDGFRA、MAP2K4、KMT2A、EP300、VAV1在TP53野生型結(jié)直腸癌中的突變率明顯增高，與TP53突變型結(jié)直腸癌相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 差異基因蛋白的相互作用及生物功能及信號(hào)通路分析 采用String在線工具分析差異基因表達(dá)蛋白之間的交互作用，并做kmeans聚類分析。差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中共有25個(gè)節(jié)點(diǎn)，50條邊，kmeans聚類分析將差異基因蛋白分為3個(gè)亞簇。其中21個(gè)蛋白之間存在直接或間接作用，EP300、KMT2A、CREBBP、NOTCH之間存在緊密連接；另外BRAF、PIK3CA、PDGFRA、VAV1之間存在緊密連接，見圖2。采用Funrich軟件進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析差異基因。在TP53野生型結(jié)直腸癌中，分子功能富集到17項(xiàng)，主要與DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞粘附及蛋白激酶和受體活性等相關(guān)。細(xì)胞位置富集到25項(xiàng)，差異基因主要位于細(xì)胞核，其次是細(xì)胞漿。參與的生物過(guò)程富集到7項(xiàng)，主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞交流、調(diào)控細(xì)胞增生和生長(zhǎng)相關(guān)。KEGG通路富集到334條通路，排在前位生物過(guò)程的主要與PDGFR、EGFR、VEGFR、PI3K信號(hào)通路等相關(guān)。

圖2 結(jié)直腸癌突變率差異基因表達(dá)蛋白之間的交互作用及聚類分析

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的多階段復(fù)雜過(guò)程，包括抑癌基因的失活、癌基因的激活以及各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常等。在本組數(shù)據(jù)中，220例結(jié)直腸癌就存在上百個(gè)基因發(fā)生突變。野生型TP53是重要的抑癌基因，其能通過(guò)多種機(jī)制抑制細(xì)胞分裂和增殖、促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡等，從而發(fā)揮著腫瘤抑制作用[6]。經(jīng)過(guò)多年的研究，TP53基因在惡性腫瘤中的作用受到越來(lái)越多的重視，現(xiàn)已證實(shí)在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變[7]。在本組數(shù)據(jù)中，TP53的突變率為54.5%，突變位點(diǎn)主要位于外顯子5和8，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致[8]。

通過(guò)比對(duì)TP53突變型和野生型結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征，本研究數(shù)據(jù)提示TP53突變型結(jié)直腸癌好發(fā)于左半結(jié)腸及直腸，而TP53野生型結(jié)直腸癌則好發(fā)于右半結(jié)腸。有研究表明左半結(jié)腸和右半結(jié)腸的胚胎起源不同，解剖生理各異，這提示盡管臨床病理表現(xiàn)一致，來(lái)自左半結(jié)腸和右半結(jié)腸的結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制有所不同[9-10]。目前研究顯示，左半結(jié)腸癌與抑癌基因(例如APC、TP53、SMAD4等)的失活，KRAS基因突變以及CpG島甲基化表型相關(guān)；而右半結(jié)腸癌則與癌基因的激活、BRAF基因突變、MLH1基因的甲基化失活、腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定相關(guān)。本研究也提示，發(fā)生于左半結(jié)腸和直腸的腸癌病例抑癌基因TP53 突變率明顯高于發(fā)生于右半結(jié)腸的病例。

本研究發(fā)現(xiàn)TP53突變型結(jié)直腸癌中FGA≥5%的腫瘤例數(shù)顯著增高，這表明TP53突變型結(jié)直腸癌更容易產(chǎn)生染色體不穩(wěn)定性。染色體不穩(wěn)定性是癌癥的標(biāo)志之一，它是由于有絲分裂過(guò)程中染色體分離持續(xù)出現(xiàn)錯(cuò)誤而所致。當(dāng)前，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明TP53突變與染色體不穩(wěn)定性密切相關(guān)[11]，攜帶TP53基因突變的腫瘤細(xì)胞多為非整倍體(aneuploid)。其中重要的機(jī)制就是，野生型p53蛋白可誘導(dǎo)出現(xiàn)異常有絲分裂細(xì)胞凋亡壞死，進(jìn)而限制染色體不穩(wěn)定性的產(chǎn)生；而TP53基因突變所導(dǎo)致的p53蛋白功能喪失，則增加染色體不穩(wěn)定性[12-13]。

此外，分析數(shù)據(jù)表明TP53野生型結(jié)直腸癌中高突變負(fù)荷腫瘤數(shù)目顯著高于TP53突變型結(jié)直腸癌，與Cai等[14]在胃癌中的研究結(jié)果相一致。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明突變負(fù)荷會(huì)影響腫瘤免疫原性。高突變負(fù)荷腫瘤中含有大量記憶CD4+T細(xì)胞、活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，因而其對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療(如PD-1/PD-L1、CTLA-4等)更為有效[15]。2017年，Colli等[4]學(xué)者的研究進(jìn)一步提示，以腫瘤突變個(gè)數(shù)192為界值，可以更好地篩選免疫檢查點(diǎn)抑制劑受益患者。以上結(jié)果在另一方面也提示，TP53野生型結(jié)直腸癌患者中免疫檢查點(diǎn)抑制劑受益患者要多于TP53突變型結(jié)直腸癌患者。

筆者進(jìn)一步比對(duì)TP53突變型和野生型結(jié)直腸癌患者的基因突變譜差異，共篩選出25個(gè)基因更好發(fā)于TP53野生型結(jié)直腸癌?；赟tring分析構(gòu)建差異基因蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)有21個(gè)差異基因蛋白之間存在直接或間接作用。GO注釋和KEGG分析表明篩選出的25個(gè)差異基因主要發(fā)揮著DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等分子功能，并主要富集在PDGFR、EGFR、VEGFR、PI3K等信號(hào)通路，提示TP53野生型結(jié)直腸癌通過(guò)新的基因突變、激活以上通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展。

綜上所述，雖然除發(fā)生部位外，TP53突變型和野生型結(jié)直腸癌存在相似的臨床病理形態(tài)學(xué)特征，但是2種亞型腫瘤的基因突變譜不同。TP53突變型結(jié)直腸癌更容易發(fā)生染色體不穩(wěn)定性；而TP53野生型結(jié)直腸癌突變負(fù)荷增高，其可通過(guò)產(chǎn)生新的基因突變，激活非p53信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。