陳湖芳，姚新轉(zhuǎn)，王璐，張寶會，呂立堂,※

（1.貴州大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院，貴州 貴陽 550025）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是中國特有植物，屬于杜仲科杜仲屬落葉喬木，原產(chǎn)黃河以南，目前主要分布在我國中緯度地區(qū)，在醫(yī)藥、工業(yè)和綠化等方面有重要作用[1-3]。杜仲膠是一種天然高分子聚合物，其主要成分為反式-l,4-聚異戊二烯。天然橡膠主要成分為順式-l,4-聚異戊二烯，杜仲膠化學成分與天然橡膠相同，但分子結(jié)構(gòu)不同，它們互為同分異構(gòu)體，且杜仲膠合成過程與天然橡膠合成過程區(qū)別為反式異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（TPT）負責引發(fā)底物的合成，所摻入的C5單體呈反式構(gòu)型，形成杜仲膠；順式-異戊烯轉(zhuǎn)移酶（CPT）負責催化異戊二烯單體（IPP）多聚化，形成橡膠，所摻入的C5單體呈順式構(gòu)型。我們在很多植物中發(fā)現(xiàn)了異戊烯類化合物，它在植物代謝過程中有重要作用，例如IPPS（異戊烯基二磷酸合酶，又稱異戊烯基轉(zhuǎn)移酶）催化IPP與DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）縮合反應，形成GPP（牻牛兒基焦磷酸），合成各種異戊烯類的化合物[4]。

天然橡膠主要由順式-1,4-異戊二烯組成的高分子量的生物聚合物，它們由緊密結(jié)合在橡膠粒子上的酶定向運輸IPP而形成橡膠分子[5,6]。順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是天然橡膠合成的關鍵酶，催化IPP多聚化，形成長鏈橡膠，是橡膠生物合成的最后一步；此外，它還決定橡膠分子的大小、產(chǎn)膠量和橡膠的理化性質(zhì)等[7]。據(jù)文獻記載，最早被人們分離出來的CPT是擬南芥的ACPT（順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶），研究表明該酶雖然可以催化合成聚異戊二烯（大小為5.4 103～6.8 103Da），但無法形成分子量大于1 106Da的天然橡膠[8]。通過Northern blot雜交，結(jié)果顯示克隆的基因能夠在膠乳中大量地表達，但在橡膠樹的葉片中不表達，也不受乙烯的誘導。Schmidt等從蒲公英橡膠草（T.brevicorniculatum）克隆了TkCPT1-3基因，在釀酒酵母和煙草中實現(xiàn)了表達，結(jié)果為TkCPT1-3催化T.brevicornicu橡膠合成過程中IPP的多聚化過程，且TkCPT1-3的功能可能基本相同[9,10]。Post等[11]通過RNAi實驗干涉T.brevicornicu中TkCPT1-3基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株橡膠含量變低，形成橡膠粒子的數(shù)量減少，同時三萜含量和菊糖合成量增加明顯，HMGR蛋白活性下降。

CPT與UPPS（十一異戊烯基二磷酸合酶）屬于IPPS[4]。IPPS有2種，即催化合成反式雙鍵的E-IPPS（反式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶）和催化合成順式雙鍵的Z-IPPS（順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶）。CPT屬于Z-IPPS[Cis(Z)-Isoprenyl Diphosphate Synthases]超級家族。在原核生物中，橡膠轉(zhuǎn)移酶是天然橡膠合成的重要參與者，催化IPP多聚化過程。根據(jù)產(chǎn)物鏈長度，CPT分為3個亞家族：短鏈（C15）、中鏈（C50-C55）和長鏈（C70-C120）。據(jù)文獻報道，橡膠草和其他產(chǎn)橡膠植物的CPT具有強烈的保守性，所以TkCPT1、TkCPT2和TkCPT3有助于橡膠草中的橡膠生物合成。雖然各種產(chǎn)膠植物物種之間有一定差異，但天然橡膠生物合成的基本機制是相似的，都涉及了酶與膠乳中的橡膠粒子結(jié)合的過程，橡膠粒子是植物體內(nèi)天然橡膠的生物合成發(fā)生的場所，是一個非常繁雜的生物合成過程，因此，研究橡膠轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)及其生物學功能，對揭示橡膠生物合成的分子機理及橡膠分子量大小的決定機制具有重要意義[12]。本實驗嘗試通過超量表達TkCPT1基因使合成反式-1,4-聚異戊二烯橡膠的杜仲合成順式-1,4-聚異戊二烯橡膠。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

外植體：杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）下胚軸，由無菌的杜仲苗得到，用于遺傳轉(zhuǎn)化材料。遺傳轉(zhuǎn)化菌株：農(nóng)桿菌（菌株LBA4404）、大腸桿菌（菌株DH5E）；雙子葉植物表達載體pSH737，報告基因為gus::nptII。

1.2 實驗方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 用無菌刀片將杜仲無菌苗下胚軸切成0.5 cm左右莖段備用，重懸液重新懸浮農(nóng)桿菌，使菌液與下胚軸充分接觸，侵染30 min。

將杜仲下胚軸從菌液中迅速取至無菌濾紙，吸干菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)2～3 d。轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待抗性芽形成。

對照組：未浸染農(nóng)桿菌下胚軸，置于WT培養(yǎng)基中，WT培養(yǎng)基中不添加抗生素，其他條件都相同。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因杜仲煉苗與移栽 選取長勢良好的杜仲抗性芽，與無菌苗嫁接，25℃培養(yǎng)1個月，待有新芽長出，進行7 d的煉苗處理（期間保證葉片不能失水），洗凈嫁接苗根部培養(yǎng)基，移栽至溫室（相對濕度：80%～90%，溫度：20～28℃）中培養(yǎng)，并搭建透氣透光的遮陽網(wǎng)對其進行遮陽保護。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學染色 剪取杜仲葉片、莖、根和愈傷組織，放入離心管中，添加適量GUS染色液使其完全浸沒，真空泵真空5min；37℃培養(yǎng)箱中放置過夜；倒掉GUS染液，用乙醇溶液對染色組織進行梯度脫色至綠色褪去（梯度：50%-70%-95%-99.99%的無水乙醇）。體式顯微鏡下觀察GUS染色情況，并拍照。

1.2.4 杜仲植株DNA提取與PCR鑒定 杜仲基因組DNA提取參照DNA提取試劑盒說明書（天根生化科技有限公司）。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因杜仲與野生型杜仲代謝組

1.2.5.1 樣品信息 待測樣本信息：轉(zhuǎn)基因組和野生型組，每組選用1個株系，6份生物學重復，樣本見表1，具體方法參考Benton的研究[13]，表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample informations

1.2.5.2 樣本預處理方法 80℃取出杜仲轉(zhuǎn)基因苗，液氮研磨至粉末，稱取60 mg，1 mL甲醇乙腈水溶液（2:2:1，體積比）渦旋60s，低溫2次超聲，30min/次，20℃沉淀蛋白1 h，過濾管過濾，14 000 rcf，4℃離心20 min，取上清液，冷凍干燥，80℃保存樣本。

1.2.5.3 色譜-質(zhì)譜分析

（1）色譜分析

色譜系統(tǒng)：Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）；色譜柱：HILIC；柱溫25℃；流速0.3 mL/min。

流動相：A相：水+25 mM乙酸銨+25 mM氨水；B相：乙腈。

梯度洗脫程序：測量樣品和QC樣品隊列隨機混合進行分析，QC樣品用于監(jiān)測評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實驗數(shù)據(jù)可靠性。進樣溫度為4℃，具體步驟見表2。

表2 色譜條件Table 2 Chromatographic conditions

（2）Q-TOF質(zhì)譜分析：

采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測。樣品經(jīng)UHPLC分離后用Agilent 6550質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，具體參數(shù)見表3。

表3 質(zhì)譜條件Table 3 Mass spectrometry conditions

代謝物鑒定：樣本檢測完畢后，采取AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀對代謝物進行鑒定，采集QC樣品的一級、二級譜圖。ESI源條件見表4。

表4 ESI源條件Table 4 ESI source conditions

二級質(zhì)譜分析：二級質(zhì)譜采用information dependent acquisition（IDA）的high sensitivity模式，具體條件見表5。

表5 二級質(zhì)譜條件Table 5 Secondary MS conditions

數(shù)據(jù)采集按質(zhì)量范圍進行分段，每個方法每段采集4個重復。所采集獲得的數(shù)據(jù)，使用自建MetDDA和LipDDA方法，進行代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.6 杜仲膠結(jié)構(gòu)的測定

1.2.6.1 杜仲膠的提取 采用多個株系混樣提取：本實驗是由12個株系的轉(zhuǎn)基因杜仲進行混樣提膠，野生型同轉(zhuǎn)基因方法一致，杜仲膠采用傳統(tǒng)堿煮法提取橡膠[14]：將干燥的杜仲莖葉放入0.1%的NaOH溶液中，置于磁力攪拌器上于50℃攪拌浸煮3 h，篩洗后干燥，粉碎后過60目篩，取5 g樣品在索氏提取器中石油醚回流提取2 h，得到橡膠。

1.2.6.2 實驗方法 紅外光譜法測定：用丙酮從樣品中提取抽提物，在室溫下用氯仿將足量的抽提后的橡膠溶解，得到濃縮溶液。在碘化鉀鹽片上滴幾滴濃縮溶液，讓溶劑揮發(fā)完全，紅外光譜儀記錄4 000～600 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜。確認光譜圖中沒有溶劑吸收帶存在，同時譜帶沒有偏差或者吸收太弱，以野生型杜仲為對照組，轉(zhuǎn)基因杜仲為實驗組。

2 結(jié)果分析

2.1 農(nóng)桿菌介導杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

外植體采用杜仲無菌苗葉片和莖，通過農(nóng)桿菌介導下胚軸轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，在對杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化后，確定統(tǒng)一的遺傳轉(zhuǎn)化方法進行轉(zhuǎn)基因杜仲抗性芽的獲得，嫁接到杜仲無菌苗上，嫁接后的杜仲在無菌環(huán)境下25℃培養(yǎng)1個月，待嫁接接穗的再生芽有新葉長出且杜仲苗生長穩(wěn)定后，將穩(wěn)定的嫁接苗植株進行煉苗處理，使其適應外在環(huán)境，煉苗過程中應避免葉片水分散失。煉苗3～4 d，將根部培養(yǎng)基洗凈，移栽到溫室土壤中培養(yǎng)，具體培養(yǎng)過程如圖1所示。

圖1 轉(zhuǎn)基因杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.1 Genetic transformation of Oliver with gene

杜仲苗移栽植株成活后剪取嫩葉和莖進行-葡糖苷酶（-glucosidase,Gus）組織化學染色，初步鑒定轉(zhuǎn)基因情況（圖2 A和2 F），選取Gus染色結(jié)果為藍色的植株，提取基因組DNA進行PCR鑒定（圖2 G），最終獲得杜仲轉(zhuǎn)基因植株76株。

圖2 轉(zhuǎn)基因杜仲的鑒定Fig.2 The identification of Oliver with gene

2.2.1 偏最小二乘判別分析（PLS-DA）為了探究WT和轉(zhuǎn)基因株系之間的次生代謝物差異情況，對轉(zhuǎn)基因株系（TP-2）和野生型杜仲進行代謝組檢測，選擇偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA）來實現(xiàn)對樣品類別的預測。用PLS-DA對TP組與WT組進行模型分析，建立PLSDA模型進行7次循環(huán)交互驗證，PLS-DA模型評價參數(shù)結(jié)果：正離子模式參數(shù)R2X、R2Y和Q2分別為0.513、0.99和0.757；負離子模式參數(shù)R2X、R2Y和Q2分別為0.74、0.996和0.927。R2Y和Q2接近1，表明此模型穩(wěn)定可靠。得分圖結(jié)果表明，TP組與WT組分布在2個不同的區(qū)域，因此當前建立的PLS-DA模型揭示了兩組之間存在明顯的代謝差異，見圖3。

圖3 樣品PLS-DA得分圖Fig.3 Sample PLS-DA score charts

2.2.2 差異代謝物的篩選 過濾掉與模型分類無關的信息，采用單維檢驗P值與OPLS-DA模型差異貢獻值（VIP:Variable importance in the projection）尋找差異性表達代謝物（顯著差異代謝物：P＜0.05且VIP＞1）。對轉(zhuǎn)基因樣品（TP）和野生型樣品（WT）進行分析，共鑒定出58種顯著性差異代謝物，TP相對于WT上調(diào)的物質(zhì)有43種，下調(diào)的物質(zhì)有15種，其中氨基酸類物質(zhì)占顯著差異代謝物總量的36.21%，且都為上調(diào)。表6為部分重要差異代謝物的鑒定結(jié)果（倍數(shù)FC：TP/WT的比值）。結(jié)果表明，差異代謝物集中分布在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、消化吸收和嘌呤嘧啶代謝以及氨基酸代謝等生物反應過程中。我們檢測與橡膠合成相關的差異代謝物倍半萜化合物（脫落酸）、三萜化合物（山楂酸和齊墩果酸）呈下調(diào)趨勢，而存在兩個單萜物質(zhì)（紫蘇醇和7,8-二氫--紫羅蘭酮）上調(diào)，這些萜類代謝物和橡膠有相同的合成前體物質(zhì)IPP。此外，還有兩個IPP合成前體物質(zhì)（D-赤蘚糖-4-磷酸和甲羥戊酸）含量也有所下降，見圖4。

表6 部分重要顯著差異代謝物的鑒定結(jié)果Table 6 Identification results of some important and significant metabolites

圖4 橡膠合成通路Fig.4 Rubber synthesis pathways

2.3 紅外光譜檢測轉(zhuǎn)基因杜仲與野生型杜仲膠的結(jié)構(gòu)

為進一步確定轉(zhuǎn)TkCPT1基因是否影響杜仲所產(chǎn)生橡膠的結(jié)構(gòu)，使用紅外光譜測定橡膠中聚異戊二烯的結(jié)構(gòu)，檢測結(jié)果如圖5所示。不同結(jié)構(gòu)分子吸收峰的位置不同，圖5 A為野生型杜仲的紅外光譜，圖5 B為轉(zhuǎn)基因杜仲的紅外光譜，波長數(shù)841 cm-1、842 cm-1為異戊二烯的反式-1,4-結(jié)構(gòu)雙鍵上碳-氫鍵變角振動吸收峰，波長數(shù)1 385cm-1為異戊二烯的反式-1，4-結(jié)構(gòu)雙鍵碳上甲基結(jié)構(gòu)的彎曲振動吸收峰，而轉(zhuǎn)基因反式-1,4-結(jié)構(gòu)的峰附近都有一個區(qū)別于野生型的峰，波數(shù)也極 為相近，分別是1 351 cm-1和830 cm-1。

圖5 杜仲膠的紅外光譜圖Fig.5 The Infrared spectrum of Eu-rubber

3 討論

根據(jù)Canli[15]和Barbulova[16]的報道，我們選擇了農(nóng)桿菌LB4404來介導杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化，通過PCR驗證獲得76株抗性杜仲，煉苗移栽共存活45株。

采用LC-MS/MS檢測分析轉(zhuǎn)基因杜仲與野生型杜仲代謝物差異，結(jié)果顯示，兩者之間存在58個顯著性差異代謝物，其中43個上調(diào)、15個下調(diào)。上調(diào)的顯著性差異代謝物主要為氨基酸，占總比的36.21%，說明轉(zhuǎn)基因與野生型樣品之間氨基酸組成存在顯著差異。在顯著性下調(diào)物質(zhì)中，海藻糖是一種對植物有保護作用的糖類，研究顯示海藻糖在細胞內(nèi)的積累更有助于植物體抵抗外界惡劣環(huán)境[17]，而轉(zhuǎn)基因杜仲中海藻糖下降反映出轉(zhuǎn)基因杜仲相對于野生型杜仲更難存活。代謝組檢測到與杜仲膠生物合成相關的代謝物總共有7種，其中甲羥戊酸和D-赤蘚糖-4-磷酸分別是MVA與MEP途徑中的關鍵物質(zhì)，MVA與MEP途徑是IPP合成的前體物[18,19]，IPP異構(gòu)化或聚合進一步形成各種萜類物質(zhì)、橡膠，轉(zhuǎn)基因植株中甲羥戊酸和D-赤蘚糖-4-磷酸的下調(diào)，推測為生成IPP，進一步轉(zhuǎn)入CPT從而使消耗增加，導致甲羥戊酸和D-赤蘚糖-4-磷酸消耗增加。5種萜類差異物質(zhì)中兩個單萜（紫蘇醇和7,8-二氫--紫羅蘭酮）出現(xiàn)含量上升，一個半倍萜（脫落酸）、兩個三萜（山楂酸和齊墩果酸）含量下降，說明TkCPT1對杜仲的萜類含量產(chǎn)生了影響。脫落酸是一種植物抵抗外界不良環(huán)境的調(diào)節(jié)激素，脫落酸含量的下降體現(xiàn)出植物的自我保護能力減弱。

紅外光譜檢測異戊二烯的反式-1,4-結(jié)構(gòu)特征峰位于1 385 cm-1、843 cm-1，順式-1,4-結(jié)構(gòu)特征峰位于1 376 cm-1、836 cm-1[20]（異戊二烯順式結(jié)構(gòu)與反式結(jié)構(gòu)的吸收峰十分接近），在轉(zhuǎn)基因杜仲的紅外光譜圖中我們發(fā)現(xiàn)兩個與反式結(jié)構(gòu)十分接近的峰，與順式-1,4-結(jié)構(gòu)的波數(shù)相差25個和6個單位，推測原因為超量表達TkCPT1基因使原本產(chǎn)生反式橡膠的杜仲中產(chǎn)生了順式的橡膠[21]，代謝組中IPP合成前體減少，IPP向橡膠合成的方向變化則進一步驗證了這個結(jié)果。由于橡膠與杜仲膠分子結(jié)構(gòu)式相同導致檢測難度大，目前還沒有明確的檢測方法，還有待進行更深入細致地研究，采用更靈敏、分辨率更高的方法來對其進行檢測，結(jié)合轉(zhuǎn)基因植株中基因表達量的高低來推測杜仲中是否合成了順式聚異戊二烯（橡膠）。

轉(zhuǎn)基因杜仲TkCPT1基因的表達，引起了杜仲中原有的代謝物發(fā)生變化，紅外檢測轉(zhuǎn)基因杜仲植株產(chǎn)生了2個區(qū)別于野生型的特征峰，且與順式-1,4-異戊二烯特征峰距離接近，推測超量表達TkCPT1基因可能在杜仲中產(chǎn)生順式聚異戊二烯，具體還需要進一步探索檢測方法。通過后續(xù)深入研究，繼續(xù)證實在轉(zhuǎn)基因杜仲植株產(chǎn)生順式-1,4-聚異戊二烯以及對杜仲膠顆粒大小進行對比，對闡明杜仲的產(chǎn)膠機制具有重要意義。