卜研，馮楚楚，閆喜軍，薛向紅

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

犬瘟熱（Canine Distemper,CD）是由犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus,CDV）感染多種肉食動物而引起的一種急性熱性、高度接觸性傳染病[1]。犬瘟熱病毒對不同宿主的易感性和致病性不同，死亡率為50%～100%。半個多世紀以來，犬瘟熱防控主要依賴于疫苗免疫，犬瘟熱弱毒活疫苗已經(jīng)在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用，且防控效果不錯。然而，近年來，世界各地出現(xiàn)了多起野生動物和家養(yǎng)動物感染犬瘟熱發(fā)生死亡的報道[2-5]，其發(fā)生機制尚不清楚。犬瘟熱病毒弱毒疫苗株是通過連續(xù)雞胚和細胞系傳代致弱獲得的，其基因型屬于美洲I型[3]。我國犬瘟熱病毒流行毒株主要是亞洲I型，并呈現(xiàn)多基因型流行的特征[6]。

犬瘟熱病毒屬于副黏病毒科麻疹病毒屬成員，其基因組是單股負鏈非分節(jié)段的RNA，從3'到5'端依次編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大聚合酶蛋白（L）6個結(jié)構(gòu)蛋白，以及V和C兩個非結(jié)構(gòu)蛋白[7]。其中，F(xiàn)和H蛋白暴露于病毒囊膜表面，決定著犬瘟熱病毒的細胞嗜性和致病性，同時也是關(guān)鍵的保護性抗原[8,9]。反向遺傳技術(shù)的發(fā)展和成熟，為我們系統(tǒng)性地研究病毒結(jié)構(gòu)與功能、感染與免疫機制提供了強有力的支撐。Veronika von Messling等[10]將犬瘟熱病毒疫苗株Onderstepoort的H基因替換為強毒CDV5804株的H基因，比較了其與親本毒株形成的合胞體大小、F和H蛋白表達量以及病毒生長動力。結(jié)果顯示，H蛋白決定了病毒感染細胞的趨向性和致病性。2010年Bevan Sawatsky和Veronika von Messling[10]構(gòu)建了將強毒株CDV5804的H基因替換為onderstepoort H基因的重組病毒5804P-HOL，發(fā)現(xiàn)此重組病毒雖然與親本強毒CDV5804保持了基本一致的生長特性，但卻對雪貂完全減毒或無毒。

因此，本研究為了明確我國流行分離的犬瘟熱病毒強毒HBF-1的毒力決定基因及其致病機制，利用此前已建立的犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的反向遺傳操作系統(tǒng)，將CDV強毒HBF-1的H基因替換為疫苗毒Onderstepoort的H基因，拯救獲得了表達疫苗毒H基因的嵌合病毒rHBF-vacH，該病毒可在Vero-dSlam中穩(wěn)定傳代，且病毒滴度穩(wěn)定達到107.0 TCID50/mL，超過親本毒株rHBF-1 105.0 TCID50/mL的滴度。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞、質(zhì)粒

犬瘟熱病毒強毒rHBF-1和疫苗毒Onderstepoort，表達犬源Slam受體的非洲綠猴腎細胞（Vero-dSlam）和倉鼠腎細胞（BSR），質(zhì)粒pcCDV3.2-HBF-1、pcCDV3.1-N、pcCDV3.1-P和pcCDV3.1-L，均由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所動物傳染病防控創(chuàng)新團隊保存。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent購自Roche公司；DL 15 000 DNA Marker、DL 2 000 DNA Marker購自TaKaRa；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自Axygen；總RNA提取試劑盒RNeasy mini kit購自QIAGEN；高保真酶Trans start Fast Pfu DNA polymerase、載體pEASY-Blunt cloning kit和2 Trans StartFast Pfu PCR Super Mix均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自Thermo公司；CDV N單克隆抗體（MAB）購自VMRD；綠色熒光（FITC）標記的羊抗鼠的二抗購自Proteintech公司；AF6000熒光顯微鏡購自Leica公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

以GenBank公布的犬瘟熱病毒疫苗毒Onderstepoort（AF378705）的H基因序列為參考，利用Primer Premier 6.0設(shè)計特異性引物見表1，用于擴增疫苗毒Onderstepoort的H基因，引物送上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 Onderstepoort株基因的擴增引物Table 1 Primers of thegene of Onderstepoort strain for a full-length cDNA clone construction

表1 Onderstepoort株基因的擴增引物Table 1 Primers of thegene of Onderstepoort strain for a full-length cDNA clone construction

注：下劃線部分為Pme I酶切位點，加粗部分為Pac I酶切位點。Note:The underlined are Pme I site,and the bold are Pac I site.

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1.4 替換疫苗毒H基因的全長重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)QIAGEN總RNA試劑盒的說明，提取病毒Onderstepoort細胞培養(yǎng)懸液的總RNA，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。使用引物HBF-ORF3-F/R（表1），以O(shè)nderstepoort的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用高保真DNA聚合酶進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小正確后凝膠回收。將回收純化的H基因目的片段連接至pEASY-Blunt載體上，獲得重組質(zhì)粒pEASY-Blunt-HBF-ORF3；酶切鑒定正確的質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒pEASY-Blunt-HBF-ORF3和全長質(zhì)粒pcCD V3.2-HBF-1分別用限制性內(nèi)切酶Pme I和Pac I雙酶切，之后分別回收純化目的片段與載體片段，并使用T4連接酶將二者連接，獲得的重組連接子用Pme I和Pac I雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性連接子送至上海生工生物工程技術(shù)股分有限公司測序。將測序正確的全長重組質(zhì)粒命名為pcCDV3.2-HBF-vacH（圖1）。

圖1 嵌合病毒rHBF-vacH的全長質(zhì)粒示意圖Fig.1 The schematic of a full-length cDNA recombinant plasmid with a replaced H gene of Onderstepoort strain

1.5 嵌合病毒的拯救

轉(zhuǎn)染前1d，于6孔板中接種2 105個BSR細胞/孔，第2天當細胞生長密度達60%以上時開始轉(zhuǎn)染，將全長重組質(zhì)粒pcCDV3.2-HBF-vacH與輔助質(zhì)粒pcCD V3.1-N、pcCDV3.1-P和pcCDV3.1-L分別按5g、1g、0.8g和0.5g的比例進行共轉(zhuǎn)染，使用X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑22L，具體轉(zhuǎn)染方法參照說明操作，共轉(zhuǎn)染3 h，更換為含10%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，取細胞懸液大約300L添加至密度約為80%的Vero-dSlam細胞上，35℃、5%CO2培養(yǎng)5～10 d，觀察CDV引起的典型合胞體病變（CPE）。待出現(xiàn)CPE后，凍融收集細胞及上清液，并繼續(xù)接種Vero-dSlam細胞進行傳代，將獲得的重組病毒命名為rHBF-vacH。

1.6 rHBF-vacH的RT-PCR鑒定

利用RNA提取試劑盒，分別提取wtHBF-1、rHBF-1和rHBF-vacH病毒懸液的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)普通PCR試劑盒2 Trans StartFast Pfu PCR SuperMix的說明操作，利用引物F3-F：TTCCTTCAAAAGCGTTTAAACTGCAACAAATAGTGGCG和F3-R：GGATTAATTAACACGGTCATCATCCCTCAGTTCAATTGA擴增wtHBF-1和rHBF-1的H基因，用引物HBF-ORF3-F/R擴增rHBF-vacH的H基因，PCR反應(yīng)總體系50L，其中2 Trans StartFast Pfu PCR Super Mix 25L，上游引物1L，下游引物1L，病毒cDNA 2L，ddH2O補齊至50L；PCR程序為95℃2 min，95℃20 s，59℃20 s，72℃30 s，40個循環(huán)；72℃7 min，將3個PCR產(chǎn)物分別回收純化后，用限制酶Cpo I酶切。Onderstepoort H基因中有Cpo I酶切位點，而wtHBF-1、rHBF-1的H基因中無此識別位點，同時，對從rHBF-vacH擴增獲得的H基因片段進行序列測定，確定其來源于Onderstepoort毒株。

1.7 rHBF-vacH的免疫熒光鑒定

將收獲的rHBF-vacH病毒懸液接種于Vero-dSlam細胞，待細胞出現(xiàn)CPE后，以多聚甲醛固定，一抗用抗CDV N蛋白單克隆抗體孵育1 h，二抗用FITC標記羊抗鼠IgG染色，最后在熒光顯微鏡的藍紫光下觀察綠色熒光。

1.8 rHBF-vacH的傳代特性

為確定嵌合病毒rHBF-vacH在體外是否穩(wěn)定遺傳，我們將rHBF-vacH在Vero-dSlam細胞上傳代9次，取每一代病毒液300L，測定其TCID50，使用軟件GrapPad Prism 6.0繪制病毒傳代圖譜。

2 結(jié)果

2.1 嵌合病毒rHBF-vacH的RT-PCR鑒定結(jié)果

用1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增后酶切產(chǎn)物的條帶大小，結(jié)果顯示，wtHBF-1、rHBF-1的H基因PCR產(chǎn)物不能被限制酶Cpo I切開，酶切產(chǎn)物仍然為2000 bp大小條帶，而因為Onderstepoort疫苗株的H基因含有Cpo I酶切位點，因此，嵌合病毒rHBF-vacH的H基因擴增產(chǎn)物被切為兩個條帶，分別是1 400 bp和600 bp（如圖2）。

圖2 rHBF-vacH的RT-PCR鑒定Fig.2 Digestion identifications of gene of rHBF-vacH

2.2 嵌合病毒rHBF-vacH的免疫熒光鑒定結(jié)果

將嵌合病毒rHBF-vacH感染Vero-dSlam細胞，觀察到典型細胞病變情況（圖3 A），同時空白對照細胞無病變（圖3 B），用犬瘟熱N蛋白單克隆抗體為一抗、FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，發(fā)生病變的細胞能與CDV N蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)出綠色熒光，呈陽性信號（圖3 C），而空白對照細胞無熒光，為陰性（圖3 D）。

圖3 rHBF-vacH的免疫熒光鑒定Fig.3 Immunofluorescence identifications of the rHBF-vacH in Vero-dSlam cells

2.3 rHBF-vacH的形態(tài)鑒定

重組病毒rHBF-vacH的細胞感染懸液通過復染，在電子顯微鏡下觀察，結(jié)果可見，一個視野下，有直徑約為150 nm左右的多個病毒粒子，病毒粒子表面有一層囊膜包裹，因此，可認為是副黏病毒（圖4）。

圖4 rHBF-vacH粒子的電鏡形態(tài)Fig.4 The morphology of rHBF-vacHin the electron microscope

2.4 rHBF-vacH在Vero-dSlam細胞上的穩(wěn)定傳代

rHBF-vacH重組病毒可在Vero-dSlam細胞上穩(wěn)定傳代，重組病毒在第2代時有明顯病毒滴度的增高。目前，傳到第9代時，病毒滴度最高可穩(wěn)定達到107.0 TCID50/mL（圖5），而親本毒株rHBF-1和野生毒株wtHBF-1的病毒滴度穩(wěn)定在105.0 TCID50/mL。

圖5 rHBF-vacH在Vero-dSlam細胞的傳代Fig.5 The virus titers of rHBF-vacH in Vero-dSlam over passages.

3 討論

近年來，在世界范圍內(nèi)，犬瘟熱病毒不斷進化，頻繁地跨宿主傳播，而且致病性呈增長趨勢[3]。犬瘟熱病毒的H蛋白是各個結(jié)構(gòu)蛋白和兩個非結(jié)構(gòu)蛋白中遺傳變異能力最大的，不同毒株H基因的核苷酸變異率達到11%[11]。從死亡的恒河猴分離的CDV Monkey-BJ01-DV株，是由犬科動物傳播的，CDV H蛋白特定的氨基酸突變導致病毒適于在猴子體內(nèi)增殖感染[2]。有研究表明，犬瘟熱病毒在動物體內(nèi)的選擇壓力下，使CDV H蛋白與Slam受體相互作用的附近位點發(fā)生有意義突變，因此認為犬瘟熱病毒流行毒株H基因的變異可能是導致疫苗免疫失敗的原因[12]。在CDV H蛋白上發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)的中和表位，研究證明，CDV H蛋白上的抗原決定部位，在麻疹病毒屬中的其他病毒中也被證明是免疫優(yōu)勢表位[13]。H蛋白作為病毒的囊膜蛋白，是誘導保護性中和抗體的關(guān)鍵抗原[14]，常被作為開發(fā)疫苗的靶標。Yanping Jiang等[15]開發(fā)了一種表達CDV H蛋白重組益生菌疫苗，用于鼻內(nèi)接種，誘發(fā)黏膜免疫，動物體內(nèi)的評價效果較好。Lina Yan等[16]以非復制完全型腺病毒為載體，構(gòu)建了表達犬瘟熱病毒H蛋白和狂犬病毒G蛋白的重組腺病毒rAd5-GH，其在小鼠和狐貍體內(nèi)激發(fā)了穩(wěn)定持久的保護性免疫應(yīng)答。H蛋白還是CDV重要的毒力因子，有研究將CDV強毒5804P的H基因替換為疫苗毒株的H基因，獲得的重組病毒維持了CDV強毒5804P的生長動力，但卻對雪貂完全不致死。該減毒重組病毒在感染初期仍然具有輕微的免疫抑制，與疫苗株相比，減毒重組病毒產(chǎn)生的抗體水平較低[10]。

因此，本研究利用已建立的犬瘟熱病毒強毒HBF-1的反向遺傳系統(tǒng)，將強毒HBF-1的H基因替換為疫苗毒Onderstepoort的H基因，通過病毒拯救，獲得了一株嵌合病毒rHBF-vacH。實驗結(jié)果表明，嵌合病毒rHBF-vacH的基因組中攜帶著疫苗毒Onderstepoort的H基因，嵌合病毒rHBF-vacH可以很快適應(yīng)VerodSlam細胞，從第2代開始，病毒滴度顯著提高，之后在Vero-dSlam細胞傳代培養(yǎng)，嵌合病毒rHBF-vacH的病毒滴度一直非常穩(wěn)定，可穩(wěn)定達到107.0 TCID50/mL。而親本毒株rHBF-1和wtHBF-1在Vero-dSlam細胞上的病毒滴度穩(wěn)定維持在105.0 TCID50/mL左右。犬瘟熱病毒借助其表面的H蛋白與宿主細胞Slam受體相結(jié)合，促進病毒囊膜與細胞膜融合，使犬瘟熱病毒的核衣殼侵入細胞[17]。嵌合病毒比親本病毒的滴度高，其原因可能是疫苗毒的H蛋白與Slam受體親和力較高，促使攜帶疫苗毒H基因的嵌合病毒rHBF-vacH更容易在Vero-dSlam間傳播增殖。未來，我們將在體內(nèi)評價比較分離株wtHBF-1和嵌合病毒rHBF-vacH的致病性，為后續(xù)犬瘟熱疫苗的精準設(shè)計提供參考。