鄭凌琦 黃文玲 劉艷霞 徐彩

在有生育需求的高齡女性中，因卵巢衰老而出現(xiàn)的卵細(xì)胞質(zhì)量下降是導(dǎo)致不孕及輔助生殖技術(shù)失敗的主要原因。臨床上，對高發(fā)育潛能、高受精能力、高胚胎發(fā)育能力的高質(zhì)量卵母細(xì)胞的要求日益增加。面對高齡女性助孕需求，如何防治卵巢衰老、保護(hù)卵巢功能、改善生育能力成為了生殖醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)問題，也是其治療的重點(diǎn)難點(diǎn)。已有大量臨床研究證明，中醫(yī)治療卵巢衰老相關(guān)疾病能取得良好的治療效果，甚至恢復(fù)生育功能[1]，且中醫(yī)藥在輔助生殖技術(shù)中改善卵巢功能的作用逐漸被醫(yī)學(xué)界認(rèn)可。本研究采用未成熟卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation, IVM)技術(shù)，探討烏萸湯對體外培養(yǎng)的高齡小鼠卵母細(xì)胞能量代謝相關(guān)影響，進(jìn)而證實(shí)烏萸湯促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6J小鼠，雌性6周齡20只，體質(zhì)量(18.5±0.6) g,24周齡60只，體質(zhì)量(28.8±1.3) g；SPF級SD大鼠，雄性6周齡6只，體質(zhì)量(150±20) g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。以上動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動物屏障系統(tǒng)內(nèi)，SPF環(huán)境，12小時/12小時，動物自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物、儀器與試劑

烏萸湯藥物組成：山茱萸10 g、烏藥10 g、菟絲子15 g、丹參10 g、雞血藤15 g、肉蓯蓉10 g、香附10 g，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房提供，康仁堂藥業(yè)生產(chǎn)。

超凈工作臺(蘇州凈化SW-CJ-1FD，中國)，CO2培養(yǎng)箱(SANYO XD-101，日本)，生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51，德國)，體式顯微鏡(世紀(jì)科信，中國)，臺式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，80-2，中國)，低溫離心機(jī)(Sigma，3-30K，德國)，酶標(biāo)儀(Thermo，MULTISKAN MK3)，熒光顯微鏡(OLYMPUS-IX51，德國)，PVDF膜(0.45μm，Millipore，IPVH00010)，電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司，BG-subMIDI)，SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(BIO-Rad，美國)，脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司，TS-100)。

山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物(上海陶素生物科技，登記號：131189-57-6)，孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(寧波三生生物科技有限公司，批號：S200808)，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)(寧波三生生物科技有限公司，批號：B200805)，M2培養(yǎng)基(Sigma，貨號：M7167)，石蠟油(Sigma，貨號：M8410)，羊抗兔-HRP(博奧森，貨號：bs-0295G-HRP)，β-actin(proteintech，貨號：20536-1-AP)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPKα)(CST，貨號：5831)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPKα)(CST，貨號：2535)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)(GeneTex，貨號：GTX31921)，蛋白marker(Thermo，貨號：26617)。三磷酸腺苷ATP檢測試劑盒(Sigma，貨號：MAK190)，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒(碧云天，貨號：S0101)，活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(普利萊，貨號：C1300-1)，Mito-Tracker Green熒光探針標(biāo)記線粒體染色(碧云天，貨號：C1048)，JC-1線粒體膜電位熒光探針(索萊寶，貨號：J8030)。

1.3 含藥血清制備

取雄性6周齡SD大鼠6只，烏萸湯連續(xù)灌胃7天，據(jù)李玲等[2]前期實(shí)驗(yàn)最優(yōu)效劑量，灌胃藥物按原藥材濃度4.8 g/mL配制，每日灌胃1 mL/100 g藥液，于第7天灌胃后1小時腹主動脈取血，3000 rpm離心15分鐘，分離血清，將同組血清混勻，以0.22 μm濾器抽濾除菌，56℃滅活，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 原代細(xì)胞提取

(1)培養(yǎng)液解凍24小時以上，配置M2培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含藥培養(yǎng)基用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將藥物稀釋至烏萸湯含藥血清10%、山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物20 mg/L，分別稱為烏萸湯培養(yǎng)基、山茱萸提取物培養(yǎng)基。

(2)在培養(yǎng)皿中做好清洗液滴(M2培養(yǎng)液)，培養(yǎng)液滴(基礎(chǔ)培養(yǎng)基、烏萸湯組培養(yǎng)基、山茱萸提取物組培養(yǎng)基)，每滴20 μL，覆蓋2 mL石蠟油后置于37℃、 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱平衡過夜。

(3)雌性清潔級C57BL/6J小鼠6、24周齡分別腹腔注射10 IU PMSG，間隔48 小時后再注射10 IU HCG，16小時后頸椎脫臼處死小鼠，在超凈臺中取出卵巢，轉(zhuǎn)移至體式顯微鏡下用注射器針頭將其扎破，待內(nèi)含物溢出后挑取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocytes complex, COCs)，整個過程于15分鐘內(nèi)完成。

(4) 將所取得COCs置于預(yù)先平衡的培養(yǎng)液滴中清洗2～3次，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，控制每個液滴培養(yǎng)的COCs數(shù)量為10個，每個培養(yǎng)皿有10個含卵母細(xì)胞培養(yǎng)液滴。

1.5 細(xì)胞分組及培養(yǎng)

細(xì)胞共分為4個組：青年組：6周齡小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；高齡組：24周齡小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；烏萸湯組：24周齡小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)于烏萸湯組培養(yǎng)基中；山茱萸提取物組：24周齡小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)于山茱萸提取物組培養(yǎng)基中。

1.6 各觀察指標(biāo)檢測方法

各組以放進(jìn)培養(yǎng)箱為0小時，培養(yǎng)24小時后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)觀察檢測。

1.6.1 卵母細(xì)胞第一極體排出率 培養(yǎng)24小時后，隨機(jī)選取20個細(xì)胞觀察卵母細(xì)胞是否排出第一極體，第一極體排出率=排出第一極體的細(xì)胞數(shù)/總觀察細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.2 卵母細(xì)胞ATP含量檢測 采用熒光檢測/比色的方法進(jìn)行ATP濃度檢測，各組收集20個培養(yǎng)液滴的卵母細(xì)胞，按照說明書進(jìn)行檢測。每組細(xì)胞置于96孔板不同孔中，用50 μL裂解液裂解細(xì)胞；另取0、2、4、6、8、10 μL的1 mmol標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板，最終每孔ATP含量為0、2、4、6、8、10 nmol，用水補(bǔ)齊至50 μL；每孔加50 μL反應(yīng)液，混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；測570 nm處吸光度。去掉背景干擾值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每組卵母細(xì)胞的ATP濃度。

1.6.3 卵母細(xì)胞線粒體含量測定 利用熒光顯微鏡觀察Mito-Tracker Green熒光探針標(biāo)記線粒體，按照說明書進(jìn)行。取1 mmol/L儲存液按照1∶5000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，最終濃度為200 nmol；各組收集20個培養(yǎng)液滴，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入使用前37℃預(yù)溫育染色工作液，與細(xì)胞37℃共孵育15分鐘；去除工作液，加入37℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；熒光顯微鏡觀察拍照，根據(jù)其綠色熒光強(qiáng)度大小，反映卵母細(xì)胞線粒體含量高低。

1.6.4 線粒體膜電位變化檢測 采用JC-1熒光探針法觀察線粒體膜電位的變化。每組收集20個培養(yǎng)液滴并吸除培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌后加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液、JC-1染色工作液，充分混勻；細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘；吸除上清，用PBS洗滌2次；再加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光拍照觀察，測定紅色熒光和綠色熒光的比值作為線粒體膜電位的變化值。

1.6.5 卵母細(xì)胞SOD酶活性檢測 采用WST-8法檢測卵母細(xì)胞SOD酶含量，按照說明書指示進(jìn)行。各組收集20個培養(yǎng)液滴中的卵母細(xì)胞，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌1～2遍，沉淀后在4℃或冰浴進(jìn)行勻漿，勻漿液4 ℃離心，取上清作為待測樣品；96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔，依次加入待測樣品、SOD檢測緩沖液、WST-8/酶工作液、反應(yīng)啟動工作液，混勻后在37℃孵育30分鐘；在450 nm處測定吸光度。根據(jù)試劑盒所述方法計(jì)算SOD酶活力單位。

1.6.6 卵母細(xì)胞ROS檢測 利用DCFH-DA探針法檢測卵母細(xì)胞ROS含量，操作步驟按說明書指示。各組收集20個培養(yǎng)液滴，去除細(xì)胞培養(yǎng)基上清，加入用無血清培養(yǎng)液稀釋好的探針(探針終濃度為10 μmol)37℃孵育細(xì)胞30分鐘；棄去上層培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液或0.01 mol PBS反復(fù)吹打，使細(xì)胞層全部進(jìn)入PBS或培養(yǎng)液中；收集細(xì)胞懸液，用0.01 mol PBS或無血清培養(yǎng)液洗滌2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，1000 rpm離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞，熒光拍照觀察。熒光強(qiáng)度大小反映卵母細(xì)胞線粒體含量高低。

1.6.7 卵母細(xì)胞AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白的表達(dá) 為了了解線粒體的功能，檢測ATP產(chǎn)生相關(guān)的AMPKα、p-AMPKα、PCG-1α蛋白的表達(dá)，采用Western Blot法測定蛋白含量。在4℃下將已加入裂解液的卵母細(xì)胞，12000 rpm離心10分鐘，取上清液，BCA法蛋白定量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為50 μg蛋白；以每塊膠80 V濃縮膠，120 V分離膠，恒壓電泳，當(dāng)目的蛋白處于分離膠面的下1/3的最佳分辨位置時停止電泳分離；4℃、110 V/120 mA恒流濕轉(zhuǎn)；將剪切好的PVDF膜放到甲醇中浸泡10秒，室溫?fù)u床封閉2小時，然后分別加入稀釋后一抗AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α及β-actin，4℃孵育過夜轉(zhuǎn)膜；洗去多余一抗，加入稀釋HRP，37℃搖床孵育1小時；洗去多余二抗后顯色曝光，使用Image J軟件分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 第一極體排出率

青年組排出率為65%(13/20)，高齡組排出率為15%(3/20)，烏萸湯組排出率為45%(9/20)，山茱萸提取物組排出率為35%(7/20)。青年組第一極體排出率高于其他各組，烏萸湯組和山茱萸提取物組高于高齡組，且烏萸湯組較山茱萸提取物組略高。見表1。

表1 各組小鼠卵母細(xì)胞第一極體排出率

2.2 ATP含量

與青年組相比，高齡組、山茱萸提取物組ATP含量明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但烏萸湯組和青年組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與高齡組相比，烏萸湯組和山茱萸提取物組含量有所升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠卵母細(xì)胞ATP含量

2.3 卵母細(xì)胞線粒體熒光染色定位標(biāo)記、線粒體膜電位變化

Mito-Tracker Green熒光探針標(biāo)記線粒體(圖1)，測定各樣本熒光強(qiáng)度，分析可知高齡組線粒體數(shù)量明顯低于青年組(P<0.05)，烏萸湯組、山茱萸提取物組線粒體數(shù)量明顯高于青年組和高齡組(P<0.05)。

注：Mito-Tracker Green將線粒體綠染，Hochest將活細(xì)胞藍(lán)染。

各組線粒體膜電位變化檢測(圖2)可知，高齡組膜電位變化弱于青年組(P<0.05)，但烏萸湯組、山茱萸提取物組與青年組、高齡組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

注：線粒體膜電位較低時顯示為綠色熒光，線粒體膜電位較高時顯示為橙紅色熒光。

表3 各組小鼠卵母細(xì)胞線粒體含量、膜電位比較

2.4 卵母細(xì)胞SOD酶活性、ROS含量

各組卵母細(xì)胞SOD酶活性比較發(fā)現(xiàn)，高齡組、烏萸湯組、山茱萸提取物組比青年組明顯降低(P<0.05)，烏萸湯組和山茱萸提取物組比高齡組有所升高(P<0.05)。

各組卵母細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度比較發(fā)現(xiàn)，高齡組、烏萸湯組、山茱萸提取物組比青年組明顯升高(P<0.05)，但烏萸湯組、山茱萸提取物組和高齡組之間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠卵母細(xì)胞SOD活性、ROS含量熒光強(qiáng)度比較

2.5 卵母細(xì)胞AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達(dá)

與青年組比較，高齡組AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，烏萸湯組p-AMPKα蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與高齡組比較，烏萸湯組AMPKα、PGC-1α均有所升高(P<0.05)，山茱萸提取物組p-AMPKα有明顯升高(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組卵母細(xì)胞AMPKα、p-AMPKα、p-AMPKα/AMPKα、PGC-1α蛋白表達(dá)的比較

圖3 各組小鼠卵母細(xì)胞AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達(dá)

3 討論

數(shù)十年來，生育年齡的推遲成為全球趨勢，加之“二孩政策”開放，有生育要求的高齡女性越來越多[3-4]。高齡女性的卵巢功能下降，常表現(xiàn)為月經(jīng)周期紊亂、對卵巢刺激反應(yīng)欠佳、高流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)甚至不孕[5]。面對日益增加的高齡女性助孕需求，如何改善卵巢功能受到了生殖醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。卵巢功能下降，其實(shí)質(zhì)為女性年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞數(shù)量減少和質(zhì)量下降。卵巢是最容易受到年齡影響的器官之一，加上社會心理因素、醫(yī)源病理因素、行為學(xué)因素、環(huán)境污染等因素的影響[6]，卵母細(xì)胞出現(xiàn)某些基因突變、卵巢組織的端粒酶活性異常，氧化應(yīng)激狀態(tài)中酶活性下降、線粒體結(jié)構(gòu)功能異常、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變等，進(jìn)而干擾卵細(xì)胞的正常發(fā)育，加重卵巢衰老[7-10]。最新研究表明，線粒體功能對調(diào)控卵泡閉鎖和卵細(xì)胞質(zhì)量起著決定性作用[11-12]。

線粒體能夠通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP和少量ROS，是細(xì)胞一系列正常生理活動提供能量的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的數(shù)量及功能能夠反映細(xì)胞的生理狀態(tài)[13]。AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，其下游分子PGC-1α主要調(diào)控線粒體增生，對于維持線粒體數(shù)量具有重大意義。而膜電位的穩(wěn)定給線粒體提供了正常的生理環(huán)境，是線粒體功能實(shí)現(xiàn)的前提[14]。 由于ROS能改變線粒體通透性，所以少量的ROS對于細(xì)胞正常生理功能和細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)具有重要作用，但高濃度的ROS就會誘發(fā)氧化應(yīng)激，損傷線粒體DNA，造成線粒體DNA突變或缺失，ATP生成減少，線粒體膜上離子交換通道破壞，膜電位消失等，導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化[15]。SOD是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，可以清除ROS，故ROS含量及SOD活性也是評價(jià)生物體能量代謝的指標(biāo)之一[16]。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，隨著小鼠年齡增大，卵母細(xì)胞線粒體數(shù)目減少、膜電位變化減弱，產(chǎn)生的ATP減少、ROS增加，SOD酶活性降低，AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達(dá)降低。在此過程中，SOD酶活性降低不能清除線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的多余ROS，線粒體膜電位異常，且AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達(dá)降低影響了線粒體增生。線粒體損傷嚴(yán)重、增生受阻，破壞了線粒體穩(wěn)態(tài)，線粒體產(chǎn)生的ATP減少不能供給正常的細(xì)胞代謝所需，最終導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝下降、氧化應(yīng)激狀態(tài)減弱，卵母細(xì)胞成熟受阻，第一極體排出障礙。

中醫(yī)認(rèn)為腎虛肝郁是卵巢功能下降的基本病機(jī)。由于現(xiàn)代女性生活、工作壓力較大，生育之心不遂，久而致郁，肝郁氣滯，日久成瘀，血瘀為實(shí)，阻塞胞宮胞絡(luò)。腎精是產(chǎn)生月經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，精血同源，腎精不足，精虧血少，則沖任血虛，胞宮胞脈失養(yǎng)，故經(jīng)水難下，胎孕難成，治宜補(bǔ)腎調(diào)肝。據(jù)此，國家級名老中醫(yī)金哲教授自擬經(jīng)驗(yàn)方烏萸湯。方中山茱萸溫能通行、辛能走散、酸能入肝，烏藥溫腎散寒，能夠補(bǔ)益肝腎，以益其源，共為君藥。菟絲子、肉蓯蓉溫腎益精，取陽中求陰，陰得陽生之意，共為臣藥；佐以丹參、雞血藤養(yǎng)血活血，香附疏肝理氣開郁。諸藥共用補(bǔ)腎以助先天、調(diào)肝以暢氣血，共奏補(bǔ)腎調(diào)肝之效而達(dá)調(diào)經(jīng)種子目的。

本課題組前期研究顯示，烏萸湯可提高卵巢不敏感綜合征模型小鼠血清雌激素水平，降低促卵泡生成素、促黃體生成素水平，上調(diào)卵巢抑制素B及卵泡抑素水平，下調(diào)激活素水平，有效改善卵巢功能[17-18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與高齡組相比，烏萸湯組小鼠卵母細(xì)胞第一極體排出率增加、線粒體數(shù)量增多、ATP含量上升、SOD酶活性增強(qiáng)，p-AMPKα、AMPKα及PGC-1α蛋白表達(dá)量增加，說明了烏萸湯能夠通過改善卵母細(xì)胞線粒體能量代謝及氧化應(yīng)激反應(yīng)提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。

此外，目前關(guān)于卵母細(xì)胞的線粒體研究主要集中在動物層面，即治療后取卵，但控制性超促排卵的使用使得多胎妊娠和卵巢過度刺激綜合癥的發(fā)病率明顯上升[19]。為了避免此類醫(yī)源性并發(fā)癥的發(fā)生，部分學(xué)者主張采用IVM技術(shù)為卵泡發(fā)育異常的患者提供治療途徑[20]。本實(shí)驗(yàn)采用取卵后治療的方式，將IVM技術(shù)運(yùn)用在卵細(xì)胞體外培養(yǎng)當(dāng)中。

綜上，本實(shí)驗(yàn)在IVM技術(shù)基礎(chǔ)上，證實(shí)了烏萸湯能夠通過影響高齡小鼠卵母細(xì)胞的線粒體功能，改善其能量代謝和氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，可作為烏萸湯應(yīng)用于IVM技術(shù)中提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。