王麗琴 孫逸坤 王曉峰 李媛媛 宋珂 劉浩琦 常靜玲 高永紅

《全球疾病，傷害和危險因素負(fù)擔(dān)研究》表明2016年全球有8000萬中風(fēng)病例，死亡550萬[1]。在我國，腦卒中患者中腦出血占28.2%[2]。血腦屏障是位于腦組織與外周血液循環(huán)之間的復(fù)雜細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起到重要作用[3]。血腦屏障破壞是出血性中風(fēng)的突出病理特征[4]。腦出血后會導(dǎo)致血腦屏障通透性增加以及功能障礙，其功能障礙引起的原發(fā)性損傷可能會破壞緊密連接及內(nèi)皮細(xì)胞等的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致潛在的神經(jīng)毒性和血管活性化合物進(jìn)入大腦，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[5-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，醒腦靜注射液在治療急性腦出血方面具有降壓，維持水和電解質(zhì)平衡，緩解炎癥反應(yīng)，神經(jīng)保護(hù)等作用[7-8]。本研究采用膠原酶誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型，結(jié)合病理、分子生物學(xué)等方法觀察大鼠腦出血腦組織超微結(jié)構(gòu)的改變及相應(yīng)的病理變化，觀察并檢測腦出血后腦組織中血腦屏障的結(jié)構(gòu)變化及相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討醒腦靜注射液減輕腦出血后繼發(fā)性損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)中所用無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級健康雄性SD大鼠27只，體質(zhì)量(270±20) g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。SD大鼠飼養(yǎng)于東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK(京)2015-0001，大鼠分籠飼養(yǎng)并給予充分食水。

1.2 主要試劑與儀器

醒腦靜注射液(10 mL/支)：無錫濟(jì)民可信山河藥業(yè)股份有限公司(貨號151107)；膠原酶VII：Sigma公司(貨號C0773)；伊文思藍(lán)(Evens blue, EB)：Solarbio公司; 二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白分子量marker、山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物酶Goat anti-Rabbit IgG(immunoglobulin G，IgG)(H+L)HRP(horseradish peroxidase，HRP)、山羊抗小鼠免疫球蛋白G辣根過氧化物酶 Goat anti-mouse IgG(H+L)HRP：PPLYGEN公司。水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)、閉合蛋白(Occludin)一抗：Abcam公司；緊密連接蛋白(tight junction protein,ZO-1)一抗：Invitrogen公司；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)一抗：Proteintech公司。

數(shù)字腦立體定向儀：美國AST公司；微量注射泵：美國HARVARD公司；微量注射器：美國Hamilton公司；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；透射電子顯微鏡：日本Hitachi公司；電泳儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰(SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳系統(tǒng)、ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；自動脫水、包埋機(jī)、石蠟組織切片機(jī)：德國Leica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物造模、分組及給藥

參考文獻(xiàn)[9]所述方法，隨機(jī)選取9只SD大鼠為假手術(shù)組，其余18只大鼠采用VII型膠原酶注射入尾狀核的方法來制備大鼠腦出血模型。大鼠術(shù)前禁食不禁水過夜，稱重麻醉后剃去顱頂毛發(fā)，固定于立體定向儀并調(diào)整至前后囟在同一水平面上，于顱頂正中行切口，充分暴露頭骨，以前囟為原點(diǎn)，右側(cè)旁開3.0 mm，向前0.5 mm(尾狀核定位點(diǎn))行顱骨鉆孔。于微量注射器中吸取1 μL(0.1 u/μL)VII型膠原酶，將微量注射器固定于立體定位儀上，于鉆孔處緩慢進(jìn)針，其深度為5.5 mm，注射速度為200 nL/分鐘，5分鐘完成注射，留針10分鐘后將針退出并使用骨蠟封閉顱骨鉆孔并縫合、消毒。假手術(shù)組只行鉆孔及進(jìn)針。術(shù)后2小時動物清醒后采用改良的神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度(modified neurologic severity scores，mNSS)評分標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評分為7～12分的大鼠視為模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)中造模大鼠及假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)死亡。

將造模成功的SD大鼠納入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為醒腦靜組和模型組，每組9只。醒腦靜組行腹腔注射醒腦靜注射液0.18 mL/100 g，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。每隔24小時給藥一次，連續(xù)給藥3天。

1.4 EB檢測血腦屏障通透性

給藥3天后，將假手術(shù)組、模型組、醒腦靜組大鼠(每組1只)麻醉后剪開腹股溝部位皮膚，暴露股動脈，注射2%的EB染液(2 mL/kg)，經(jīng)血液循環(huán)2小時后可見大鼠全身皮膚及黏膜轉(zhuǎn)為藍(lán)色。將大鼠固定于鼠板，開胸使其心臟暴露，經(jīng)左心室插入灌流針直至主動脈弓，使用止血鉗固定灌流針，剪開右心耳，夾閉腹主動脈，灌注無菌生理鹽水約200 mL，至肝臟和肺臟轉(zhuǎn)為白色，然后灌注4%多聚甲醛直至腦組織固定，取出腦組織浸泡于4%多聚甲醛中，48小時后切片拍照。

1.5 透射電鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫

每組選取3只大鼠按上述灌流方法灌流后開顱取腦，于出血灶周圍取1 mm3大小的組織塊放入2.5%戊二醛電鏡固定液中固定2小時，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗3次，二甲砷酸鈉緩沖液沖洗后包埋，超薄切片機(jī)切片，經(jīng)鈾染、鉛染后，使用透射電鏡觀察各組腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體和周邊結(jié)構(gòu)變化及血管周圍水腫情況。采用Image pro plus 6.0軟件分析星形細(xì)胞足突水腫面積，每只大鼠腦組織切片隨機(jī)選取15個視野取均值計(jì)算。

1.6 免疫組化檢測AQP4的表達(dá)

大鼠灌流取腦后，將腦組織進(jìn)行石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟至水化，間接水浴鍋加熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，使用0.3% Triton孵育10分鐘后PBS沖洗，10%山羊血清37℃孵育30分鐘，加入AQP4一抗后于4℃冰箱過夜，復(fù)溫30分鐘，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，使用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測血腦屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)

每組選取5只大鼠麻醉后斷頭取腦，取血腫周邊2 mm3腦組織置于凍存管中，于液氮中保存?zhèn)溆?。加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑，超聲勻漿提取各組大鼠腦組織蛋白，離心15分鐘(4℃，12000 rpm)，取上清后使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并定量為同一濃度，煮沸20分鐘后備用。煮好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，分別利用相應(yīng)的抗體(β-actin、AQP4、VEGF、Occludin、ZO-1)進(jìn)行孵育并于4℃環(huán)境過夜，Tris緩沖鹽吐溫(Tris Buffered saline Tween，TBST)漂洗，加入二抗孵育1小時，TBST洗膜3次，將PVDF膜浸泡于電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯色液中1分鐘，暗室中曝光、顯影，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 醒腦靜對腦出血大鼠腦組織血腦屏障的通透性的影響

假手術(shù)組大鼠腦切片皮質(zhì)及白質(zhì)均未見EB染色，表明無血腦屏障的滲漏。而模型組、醒腦靜組在出血灶周邊可見不同程度的藍(lán)染，血腦屏障的EB滲透量均有不同程度改變。醒腦靜組出血灶周邊藍(lán)染程度與模型組相比較輕，血腦屏障的滲漏程度少于模型組。見圖1。

圖1 醒腦靜注射液對大鼠血腦屏障滲漏程度的影響(EB染色)

2.2 醒腦靜對腦出血大鼠腦水腫的影響

2.2.1 醒腦靜改善腦出血大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫 為了進(jìn)一步明確醒腦靜改善腦水腫保護(hù)血腦屏障的機(jī)制，采用透射電鏡觀察并分析星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫面積。結(jié)果顯示，假手術(shù)組血管基膜連續(xù)，形態(tài)規(guī)則且表面光滑，內(nèi)皮胞質(zhì)厚度均一，血管周圍電子密度分布均勻；腦出血后3天，模型組組織稀疏，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則，局部膨出，部分與基膜剝離，血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫明顯，血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞，通透性增加。醒腦靜組血管周圍有局部水腫，而其水腫面積明顯低于模型組，損傷程度明顯減輕(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫程度比較

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.醒腦靜組。

2.2.2 醒腦靜降低腦出血大鼠腦組織AQP4和VEGF蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，模型組AQP4蛋白表達(dá)量高于假手術(shù)組，醒腦靜組AQP4蛋白表達(dá)量則低于模型組。Western blot的結(jié)果顯示，模型組AQP4和VEGF蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增高(P<0.05)；醒腦靜組表達(dá)量相比模型組明顯下降(P<0.05)。見圖3～4、表2。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.醒腦靜組。

圖4 Western blot檢測腦出血大鼠腦組織中AQP4、VEGF的表達(dá)

表2 各組大鼠腦組織中AQP4、VEGF的蛋白表達(dá)比較

2.3 醒腦靜對腦出血大鼠腦組織中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot的結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05)，醒腦靜組Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)較模型組增加(P<0.05)。見圖5、表3。

表3 各組大鼠腦組織中Occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)比較

圖5 Western blot檢測腦出血大鼠腦組織中Occludin、ZO-1的表達(dá)

3 討論

中醫(yī)理論中腦出血屬于中風(fēng)范疇，其基本病機(jī)為氣血逆亂致血溢腦脈之外。臟腑功能失調(diào)，內(nèi)生風(fēng)邪、火邪，灼脈絡(luò)，迫血行，血溢脈外而發(fā)為腦出血[11-12]。絡(luò)脈作為經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的分支，對于維持人體正常的生命活動具有十分重要的意義[13]。腦絡(luò)是絡(luò)脈的一部分，相當(dāng)于大腦中的“微循環(huán)”，是腦中氣血津液交換的場所[14]。腦絡(luò)灌注氣血津液充實(shí)腦髓，散布陽氣以溫煦腦神，是神機(jī)運(yùn)動的物質(zhì)基礎(chǔ)和源動力[15]。血腦屏障由顱內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和基質(zhì)構(gòu)成，可維持離子平衡、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，阻止有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織[16]。腦出血后，由血紅蛋白裂解釋放的有毒物質(zhì)以及氧化應(yīng)激和炎性浸潤等病理變化直接破壞血腦屏障、緊密連接，改變相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，致使血腦屏障功能障礙，從而導(dǎo)致血管性水腫，水通道蛋白表達(dá)增加，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[4,17-18]。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能上，血腦屏障和腦絡(luò)具有一定的相似性。

醒腦靜具有醒腦開竅通絡(luò)的作用，其主要成分包括梔子、冰片、郁金、麝香。其中麝香氣味芳香，善于走竄，散瘀通絡(luò)，能通諸竅不利，開經(jīng)絡(luò)之壅滯；冰片專于瀉火毒,辛香走竄，助麝香通諸竅，二者協(xié)同發(fā)揮開竅醒腦的作用；郁金性苦寒，化痰開郁，協(xié)同麝香、冰片二藥開竅通絡(luò)；梔子性味苦寒，清理三焦之火，解痰瘀所化生之毒邪。上述諸藥共同起到化痰通絡(luò)、涼血解毒之功[19-20]。常見的腦出血模型建立為膠原酶誘導(dǎo)模型和自體血模型兩種方法[21]。其中膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型中血腫的形成與人腦內(nèi)血管破裂所引起的腦出血情況相似，可以較好地模擬患者腦出血急性期腦內(nèi)血腫擴(kuò)大的病理過程，尤其適用于研究腦出血繼發(fā)性損傷的機(jī)制和藥物對神經(jīng)功能影響的作用機(jī)制[22]。因此，本研究選用該模型探討醒腦靜注射液對腦出血后繼發(fā)性腦損傷的治療效果與機(jī)制，結(jié)果表明醒腦靜能夠降低EB的通透性，改善血腦屏障功能。

星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的AQP4、鉀離子通道可以穩(wěn)定腦內(nèi)水和離子的平衡，其衍生因子VEGF可通過調(diào)節(jié)緊密連接影響血腦屏障完整性和通透性，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞血腦屏障[23-24]。AQP4參與維持血腦屏障通透性完整性和發(fā)育過程[3]。VEGF在腦組織持續(xù)或嚴(yán)重缺氧時其表達(dá)量急劇升高可以加重腦損傷。研究表明腦出血后AQP4、VEGF表達(dá)均顯著增加，通過抑制二者的表達(dá)可有效減輕腦水腫及神經(jīng)功能損傷[25-26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦出血后3天模型組星形細(xì)胞足突水腫嚴(yán)重，模型組大鼠AQP4、VEGF表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組；醒腦靜組足突水腫程度、AQP4和VEGF的蛋白表達(dá)量明顯低于模型組，表明醒腦靜能夠調(diào)節(jié)AQP4、VEGF的表達(dá)，具有減輕腦水腫、保護(hù)神經(jīng)功能的損傷的作用。

緊密連接是維持血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[27]。Occludin被認(rèn)為是血腦屏障中一種重要的緊密連接構(gòu)建蛋白，有助于細(xì)胞生長和分化，改變細(xì)胞間的通透性。ZO-1在保持血腦屏障完整性方面起著重要作用[28]。當(dāng)ZO-1功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化后，緊密連接遭到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞間縫隙增加，進(jìn)而血管通透性增加，隨后發(fā)生血管源性水腫[27,29]。研究發(fā)現(xiàn)腦出血后血腫周邊的血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)均下降，這可能導(dǎo)致血腦屏障緊密連接的破壞[30]，通過增加緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達(dá)可減輕缺血性腦卒中大鼠腦水腫[31]。本研究中，腦出血模型組大鼠腦組織Occludin和ZO-1的表達(dá)量均顯著低于假手術(shù)組，表明模型組大鼠血腦屏障發(fā)生嚴(yán)重破壞。而醒腦靜組大鼠腦組織中Occludin和ZO-1的表達(dá)量均明顯高于模型組，表明醒腦靜能夠調(diào)節(jié)這兩種緊密連接蛋白的表達(dá)，從而保護(hù)血腦屏障的完整性。

綜上所述，本研究建立大鼠腦出血模型，觀察腦出血大鼠腦組織血腦屏障的結(jié)構(gòu)及功能變化，發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液可明顯降低大鼠腦出血腦組織中AQP4、VEGF的表達(dá)，上調(diào)緊密連接蛋白Occludin、ZO-1，降低血腦屏障的通透性，減輕腦水腫。