夏廣清，王 巖，張露云，臧 皓*

（1.通化師范學(xué)院長(zhǎng)白山生物種質(zhì)資源研究院，通化134002；2.通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，通化134002；3.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化134002）

鹿角，是鹿科動(dòng)物馬鹿或梅花鹿已經(jīng)骨化完全的角，或者將鹿茸鋸掉后，第二年春天脫落下來(lái)的角基，功效廣泛且實(shí)用，可活血、濕陽(yáng)、補(bǔ)腎、強(qiáng)筋骨、行氣[1]。鹿角多肽是從鹿角中分離得到的一類分子量在0.2kDa與10kDa之間的具有生物活性的多肽[2]。多肽由于結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單，可以被細(xì)胞直接吸收利用，愈來(lái)愈受到研究者的重視[3]。目前多肽的提取主要包括超濾法、層析法、高效液相色譜法和酶解法等，酶解技術(shù)是迄今為止最為重要的生物活性多肽方法[4]。本研究以梅花鹿角為原料，采用堿溶酸沉方法對(duì)其蛋白進(jìn)行提取，利用胰蛋白酶水解得到多肽，并對(duì)其抗氧化活性和對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)和利用鹿角多肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥材鹿角購(gòu)自吉林省通化市老站人參市場(chǎng)。

1.2 試劑

BY0258 Trypsin胰蛋白酶1∶250（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；NA0332 BSA V牛血清白蛋白 （合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；ST6700 TPTZ（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；KC0615 Coomassie brilliant Blue G-250（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

Bio Tek Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海菲特科學(xué)器材有限公司）；ZW-A微量振蕩器 （金壇區(qū)白塔新寶儀器廠）；FA2204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)T6型（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 鹿角蛋白提取

稱取鹿角100g，用手提式多功能藥材粉碎機(jī)將原料粉碎，過(guò)120目篩，得到鹿角粉末.稱取鹿角粉末20g， 分別加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mol/L的NaOH和蒸餾水，在50℃恒溫水浴中加熱90min，使蛋白充分溶出，冷卻至室溫后，5000r/min離心10min，所得上清液即為鹿角蛋白提取液。取上清液用0.6 mol/L HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5使蛋白沉淀，5000r/min離心10min，收集沉淀，調(diào)pH值至7.0，經(jīng)真空冷凍干燥后，即得鹿角蛋白。

2.1.2 鹿角蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，具體方法見參考文獻(xiàn)[5]。

2.1.3 鹿角多肽制備

取100mg/ml鹿角蛋白溶液60ml，加入1000U/g胰蛋白酶，在45℃恒溫水浴下分別反應(yīng)2、3、4、5和6h后，100℃條件下水浴5min，消除酶活性，每一處理重復(fù)3次。

2.1.4 鹿角多肽活性測(cè)定

采用FRAP法對(duì)得到多肽抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，酪氨酸酶抑制活性測(cè)定參照裴世春[6]等方法進(jìn)行測(cè)定。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 不同濃度NaOH對(duì)鹿角蛋白提取的影響

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-9]，擇優(yōu)選擇料液比1∶10、50℃恒溫水浴90min，考察不同濃度NaOH對(duì)鹿角蛋白提取影響，結(jié)果見圖1。從圖1可知，當(dāng)氫氧化鈉濃度由開始的0mol·L-1逐漸增加到1.0mol·L-1時(shí)，蛋白質(zhì)含量逐漸增加，但總體增長(zhǎng)緩慢，但當(dāng)氫氧化鈉濃度由1.0mol·L-1增加到1.5mol·L-1時(shí)蛋白質(zhì)含量得到了極大的提高，而隨著堿濃度的繼續(xù)增長(zhǎng)，蛋白質(zhì)含量增加幅度不大,甚至開始下降。堿濃度在合適范圍內(nèi)增加可以加速鹿角蛋白從鹿角顆粒中的溶出，而過(guò)高濃度亦會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面電荷平衡，影響蛋白質(zhì)分子間相互作用，使得提取液黏度加大，損失大量蛋白質(zhì)，因此選擇堿濃度為1.5mol·L-1時(shí)為鹿角蛋白提取的最適條件之一。

圖1 不同濃度NaOH對(duì)鹿角蛋白提取影響

2.2.2 鹿角多肽FRAP活性檢測(cè)

在蛋白質(zhì)分解為小分子多肽的過(guò)程中，酶解時(shí)間、pH值、底物濃度、溫度、加酶量均對(duì)水解度有著影響，但酶解時(shí)間對(duì)水解影響比其他幾種因素大很多[10]。不同酶解時(shí)間對(duì)鹿角多肽抗氧化活性影響見表1及表2。根據(jù)不同濃度Vc對(duì)照溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖2，得到回歸方程y=4.2293x+0.0698，R2=0.9976，數(shù)值趨近于1，靈敏度高，線性條件好，可靠性強(qiáng)。因此可以將這條曲線作為測(cè)定FRAP抗氧化活性能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法用作本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)鹿角多肽是否含有抗氧化能力以及抗氧化活性能力大小的方法。將不同時(shí)間鹿角多肽樣品所測(cè)得吸光值代入回歸方程可得樣品中抗氧化活性物質(zhì)濃度，即為抗氧化測(cè)定還原當(dāng)量，詳見表1，從表1可知，鹿角多肽具有一定抗氧化能力，且酶解4h時(shí)，抗氧化能力最強(qiáng)。

圖2 Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 鹿角多肽抗氧化活性FRAP測(cè)定

表2 鹿角蛋白不同酶解時(shí)間抗氧化活性

2.3 鹿角多肽對(duì)酪氨酸抑制酶活性影響

酪氨酸酶是黑色素形成的關(guān)鍵酶，抑制酪氨酸酶活性在一定程度上可減少黑色素的合成，阻止色素沉著從而達(dá)到美白作用。利用體外酶活性檢測(cè)方法對(duì)胰蛋白酶酶解時(shí)間得到鹿角多肽活性進(jìn)行分析，鹿角多肽對(duì)酪氨酸酶有一定的抑制作用，詳見表2，且質(zhì)量濃度在50～200μg·mL-1時(shí)，對(duì)酪氨酸酶的抑制作用呈一定的劑量效關(guān)系，隨質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用增強(qiáng)，最高抑制率可達(dá)131.78酪氨酸UmoL·L-1，說(shuō)明鹿角多肽具有良好的美白效果.此結(jié)果可為利用鹿角多肽開發(fā)化妝品提供基礎(chǔ)性試驗(yàn)數(shù)據(jù).

表2 鹿角多肽對(duì)酪氨酸酶抑制活性研究

3 討論

研究表明，多肽影響著生物體內(nèi)許多重要的生理功能，目前已知有100多種內(nèi)源性生物活性肽參與人體多種生理功能，包括生命活動(dòng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞分化、激素地質(zhì)調(diào)節(jié)、腫瘤病變改善、免疫調(diào)節(jié)、新陳代謝及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)。此外，多肽還具有抵抗細(xì)菌和病毒、提高免疫能力、降血壓、降血脂、抗氧化、抗癌、抗衰老等。由于生物活性肽具備非常好的生理活性與調(diào)節(jié)功能，于是成為了現(xiàn)代科研人員的重點(diǎn)研究對(duì)象。但是伴隨著生物活性肽在現(xiàn)代保健醫(yī)療中廣泛應(yīng)用，如何制備高產(chǎn)率、高活性的生物活性肽成為一大生物難題。

本研究采用堿溶酸成法對(duì)鹿角蛋白進(jìn)行提取，并利用胰蛋白酶對(duì)所得鹿角蛋白進(jìn)行水解得到多肽，抗氧化和酪氨酸水解酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用1.5moL·L-1NaOH在pH8.5時(shí)，蛋白提取率最高，達(dá)0.3913mg/g，1∶2500胰蛋白酶水解4h得到多肽活性抗氧化活性較高，并且表現(xiàn)出一定的酪氨酸酶抑制活性。

近年來(lái)，多肽作為治療藥物已越來(lái)越受到關(guān)注。超過(guò)60只多肽藥物已經(jīng)獲得批準(zhǔn)上市，并使患者受益，同時(shí)還有幾百個(gè)新的治療肽處于臨床前和臨床開發(fā)中。多肽藥物具有巨大的商業(yè)價(jià)值。本研究通過(guò)考察鹿角多肽抗氧化及對(duì)酪氨酸酶活性抑制的影響，為鹿角多肽進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。未來(lái)，我們將繼續(xù)建立在天然肽的優(yōu)勢(shì)上，擴(kuò)大肽的適用范圍。